一种肺癌调节因子SRSF5及其抑制剂与应用

摘要

本发明公开了一种肺癌调节因子SRSF5及其抑制剂与应用。本发明通过细胞学水平的增殖实验、平板克隆形成实验以及体外动物整体水平的裸鼠成瘤实验证明了SRSF5‑CCAR1的调控轴失衡对于肺癌的发生起促进作用。上述实验说明SRSF5‑CCAR1信号轴可以作为潜在的肺癌治疗靶标，丰富了对剪接因子的活性调控机制的认识。基于SRSF5‑CCAR1信号轴的小分子抑制剂或剪接活性调节抑制剂的筛选将为肺癌的靶向治疗提供新的思路和重要科学基础。

权利要求

1.抑制SRSF5表达和/或活性的物质在制备具有如下（1）或（2）功能的产品中的应用：（1）治疗和/或预防肿瘤；

（2）抑制肿瘤细胞的生长；

所述肿瘤为非小细胞肺癌；

所述抑制SRSF5表达和/或活性的物质为干扰SRSF5表达的RNA分子；

所述干扰SRSF5表达的RNA分子为干扰SRSF5表达的shRNA；

所述干扰SRSF5表达的shRNA为序列1或序列2所示的RNA分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制肿瘤细胞的生长体现在降低肿瘤细胞的重量和/或减小肿瘤细胞的体积和/或提高原位凋亡肿瘤细胞的比例。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述抑制SRSF5表达和/或活性的物质是通过调控肿瘤细胞中CCAR1可变剪接产物含量来抑制所述肿瘤细胞生长的。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述调控肿瘤细胞中CCAR1可变剪接产物含量体现在提高肿瘤细胞中CCAR1长形式可变剪接产物的含量和/或降低肿瘤细胞中CCAR1短形式可变剪接产物的含量和/或提高肿瘤细胞中CCAR1长形式可变剪接产物与CCAR1短形式可变剪接产物的比例。

说明书

一种肺癌调节因子SRSF5及其抑制剂与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肺癌调节因子SRSF5及其抑制剂与应用。

背景技术

[0002] 真核生物中95％的基因存在可变剪接，可变剪接决定了RNA的多样性并对蛋白质的表达模式产生重要影响。可变剪接的动态调控网络由若干顺式作用元件和反式作用因子组成：通常精氨酸丝氨酸富集剪接因子(SRSF)结合在外显子剪接增强子和内含子剪接增强子上，而核异质核糖核蛋白(hnRNP)结合在外显子剪接抑制子和内含子剪接抑制子上，二者存在空间和时间上的相互竞争关系。经典的剪接激活过程是由SR蛋白结合在相应顺式剪接元件上招募剪接小体的组成蛋白U1、U2及其相关辅助因子，进而将可变剪接的外显子释放；而在剪接抑制过程中，核异质核糖核蛋白在形成套索结构后将可变剪接的外显子切除。因此，剪接因子的活性和含量的精细调控对于剪接小体的组装和功能发挥尤为重要。

[0003] SRSF分为经典型精氨酸丝氨酸富集型剪接因子和精氨酸丝氨酸富集类似型剪接因子两大类，经典型SR蛋白具有12个成员，其保守型的结构域通常为位于N端的1-2个RNA识别结构域和位于C端的精氨酸丝氨酸富集区域，后者也被普遍认为是SR蛋白的翻译后修饰发生的高频区域。目前多篇乙酰化和泛素化修饰组学数据集显示：SRSF5是唯一一个同时存在两种翻译后修饰且修饰位点高度重合的SR型剪接因子(修饰位点K125)，因此其功能特征和调节机制值得探讨。异常调控的可变剪接是肿瘤细胞的经典标志。然而，可变剪接中关键成分剪接因子的活性调节知之甚少。

[0004] CCAR1广泛的参与细胞周期和细胞凋亡的调节并受notch信号刺激，但迄今为止，CCAR1的剪接活性调节关系知之甚少。CCAR1作为SRSF5的剪切底物，剪切产物共有长短两种形式CCAR1L和CCAR1S，CCAR1L保存了完整的转录本而CCAR1S是CCAR1第15-22个外显子发生可变剪接之后的产物。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供抑制SRSF5表达和/或活性的物质的新用途。

