3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的酶法转化制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3,4‑二甲氧基‑L‑苯丙氨酸的酶法转化制备方法。该制备方法采用含3,4‑二甲氧基苯丙酮酸的料液为底物，加入L‑天冬氨酸和具有天冬氨酸转氨酶活性的菌体细胞或粗酶液，25～55℃、pH 7～11条件下进行酶促反应，利用等电点结晶法分离制备转化产物3,4‑二甲氧基‑L‑苯丙氨酸。该方法以3,4‑二甲氧基苯丙酮酸的料液为底物,酶法合成了附加值较高的3,4‑二甲氧基‑L‑苯丙氨酸，具有酶促转化效率高，操作简便，生产成本低等优点，可在制备左旋多巴和莫西普利中应用。

权利要求

1.一种3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成：

(1)将具有天冬氨酸转氨酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活的菌体；培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，总碳源质量浓度为1～30g/L，氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，总氮源质量浓度为1～30g/L；具有天冬氨酸转氨酶活性的菌株为大肠杆菌或柠檬酸杆菌或欧文氏菌；

(2)将L-天冬氨酸加入浓度为22.5～135g/L的3,4-二甲氧基苯丙酮酸水溶液中，NaOH水溶液调pH 7～11，再加入具有天冬氨酸转氨酶活性的湿菌体或酶粗提液，浓度为0.01～

0.1g/L的磷酸吡哆醛和浓度为0.2～2.0g/L的吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100，在25～55℃条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸。

说明书

3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的酶法转化制备方法

一、技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的酶法转化制备方法。二、背景技术

[0002] 在医药领域,3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸是合成L-多巴和莫西普利等药物的重要前体原料。

[0003] L-多巴是生物体内一种重要的活性物质，通过血脑屏障进入脑组织，经多巴脱羧酶脱羧而转变成多巴胺发挥作用。适用于原发性震颤麻痹症及非药原性震颤麻痹综合征，主要用于治疗帕金森综合症。近年来文献报道化学法制备L-多巴的方法主要以3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸为前体原料，经过酸化，脱甲基过程制备L-多巴。翟宁等(CN 104725259A)以3,4-二甲氧基苯丙氨酸酯为原料，L-酒石酸衍生物为拆分剂，得到3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸酯，在经过水解，脱保护可以进一步制备左旋多巴合成路线如下。

[0004]

[0005] 莫西普利是一种新型长效非巯基的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)，对轻，中，重度高血压都有效，降低收缩压作用强于卡托普利。可以治疗各种原因引起的心力衰竭。自从莫西普利用于临床以来，发展迅速，已成为临床上治疗高血压、慢性心功能不全等心血管疾病的重要药物。目前文献报道莫西普利的制备方法是以3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸为原料经过环化，苄基保护，缩合等四步反应制得。

[0006] 合成路线如下：

[0007]

[0008] 从上面的两个合成路线可以得出,要想高效、绿色、低成本制备L-多巴和莫西普利,关键步骤是能够高效、绿色、低成本制备前体原料3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸。

[0009] 根据目前文献报道，3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸制备方法主要为化学合成法，分为以下几种：

[0010] N.J.Rreilly等(Synthesis-Stuttgart,1990,7,550-556.)以藜芦醛为原料，R-PROPHOS为催化剂，经缩合，不对称催化加氢，酸化水解等步骤制得，最终得到产物3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸产率90％，ee值为88.3％。

[0011] A.Torrado等(J.Org.Chem.,1996,61,8940-8948.)以藜芦醇为原料，经过溴代，取代，酸化水解得到(DL)3,4-二甲氧基苯丙氨酸，再经过甲酯化，用选择性的蛋白水解酶得到ee值为99％的3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸，收率为76％。

[0012] O.F.Kuznetsova等(Radiochemistry,2002,44(6),527-532)用藜芦醇为原料，经过亲核加成，还原等反应再用Ni-BPB-Gly催化氢化反应制得ee值为84％～95％的3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸，收率为8.4％。

[0013] V.R.Arava等(Synth.Commun.,2013,43,2892-2897)以藜芦醛为原料，[(S)-BINAP Ru Cl(benzene)]Cl为催化剂50℃不对称催化加氢制得ee值为77.5％的3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸，收率为82.0％。

[0014] 以上化学法制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的路线中需要大量金属催化物，有毒反应物和有机溶剂，严重污染环境，成本高、产物得率低且在不对称合成过程中，步骤较为繁琐，拆分试剂毒性较大，产品的比旋光不高。尤其是D-多巴对人体有较大毒副作用，化学不对称合成的L-多巴很难达到药剂使用要求。因此能否高效、绿色、低成本制备L-多巴和莫西普利前体原料3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸尤为关键。三、发明内容

[0015] 本发明需要解决的问题是提供一种高效、绿色、低成本制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的方法。将L-天冬氨酸加入浓度为22.5～135g/L的3,4-二甲氧基苯丙酮酸水溶液中，NaOH水溶液调pH 7～11，再加入具有天冬氨酸转氨酶活性的湿菌体或酶粗提液，浓度为0.01～0.1g/L的磷酸吡哆醛和浓度为0.2～2.0g/L的吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100，在25～55℃条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸。

[0016] 本发明可以通过以下技术方案来达到：

[0017] 3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为：

[0018] (1)将具有天冬氨酸转氨酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活的天冬氨酸转氨酶；

[0019] (2)将L-天冬氨酸加入浓度为22.5～135g/L的3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，NaOH水溶液调pH 7～11，再加入具有天冬氨酸转氨酶活性的湿菌体或酶粗提液，磷酸吡哆醛和表面活性剂，在25～55℃条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸。

[0020] 上述步骤(1)所述的天冬氨酸转氨酶菌株为大肠杆菌或柠檬酸杆菌或欧文氏菌。培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～
30g/L。

