一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用。本发明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到糯性玉米，所述糯性玉米籽粒中支链淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支链淀粉含量；玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子。采用本发明提供的方法能够实现对玉米的基因编辑，获得糯性玉米，具有很高的育种和栽培价值。

权利要求

1.培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到糯性玉米；所述玉米基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因；

所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码Waxy1蛋白的DNA片段，所述Waxy1蛋白为a1)：a1)的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述玉米基因组编辑的载体还含有Cas9蛋白的编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；

所述sgRNA识别的靶位点为SEQ ID No.2所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA编码基因是SEQ ID No.3的第

10087-10191位所示的DNA分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述b1所示的DNA分子：b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

所述Cas9蛋白的编码基因是下述c1所示的DNA分子：c1)SEQ ID No.3自5’末端起第

12309-16409位所示的DNA分子。

4.一种玉米基因组编辑的载体，含有Cas9蛋白的编码基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；

所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码Waxy1蛋白的DNA片段，所述Waxy1蛋白为a1)：a1)氨基酸序列是SEQ ID No.5所示的蛋白质；所述sgRNA识别的靶位点为SEQ ID No.2所示的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述sgRNA编码基因是SEQ ID No.3的第

10087-10191位所示的DNA分子。

6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述b1)所示的DNA分子：b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

所述Cas9蛋白的编码基因是下述c1所示的DNA分子：c1)SEQ ID No.3自5’末端起第

12309-16409位所示的DNA分子。

7.权利要求4至6中任一所述的载体在培育糯性玉米和/或提高玉米籽粒中支链淀粉含量中的应用。

说明书

一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种定点突变创制糯性玉米种质的方法及其应用。

背景技术

[0002] 玉米是重要的粮食作物和饲料作物，玉米淀粉在人类生活及工业生产中应用广泛，所含的直链淀粉和支链淀粉具有很高的经济价值。由于支链淀粉的理化特性使支链淀粉在食品加工、畜牧养殖、造纸业、纺织业以及粘着剂工业等领域具有较大的应用空间，因此培育糯性玉米对生产及加工具有重要意义。

[0003] 糯性玉米又称蜡质玉米，是指玉米籽粒成熟后胚乳中支链淀粉含量几乎为100％，且胚乳呈角质不透明且无光泽的蜡质状，蒸煮后呈黏性故又称粘玉米。糯性是一个普遍的突变性状，天然糯性突变体在玉米、水稻、大麦、高粱等二倍体中禾谷类作物中非常常见。糯性玉米独特的性状是由受waxy1单基因隐形突变控制的，Sprague等(1943)识别了位于玉米9号染色体短臂的waxy1基因位点，野生型Waxy1基因全长3718bp，由14个外显子和13个内含子构成，编码颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-Bound Starch Synthase，GBSSI)，该酶主要控制玉米胚乳和花粉的直链淀粉合成。如果waxy1基因缺失、表达受阻或GBSSI酶活性降低，将导致胚乳直链淀粉合成受阻，胚乳中直链淀粉含量降低，从而改变淀粉的糊化和膨胀等特性形成具有糯性性状的糯性玉米。目前已经发现超过50个waxy1等位基因，突变位置遍布整个waxy1基因，其中相当一部分是不同的转座子插入相同位置或者相同的转座子插入不同的位置造成的不稳定糯性突变如wx-7、wx-8、wx-9等(klosgen 1986)，还有一些稳定的waxy1突变体是在waxy1基因关键位置发生缺失或插入突变，如wx-D7、wx-D10分别是waxy1第7外显子和第10外显子发生碱基缺失导致突变的发生(fan，2008；田孟良2008)。

[0004] CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术。该技术首先设计的一段sgRNA基因，该基因转录的RNA可以通过碱基互补配对识别目标DNA序列，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologous directed repair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologous end-joining)，进而实现目的DNA编辑。基于细菌Ⅱ型免疫机制开发的基因编辑技术在植物特别是作物遗传改良上具有重大的应用前景。该技术的基本要求之一就是受体细胞内表达单分子识别RNA(sgRNA,single guiding RNA)，该分子负责识别特异性的基因编辑位点，然后介导结合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在设计的位点引入DNA双链断裂损伤，通过胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变。因此，sgRNA的表达是该技术的重要组成部分。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何培育糯性玉米。