[0006] 本发明提供了抑制SRSF5表达和/或活性的物质在制备具有如下(1)-(3)中至少一种功能的产品中的应用：

[0007] (1)治疗和/或预防肿瘤；

[0008] (2)抑制肿瘤细胞的生长；

[0009] (3)调控肿瘤细胞中CCAR1可变剪接产物含量。

[0010] 上述应用中，所述抑制肿瘤细胞的生长体现在降低肿瘤细胞的重量和/或减小肿瘤细胞的体积和/或提高原位凋亡肿瘤细胞的比例。

[0011] 上述应用中，所述调控肿瘤细胞中CCAR1可变剪接产物含量体现在提高肿瘤细胞中CCAR1长形式可变剪切产物的含量和/或降低肿瘤细胞中CCAR1短形式可变剪切产物的含量和/或提高肿瘤细胞中CCAR1长形式可变剪切产物与CCAR1短形式可变剪切产物的比例。

[0012] 上述应用中，所述抑制SRSF5表达和/或活性的物质为抗SRSF5抗体、SRSF5小分子抑制剂、SRSF5可溶性蛋白或干扰SRSF5表达的RNA分子。

[0013] 上述应用中，所述干扰SRSF5表达的RNA分子为干扰SRSF5表达的shRNA。

[0014] 上述应用中，所述干扰SRSF5表达的shRNA为序列1或序列2所示的RNA分子。

[0015] 本发明的另一个目的是提供一种产品。

[0016] 本发明提供的产品的活性成分为抑制SRSF5表达和/或活性的物质，所述产品的用途为如下(1)-(3)中至少一种：

[0017] (1)治疗和/或预防肿瘤；

[0018] (2)抑制肿瘤细胞的生长；

[0019] (3)调控肿瘤细胞中CCAR1可变剪接产物含量。

[0020] 上述产品中，所述抑制肿瘤细胞的生长体现在降低肿瘤细胞的重量和/或减小肿瘤细胞的体积和/或提高原位凋亡肿瘤细胞的比例。

[0021] 上述产品中，所述调控肿瘤细胞中CCAR1可变剪接产物含量体现在提高肿瘤细胞中CCAR1长形式可变剪切产物的含量和/或降低肿瘤细胞中CCAR1短形式可变剪切产物的含量和/或提高肿瘤细胞中CCAR1长形式可变剪切产物与CCAR1短形式可变剪切产物的比例。

[0022] 上述产品中，所述抑制SRSF5表达和/或活性的物质为抗SRSF5抗体、SRSF5小分子抑制剂、SRSF5可溶性蛋白或干扰SRSF5表达的RNA分子。

[0023] 上述产品中，所述干扰SRSF5表达的RNA分子为干扰SRSF5表达的shRNA。

[0024] 上述产品中，所述干扰SRSF5表达的shRNA为序列1或序列2所示的RNA分子。

[0025] 上述应用或产品中，所述肿瘤为非小细胞肺癌，所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞，所述非小细胞肺癌细胞具体为A549细胞。

[0026] 本发明的最后一个目的是提供如下1)-3)中任一种作为靶点的新用途：

[0027] 1)SRSF5；

[0028] 2)SRSF5-CCAR1信号轴；

[0029] 3)CCAR1可变剪接产物。

[0030] 上述应用中，所述SRSF5-CCAR1信号轴是指SRSF5的表达和/或活性下降，CCAR1短形式可变剪接产物(CCAR1S)的比例下降，即SRSF5表达水平与CCAR1短形式可变剪接产物(CCAR1S)的比例呈正相关。

[0031] 上述应用中，所述CCAR1可变剪接产物为CCAR1短形式可变剪接产物(CCAR1S)和/或CCAR1长形式可变剪接产物(CCAR1L)。

[0032] 本发明提供了上述1)-3)中任一种作为靶点在开发治疗和/或预防非小细胞肺癌的药物中的应用。

[0033] 本发明通过对60例非小细胞肺癌临床样品进行蛋白印迹和免疫组化分析发现：在非小细胞肺癌的临床样本中，SRSF5的蛋白水平和乙酰化SRSF5的蛋白水平均上调，且呈现显性正相关，同时SRSF5的蛋白水平和乙酰化SRSF5的蛋白水平均与CCAR1短形式可变剪接的比例具有显性正关联；然后通过细胞学水平的增殖实验、平板克隆形成实验以及体外动物整体水平的裸鼠成瘤实验证明了SRSF5-CCAR1的调控轴失衡对于肺癌的发生起促进作用。上述实验说明SRSF5-CCAR1信号轴可以作为潜在的肺癌治疗靶标，丰富了对剪接因子的活性调控机制的认识。基于SRSF5-CCAR1信号轴的小分子抑制剂或剪接活性调节抑制剂的筛选将为肺癌的靶向治疗提供新的思路和重要科学基础。