[0021] 上述步骤(2)所述的含3,4-二甲氧基-L-苯丙酮酸水溶液，含量为22.5～135g/L，酶促反应中3,4-二甲氧基苯丙酮酸与L-天冬氨酸的摩尔比为1:1；磷酸吡哆醛浓度为0.01～0.1g/L；所述的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX-100，其浓度为0.2～2.0g/L。

[0022] 目前文献报道，3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸制备方法主要为化学合成法，采用不对称催化氢化法制备，由于使用具有知识产权的手性配体，技术壁垒较高，同时手性配体和重金属催化剂镍、铑等，价格较为昂贵，现有技术无法回收，虽然使用量为催化量，但成本依然不低，而且最终产品可能导致重金属残留，生产过程环保压力大，不适于大规模工业化生产，满足不了市场需求。尤其是产品的光学纯度不高，D-多巴对人体有较大毒副作用，化学不对称合成的L-多巴很难达到药剂使用要求。

[0023] 本发明使用具有天冬氨酸转氨酶活性的菌体细胞或粗酶液，在适当条件下催化3,4-二甲氧基苯丙酮酸制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸，具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、反应周期短、产物易于分离等优点，3,4-二甲氧基苯丙酮酸的摩尔转化率达到90％以上，光学纯度达到99％，生产成本大幅度降低，符合绿色化工要求，具有重大突出实施效果和工业化应用价值。

[0024] 本发明与现有技术相比具有如下优点：

[0025] (1)本发明利用天冬氨酸转氨酶催化3,4-二甲氧基苯丙酮酸制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸，酶法转化效率高，酶立体选择性强，其中3,4-二甲氧基苯丙酮酸摩尔转化率达到90％以上，产品的光学纯度达到99％以上，完全可以满足市场需要。

[0026] (2)酶法制备3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸避免使用有毒反应物，有机溶剂，手性配体和重金属催化剂镍、铑等催化剂，降低了生产成本，减小了环保压力，实施效果突出，具有良好的经济效益和社会效益。

[0027] (3)酶促反应生成的3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸在水中溶解度较小，只需用等电点结晶法即可实现分离。

[0028] (4)酶法合成3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。四、具体实施方式

[0029] 以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例。

[0030] 实施例一

[0031] 1.将13.3g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为22.5g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 7，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的柠檬酸杆菌湿菌体，浓度为0.01g/L的磷酸吡哆醛和0.2g/L的吐温80，25℃酶促反应24h，反应结束后总体积1050ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为13.7g/L，对底物摩尔转化率为61％。

[0032] 2.将转化液8000r/min离心15min，收集湿细胞和固体3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸混合物34.5g，用400ml纯水溶解固体混合物，滴加30％NaOH溶液调pH 11，搅拌将固体3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸溶解完全，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6N HCl溶液调pH 6.0～7.0，搅拌结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸11.5g，收率51％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0033] 实施例二

[0034] 1.将79.8g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为135g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 11，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的欧文氏菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，55℃酶促反应24h，反应结束后总体积1300ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为36.45g/L，对底物摩尔转化率为
27％。

[0035] 2.将转化液8000r/min离心15min，收集湿细胞和固体3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸混合物56.5g，用400ml纯水溶解固体混合物，滴加30％NaOH溶液调pH 11，搅拌将固体3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸溶解完全，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6N HCl溶液调pH 6.0～7.0，搅拌结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸33.75g，收率25％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0036] 实施例三

[0037] 1.将53.2g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为90g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 8，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的大肠杆菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，40℃酶促反应24h，反应结束后总体积1100ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为83.7g/L，对底物摩尔转化率为
93％。

[0038] 2.3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸分离纯化方法同实施例二，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸81.9g，收率91％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0039] 实施例四

[0040] 1.将66.5g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为112.5g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 8，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的大肠杆菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，40℃酶促反应24h，反应结束后总体积1230ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为105.7g/L，对底物摩尔转化率为94％。

[0041] 2.3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸分离纯化方法同实施例二，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸103.5g，收率92％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0042] 实施例五

[0043] 1.将13.3g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为22.5g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 8，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的大肠杆菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，30℃酶促反应24h，反应结束后总体积1050ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为18.4g/L，对底物摩尔转化率为82％。

[0044] 2.3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸分离纯化方法同实施例一，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸17.3g，收率77％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0045] 实施例六

[0046] 1.将13.3g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为22.5g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 8，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的大肠杆菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，40℃酶促反应24h，反应结束后总体积1050ml。取样NaOH溶液溶解HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为20.9g/L，对底物摩尔转化率为93％。

[0047] 2.3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸分离纯化方法同实施例一，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸20.3g，收率90％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0048] 实施例七

[0049] 1.将13.3g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为22.5g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 7，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的大肠杆菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，40℃酶促反应24h，反应结束后总体积1050ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为19.1g/L，对底物摩尔转化率为85％。

[0050] 2.3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸分离纯化方法同实施例一，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸18.5g，收率82％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。

[0051] 实施例八

[0052] 1.将13.3g L-天冬氨酸加入到1000ml浓度为22.5g/L 3,4-二甲氧基苯丙酮酸转化液中，30％NaOH溶液调pH 9，再加入20g具有天冬氨酸转氨酶活性的大肠杆菌湿菌体，浓度为0.1g/L的磷酸吡哆醛和2.0g/L的吐温80，40℃酶促反应24h，反应结束后总体积1050ml。取样，HPLC检测转化液中3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸浓度为18.7g/L，对底物摩尔转化率为83％。

[0053] 2.3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸分离纯化方法同实施例一，烘干得3,4-二甲氧基-L-苯丙氨酸18.4g，收率81％，比旋光 (c＝1，4mol/L HCl)。