[0006] 为解决上述问题，本发明首先提供了培育糯性玉米(支链淀粉含量高的玉米)的方法。

[0007] 本发明提供的培育糯性玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到糯性玉米。

[0008] 所述糯性玉米籽粒中支链淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支链淀粉含量。

[0009] 所述玉米基因组编辑的载体含有sgRNA编码基因。

[0010] 所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码Waxy1蛋白的DNA片段，所述Waxy1蛋白可为a1)或a2)：

[0011] a1)氨基酸序列是SEQ ID No.5所示的蛋白质；

[0012] a2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1)衍生的蛋白质。

[0013] 上述方法中，所述玉米基因组编辑的载体还可含有Cas9蛋白的编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录。

[0014] 上述方法中，所述目的玉米可为非糯性玉米品种。

[0015] 所述非糯性玉米品种具体可为玉米自交系CA335。

[0016] 上述方法中，所述Waxy1蛋白是SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，含有564个氨基酸。

[0017] 上述方法中，所述Waxy1蛋白的cDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1的第466-2160位为所述Waxy1蛋白的编码序列。

[0018] 上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点可为SEQ ID No.2所示的DNA分子。

[0019] 上述方法中，所述sgRNA编码基因是SEQ ID No.3的第10087-10191位所示的DNA分子。

[0020] 上述方法中，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmPolⅢca99，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

[0021] b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

[0022] b2)与b1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

[0023] b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

[0024] 上述方法中，所述Cas9蛋白的编码基因是下述c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：

[0025] c1)SEQ ID No.3自5’末端起第12309-16409位所示的DNA分子；

[0026] c2)与c1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的DNA分子；

[0027] c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA序列杂交的DNA分子。

[0028] “所述糯性玉米籽粒中支链淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支链淀粉含量”可体现为糯性玉米籽粒经碘液染色为黄褐色或着色较浅，目的玉米籽粒经碘液染色为深蓝色或偏黑色。

[0029] “所述糯性玉米籽粒中支链淀粉含量高于所述目的玉米籽粒中支链淀粉含量”可体现为糯性玉米籽粒的淀粉粒经碘液染色为黄褐色或着色较浅，目的玉米籽粒的淀粉粒经碘液染色为深蓝色或偏黑色。

[0030] 为解决上述问题，本发明还提供了玉米基因组编辑的载体。

[0031] 本发明所提供的玉米基因组编辑的载体，含有Cas9蛋白的编码基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；

[0032] 所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码Waxy1蛋白的DNA片段，所述Waxy1蛋白为a1)或a2)：

[0033] a1)氨基酸序列是SEQ ID No.5所示的蛋白质；

[0034] a2)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1)衍生的蛋白质。

[0035] 上述载体还包括启动Cas9蛋白的编码基因转录的启动子(如玉米UBI启动子)，终止Cas9蛋白基因转录的终止子(如NOS终止子)，复制子和抗性基因(如卡那霉素抗性基因)。

[0036] 上述玉米基因组编辑的载体中，所述sgRNA识别的靶位点为SEQ ID No.2所示的DNA分子。

[0037] 上述玉米基因组编辑的载体中，所述sgRNA编码基因是SEQ ID No.3的第10087-10191位所示的DNA分子。

[0038] 上述玉米基因组编辑的载体中，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

[0039] b1)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

[0040] b2)与b1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；

[0041] b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

[0042] 上述玉米基因组编辑的载体中，所述Cas9蛋白的编码基因是下述c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：

[0043] c1)SEQ ID No.3自5’末端起第12309-16409位所示的DNA分子；

[0044] c2)与c1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的DNA分子；

[0045] c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA序列杂交的DNA分子。

[0046] 上述玉米基因组编辑的载体具体可为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9，其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。其中，SEQ ID No.3自5’末端起第208-884位所示的核苷酸序列为CaMV 35s增强型启动子，第2188-2982位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因，第4407-4995位所示的核苷酸序列为复制子ori，第9691-10086位所示的核苷酸序列为启动子ZmPolⅢca99，第10087-10191位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因，第10192-12193位所示的核苷酸序列为玉米UBI启动子，第12309-16409位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白的编码基因，第16477-16729位所示的核苷酸序列为NOS终止子。