附图说明

[0034] 图1为非小细胞肺癌和邻近癌旁组织中，SRSF5的蛋白水平检测结果。

[0035] 图2为非小细胞肺癌和其邻近癌旁组织中，SRSF5和乙酰化SRSF5的免疫组化检测结果图。

[0036] 图3为非小细胞肺癌和邻近癌旁组织中，乙酰化SRSF5的蛋白水平检测结果。

[0037] 图4为非小细胞肺癌和其邻近癌旁组织中，CCAR1L和CCAR1S两种转录本的比例检测图。

[0038] 图5为针对60例配对的非小细胞肺癌和邻近癌旁组织中CCAR1S/CCAR1L相对比例的统计学分析结果。

[0039] 图6为敲低SRSF5后，SRSF5的表达水平的检测结果。

[0040] 图7为敲低SRSF5后，CCAR1S/CCAR1L比例变化的检测结果。

[0041] 图8为在非小细胞肺癌细胞系A549中敲低SRSF5后肿瘤生长体积的检测结果。

[0042] 图9为敲低SRSF5后肿瘤重量的检测结果。

[0043] 图10为敲低SRSF5后的原位瘤TUNEL染色检测结果。

[0044] 图11为在敲低SRSF5及过表达CCAR1L和CCAR1S的挽救实验中肿瘤生长速率的检测结果。

[0045] 图12为敲低SRSF5及过表达CCAR1L和CCAR1S的挽救实验中肿瘤生长体积和重量的检测结果。

[0046] 图13为敲低CCAR1S后挽救实验中原位瘤TUNEL染色检测结果。

具体实施方式

[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0049] 下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0050] 实施例1、非小细胞肺癌临床样品中SRSF5的蛋白水平及其乙酰化水平的检测[0051] 一、SRSF5的蛋白水平的检测

[0052] 1、免疫印迹实验

[0053] (1)样本的收集

[0054] 60例配对的非小细胞肺癌肿瘤样本(每例样本包括非小细胞肺癌的癌组织及其相邻的正常组织)收集自解放军总医院普外科，所有临床样本都具备必要的临床信息且获得病人的知情同意，样本的采集和储存均符合临床标准和规定。

[0055] (2)Western Blot检测

[0056] 样本搜集后，利用液氮法对样本组织进行研磨，研磨成细碎粉末，按照每0.1g/100μl加入RIPA裂解液溶解，并加入等体积的上样缓冲液沸水浴5-10min后上样检测。具体操作步骤：SDS-PAGE电泳，浓缩胶90V，20-30min，蛋白预染Marker在分离胶中完全分开后，将电压调至180V；当溴酚蓝完全分开后，将蛋白电转至NC膜上；将NC膜转移至含有5％脱脂牛奶的TBST中封闭1h；封闭后加入一抗：SRSF5(abcam，ab67175 1:400)4℃过夜或室温3h；TBST洗膜3次，每次10min；室温孵育二抗：羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch，115-035-003)或羊抗在兔二抗(Jackson ImmunoResearch，111-035-003)用TBST洗涤3次，加入ECL化学底物发光试剂暗室曝光显影；通常保留短曝光(30s以内)，中曝光(5-10min)及长曝光(3小时以上)的不同曝光阶段胶片若干，必要时可添加超敏反应试剂盒。

[0057] Western Blot检测结果如图1所示，从图中可以看出：SRSF5的蛋白水平在非小细胞肺癌及其癌旁组织中存在显著性差异，癌组织(T)中SRSF5的蛋白表达水平明显高于对应的癌旁组织(N)的表达水平。

[0058] 2、免疫组化实验

[0059] 使用肺癌组织芯片(购于上海芯超生物有限公司)将非小细胞肺癌石蜡标本制作成组织芯片，采用免疫组化法检测组织芯片，利用连续切片对应的组织样本进行染色分析，肿瘤芯片的免疫组化使用的抗体及浓度为：SRSF5(1:100，Novus Bio)。具体步骤如下：