[0047] 上述玉米基因组编辑的载体在培育糯性玉米和/或提高玉米籽粒中支链淀粉含量中的应用也属于本发明保护的范围。

[0048] 上述应用中，所述玉米具体可为玉米自交系CA335。

[0049] 上述重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9可通过使用农杆菌介导、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

[0050] 实验证明，采用含有重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的重组农杆菌转化玉米植株，能够对Waxy1基因进行编辑，Waxy1基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成Waxy1基因突变，当两条同源染色体的Waxy1基因均发生突变时，可以导致GBSSI酶活性丧失，胚乳直链淀粉合成受阻，胚乳中直链淀粉含量降低，从而改变淀粉的糊化和膨胀等特性形成具有糯性性状的糯性玉米。采用本发明的方法能够实现对玉米的Waxy1基因编辑，获得糯性玉米，具有很高的育种和栽培价值。

附图说明

[0051] 图1为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的结构示意图。

[0052] 图2为阳性T0代转sgRNA基因植株的突变类型。

[0053] 图3为阳性T0代转sgRNA基因植株突变类型的统计图。

[0054] 图4为T1代玉米籽粒碘染色后的表型。

[0055] 图5为从T1代玉米籽粒分离的淀粉粒碘染色后的结果。

具体实施方式

[0056] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

[0057] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0059] pEASY-Blunt Cloning Kit、Trans5α化学感受态细胞、PEASY-blunt simple vector和Trans T1感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司的产品。

[0060] 玉米自交系CA335(Chuanxiao Xie,Shihuang Zhang_,Minshun Li,Xinhai Li,Zhuanfang Hao,Li Bai,Degui Zhang,Yehong Liang.Inferring Genome Ancestry and Estimating Molecular Relatedness Among 187Chinese Maize Inbred Lines.Journal of Genetics and Genomics(Formerly Acta Genetica Sinica).2007,34(8):738_748)公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。玉米自交系CA335为非糯性玉米品种。

[0061] 中糯2号和垦粘1号均为市售，下述实施例中的白糯籽粒即为中糯2号的籽粒。下述实施例中的黄糯籽粒即为垦粘1号的籽粒。

[0062] YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO4·7H2O 0.04g溶于1L去离子水，用10M NaOH水溶液调节pH至7.2，高温高压灭菌20min。

[0063] 实施例1、启动子ZmPolⅢca99的克隆和重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的构建[0064] 一、启动子ZmPolⅢca99的克隆

[0065] 取玉米自交系CA335种子3～4粒，消毒浸种后，将其放入潮湿的石英沙盘中培育，待长出叶片，提取叶片基因组备用。以叶片基因组为模板，利用ZmPolⅢca99-F(5’-AATTGGCCCTTACAAAATAG-3’)和ZmPolⅢca99-R(5’-GGAGCGGTGGTC GCAGCTG-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增片段。将该PCR扩增片段利用pEASY-Blunt Cloning Kit进行亚克隆，得到重组载体。将重组载体转入Trans5α化学感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，扩大培养并测序，测序结果表明重组载体中含有SEQ ID No.4所示的启动子ZmPolⅢca99序列。

[0066] 二、重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9的获得

[0067] 人工合成SEQ ID No.3所示的重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9(环形质粒，载体结构示意图见图1)。其中，SEQ ID No.3自5’末端起第208-884位所示的核苷酸序列为CaMV 35s增强型启动子，第2188-2982位所示的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因，第4407-4995位所示的核苷酸序列为复制子ori，第9691-10086位所示的核苷酸序列为步骤一所述启动子ZmPolⅢca99，第10087-10191位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因，第10192-12193位所示的核苷酸序列为玉米UBI启动子，第12309-16409位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白的编码基因，第16477-16729位所示的核苷酸序列为NOS终止子。

[0068] 实施例2、培育糯性玉米突变株及其验证

[0069] 一、农杆菌侵染液的制备

[0070] 1、将实施例1合成的重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9转化农杆菌EHA105感受态细胞，得到重组农杆菌，命名为EHA105-ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9。

[0071] 2、将EHA105-ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养12～16h，然后按2％-4％(体积百分含量)的比例接种于含乙酰丁香酮100μM的YEB液体培养基，28℃、220rpm振荡培养至OD600值达到0.5左右，得到农杆菌侵染液。

[0072] 二、培育糯性玉米突变株

[0073] 将EHA105-ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9诱导转化玉米自交系CA335幼胚，经过筛选、分化，获得完整的再分化植株。具体步骤如下：

[0074] 1、接种

[0075] 授粉后9～15d内，当玉米自交系CA335幼胚长到1.8～2.2mm时，取果穗，用70％(体积百分比)酒精消毒，每去1层皮用70％酒精棉消毒1次，待完全去皮后，用0.1％的升汞灭菌约10min。再用解剖刀自上而下逐行削去种皮和胚乳，用镊子从子粒中上部挑出幼胚，加入步骤一制备的农杆菌侵染液中，浸泡15～20min，此间要不时的摇动。浸泡完后，弃菌液，用无菌滤纸吸干多余的菌液。将盾片向上置于经高压灭菌盛有诱导培养基(将KN032830mg、NH4SO4463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H20185mg、KH2PO4400mg、FeSO4·7H2027.8mg、ZnSO4·7H201.6mg、MnS04·4H204.4mg、H2BO30.8mg、KI 1.6mg、甘氨酸2mg、烟酸0.5mg、盐酸硫胺素1.0mg、盐酸吡哆素0.5mg、蔗糖30g、琼脂6g、脯氨酸1.38g、水解酪蛋白500mg和2,4-D 2mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min)的培养皿内，置于26℃培养箱进行暗培养(约3～5d时小心去除长出的幼芽和根)，每隔3周继代1次，共继代3次。

[0076] 2、继代

[0077] 步骤1接种后第11周，挑选胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织夹碎成2.5-3mm大小的小块，按每瓶3块愈伤的方式转移到分化培养基(将KN032830mg、NH4SO4463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H20185mg、KH2PO4400mg、FeSO4·7H2027.8mg、ZnSO4·7H201.6mg、MnS04·
4H204.4mg、H2BO30.8mg、KI 1.6mg、甘氨酸2mg、烟酸0.5mg、盐酸硫胺素1.0mg、盐酸吡哆素
0.5mg、蔗糖30g、琼脂6g、脯氨酸690mg、水解酪蛋白100mg和甘露醇20mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min)进行分化培养。培养条件：28℃、光暗交替培养(16小时光照/8小时黑暗；光照强度约为2000lx)。

[0078] 3、分化

[0079] 完成步骤2后，将胚性愈伤组织转接到再分化培养基(将KN032830mg、NH4SO4463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H20185mg、KH2PO4400mg、FeSO4·7H2027.8mg、ZnSO4·7H201.6mg、MnS04·4H204.4mg、H2BO30.8mg、KI 1.6mg、甘氨酸2mg、烟酸0.5mg、盐酸硫胺素
1.0mg、盐酸吡哆素0.5mg、蔗糖30g、琼脂6g、脯氨酸690mg、水解酪蛋白100mg和KT 1mg溶于
1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min)进行再分化培养。培养条件：28℃、光暗交替培养(16小时光照/8小时黑暗；光照强度约为2000lx)。

[0080] 4、完成步骤3后，依次进行抗性筛选(采用浓度为3mg/L的双丙氨膦进行抗性筛选)和生根培养，得到再生植株，即为T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株。

[0081] 三、玉米糯性突变株的鉴定

[0082] 1、PCR扩增检测

[0083] 1)待步骤二培育的T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的幼苗长到3～4叶时，取新鲜叶片放入干净的研钵中，研钵需加液氮预冷，取来的叶片放入液氮中，然后用研杵将叶片研成粉末。

[0084] 2)取步骤1)得到的粉末，加入800μL的65℃预热的CTAB缓冲液(500mL的CTAB提取缓冲液的制备方法：加入50mL浓度为1M，pH7.5的Tris溶液，70mL浓度为5M的NaCl溶液，50mL浓度为0.5M、pH8.0的EDTA溶液，5.0g CTAB，5.0mL浓度为14Mβ-巯基乙醇溶液，325mL ddH2O，现用现配)，迅速剧烈振荡。65℃水浴加热15min，水浴过程中要颠倒混匀几次。水浴后，取出离心管，冷却至室温。

[0085] 3)完成步骤2)后，取所述离心管，加入800μL的氯仿：异戊醇(v：v＝24：1)混合液，轻轻倒转摇动10min之后12000rpm离心10min，取上清。

[0086] 4)取步骤3)得到的上清，加入3μL RNase溶液，室温下或37℃下温浴0.5～1h。

[0087] 5)完成步骤4)后，取整体液相体系，加入800μL的氯仿：异戊醇(v：v＝24：1)混合液，轻轻倒转摇动10min之后12000rpm离心10min，取上清，置于新的1.5mL的离心管中。

[0088] 6)完成步骤5)后，取所述离心管，加入0.7倍体积预冷(-80℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA析出凝集，在12000rpm条件下离心10min，弃上清(小心DNA倒出)。

[0089] 7)完成步骤6)后，取所述离心管，加入700μL的70％乙醇，洗涤1～2次。

[0090] 8)完成步骤7)后，取所述离心管，室温晾干后加入50μL的ddH2O溶解DNA，即为基因组DNA。

[0091] 9)以步骤8)获得的T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的基因组DNA为模板，以人工合成的ZmPolⅢca99-Ubi-F1和ZmPolⅢca99-Ubi-R1为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外凝胶成像仪成像。

[0092] PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

[0093] 引物序列及PCR反应体系详见表1和表2。

[0094] 按照上述步骤1)-9)，将步骤二培育的T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的幼苗替换为玉米自交系CA335幼苗，其它步骤均不变，作为阴性对照。

[0095] 将上述步骤9)中T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的基因组DNA替换为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9，其它步骤均不变，作为阳性对照。

[0096] 表1.引物序列和扩增产物

[0097]

[0098] 表2.PCR反应体系配置

[0099]组成成分 用量(μL)
10×PCR BufferI 2.0
dNTP(2.5mM) 1.6
F1(10μM) 0.4
R1(10μM) 0.4
模板 2.0
rTaq(2.5U/uL) 0.2
ddH2O 13.4
TOTAL 20.0

[0100] 实验结果表明，以重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9和步骤二获得的T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的基因组DNA为模板，获得的PCR扩增产物中均含有SEQ ID No.3自5’末端起第10047-10462位所示的416bp的DNA片段，而玉米自交系CA335幼苗的基因组DNA中不含有SEQ ID No.3自5’末端起第10047-10462位所示的416bp的DNA片段。可见，步骤二获得的T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株均为阳性T0代拟转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株。

[0101] 2、突变类型的分子检测

[0102] 为分析目标序列的突变类型，以Waxy1基因(SEQ ID No.1所示，编码SEQ ID No.5所示的蛋白)Cas9目标序列为核心，以阳性T0代转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株幼苗的基因组DNA为模板，使用人工合成的DE(WX1)-F和DE(WX1)-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物与PEASY-blunt simple vector连接并转化至Trans T1感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆，扩大培养并测序，统计突变类型并计算突变率。

[0103] 分子检测所用引物如下：

[0104] DE(WX1)-F：CATACTTCTCCGGACCATACGG；

[0105] DE(WX1)-R:TAGGGGCTGACGGTGAGG

[0106] 突变率＝全部转化事件突变基因总数/全部转化事件数＝(纯合突变株数×2+双等位基因突变株数×2+杂合突变株数)/全部转化事件数×100％。

[0107] 由于玉米是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的Waxy1基因发生了相同的突变，双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的Waxy1基因均发生了突变但突变形式不同，杂合突变株数指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的Waxy1基因发生了突变、另一条同源染色体的Waxy1基因未发生突变，野生型指的是该植株的两条同源染色体中的Waxy1基因均未发生突变。

[0108] 共检测阳性T0代转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株34株，其中纯合突变株数15株、发生编辑数为30次，双等位基因突变株17株、发生编辑次数为34次，杂合突变株数为0株，野生型2株、发生编辑次数为0次，突变率为94％。纯合突变和双等位基因突变均记为突变体。统计编辑位点插入或缺失情况数目统计如图2。根据编辑位点插入或缺失情况统计各类型突变所占的比例统计如图3。

[0109] 玉米为二倍体植物，Waxy1基因编码的颗粒结合型淀粉合成酶是控制玉米胚乳和花粉的直链淀粉合成。Waxy1基因通过CRESPR/Cas9核酸内切酶编辑之后，可造成Waxy1基因突变，当两条同源染色体的Waxy1基因均发生突变时，可以导致GBSSI酶活性丧失，胚乳直链淀粉合成受阻，胚乳中直链淀粉含量降低，从而改变淀粉的糊化和膨胀等特性形成具有糯性性状的糯性玉米。

[0110] 3、籽粒糯性与非糯性性状调查

[0111] 非糯性淀粉遇到碘水变蓝原理：非糯性籽粒中淀粉既含有直链淀粉(占10％-30％)也有支链淀粉(占70％-90％)，直链淀粉在结构上呈弯曲形式，并借助氢键的作用卷曲成螺旋状，加入碘水后，碘分子便进入螺旋结构中借助范德华力与直链淀粉联系在一起，从而形成络合物，这种络合物可以吸收除了蓝光以外的其他光，所以使非糯性淀粉呈现深蓝色。

[0112] 糯性淀粉遇到碘水变黄褐色原理：糯性淀粉中支链淀粉含量几乎占100％，直链淀粉也可以吸附碘，但是每个分支上的葡萄糖残基吸附的碘数量较少，所以糯性淀粉呈现黄褐色。

[0113] 将玉米自交系CA335的花粉授予阳性T0代转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的雌花序，作正交，待玉米种子成熟后，获得正交T1代籽粒。

[0114] 将阳性T0代转ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9基因植株的花粉授予玉米自交系CA335的雌花序，作反交，待玉米种子成熟后，获得反交T1代籽粒。

[0115] 待测籽粒：正交T1代籽粒、反交T1代籽粒、白糯籽粒、黄糯籽粒或玉米自交系CA335籽粒。

[0116] (1)籽粒染色

[0117] 将待测籽粒剥去种皮然后浸入碘液(含10％(质量比)KI，5％(质量比)I2的水溶液)10min，取出，观察籽粒颜色。将待测籽粒不剥种皮作为对照。如果籽粒颜色为深蓝色或偏黑色、则为非糯性籽粒，如籽粒为黄褐色或着色较浅、则为糯性。

[0118] 籽粒染色结果见图4(R1为没有剥去种皮的籽粒，R2为剥去种皮且浸在碘液10min后染色结果，L1为白糯籽粒，L2为黄糯籽粒，L3为玉米自交系CA335籽粒，L4、L6和L8为正交T1代籽粒，L5和L7为反交T1代籽粒。Bar为2厘米)。结果表明，正交T1代籽粒和反交T1代籽粒中既有糯性籽粒又有非糯性籽粒。

[0119] (2)淀粉粒染色

[0120] 将正交T1代籽粒、反交T1代籽粒、白糯籽粒或玉米自交系CA335籽粒浸泡过夜，待胚乳松软后切下背向胚侧的一层3mm宽度的胚乳，磨碎，加入碘液，然后用普通光学显微镜观察淀粉粒染色情况并统计T1代籽粒中糯性籽粒、非糯性籽粒和杂合型籽粒(即既有糯性淀粉粒又有非糯性淀粉粒的籽粒)的粒数。

[0121] 淀粉粒染色结果见图5(A为玉米自交系CA335籽粒，B为白糯籽粒，C为玉米自交系CA335籽粒和白糯籽粒的淀粉粒混合碘染色结果，D为正交T1代籽粒中的非糯性籽粒，E为反交T1代籽粒中的糯性籽粒，F为正交T1代籽粒中的非糯性籽粒和反交T1代籽粒中的糯性籽粒的淀粉粒混合碘染色结果)。统计结果表明，正交T1代籽粒共计345颗，包括糯性籽粒53颗、非糯性籽粒214颗、杂合型籽粒78颗；反交T1代籽粒共计286颗，包括糯性籽粒103颗，非糯性籽粒129颗和杂合型籽粒54颗。