[0060] 1)白片脱蜡：二甲苯I、II各10min；

[0061] 2)切片复水：100％I、100％II、95％、90％、80％、70％的酒精时间依次为8min、8min、6min、5min、3min、3min；

[0062] 3)双蒸水洗涤2min×3；

[0063] 4)3％的双氧水去除内源过氧化物酶15min，避光孵育；

[0064] 5)PBS 2min×3；

[0065] 6)抗原修复：微波炉中高火将柠檬酸盐修复液煮沸用时10min左右，缓慢冷却至室温；

[0066] 7)PBS洗3次，每次3min；

[0067] 8)山羊血清37℃封闭1h，或者4℃过夜；

[0068] 9)轻轻甩掉液体，悬空侧滴一抗，4℃孵育过夜；

[0069] 10)加二抗辅助剂，37℃，30min；

[0070] 11)PBS 3min×3；

[0071] 12)加辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃，30min；

[0072] 13)PBS 3min×3；

[0073] 14)DAB显色，镜下观察，A:B:C 6:6:6/500μl，使显色反应均匀；

[0074] 15)蒸馏水冲洗，苏木素染核10-30s，自来水冲洗2min，酒精盐酸分化23s，自来水冲洗；

[0075] 16)脱水：70％、80％、90％、95％、100％各2min；

[0076] 17)透明：二甲苯I、II分别5min；

[0077] 18)中性树脂封片，镜下观察，并利用Nikon成像系统采集照片。

[0078] 检测结果如图2(第一行)所示，IHC染色结果表明：在非小细胞肺癌中，SRSF5在细胞核的着色显著增强，说明非小细胞肺癌中SRSF5的蛋白表达水平显著上调。

[0079] 二、SRSF5乙酰化水平的检测

[0080] 1、免疫印迹实验

[0081] (1)样本的收集

[0082] 同步骤一中1的(1)。

[0083] (2)Western Blot检测

[0084] 检测方法同步骤一中1的(2)，其中使用的抗体为Ac-SRSF5(上海睿星生物有限公司自制，1：300)。

[0085] 检测结果如图3所示，乙酰化SRSF5(Ac-SRSF5)的蛋白水平在非小细胞肺癌及其癌旁组织中存在显著性差异，癌组织(T)中Ac-SRSF5的蛋白表达水平明显高于对应的癌旁组织(N)的表达水平。

[0086] 2、免疫组化实验

[0087] 同步骤一中2的实验方法。检测中使用的抗体浓度为Ac-K125(上海睿星生物有限公司自制，1：50)。

[0088] 检测结果如图2(第二行)所示，IHC染色结果表明：在非小细胞肺癌中，乙酰化SRSF5(Ac-SRSF5)在细胞核的着色显著增强，说明在非小细胞肺癌中乙酰化SRSF5(Ac-SRSF5)的蛋白表达水平显著上调。SRSF5蛋白水平和乙酰化SRSF5蛋白水平呈正相关。

[0089] 三、CCAR1可变剪切产物的比例检测

[0090] CCAR1作为SRSF5的剪切底物，剪切产物共有长短两种形式CCAR1L和CCAR1S，SRSF5的蛋白表达水平和乙酰化SRSF5的蛋白表达水平均影响CCAR1可变剪切产物的比例，该步骤以非小细胞肺癌肿瘤组织样本的cDNA为模板，采用特异性区分长短两种形式的引物进行实时定量PCR，检测非小细胞肺癌肿瘤组织样本中长短两种形式的相对丰度和含量。其中，检测长形式可变剪切产物(CCAR1L)的引物序列为5’-GTTTCAATCCCGCCAACGCA-3’和5’-CCGAACACGTCTCCTGCTC-3’；检测短形式可变剪切产物(CCAR1S)的引物序列为5’-ACTCCTTGTAGCGACCTGG-3’和5’-CCACGCTATGATCAGAGCTACG-3’。具体步骤如下：

[0091] 1)匀浆化处理：利用研磨棒从配对的肿瘤样本组织研磨提取RNA，加入1mlTrizol；

[0092] 2)相分离：室温下匀浆化样品5min；

[0093] 3)RNA抽提：加入0.2ml/氯仿:1mlTrizol试剂，小心盖上EP管盖，剧烈甩动离心管15-20s，使其混匀，室温温育2-3min；4℃，12000rpm，离心15min。离心后混合物分为三层：最底层红色-酚氯仿，中间及上层水相，RNA位于水相，水相约占总体积的60％；

[0094] 4)沉淀RNA：将水相转移至新的离心管；加入0.5ml异丙醇/1mlTrizol，使RNA沉淀；室温温育10min，4℃，12000rpm离心10min，温育使水相与试剂充分反应。

[0095] 5)洗涤RNA：去上清，加入1ml 75％乙醇/1ml Trizol，涡旋样品，4℃，7000rpm，5min。

[0096] 6)重新溶解：待RNA稍微晾干后，露出白色物质，不宜太干燥，降低RNA的溶解。加入20-30μl DEPC水，55-60℃水浴10min，全部溶解后用枪头混匀。

[0097] 7)RNA质量检测：凝胶电泳结果显示为三条带或者A260/A280比值为1.8，RN含量＝A260×稀释倍数。

[0098] 8)第一链的合成采用TOYOBO公司的试剂盒，反应体系如下：2×mix 5ul+RNA(总量1μg以下)；反应程序：37℃20min，95℃5min，4℃保存。

[0099] 检测结果如图4和图5所示，从图中可以看出：在非小细胞肺癌样本中，CCAR1S/CCAR1L比例较之正常对照组显著升高，针对60例样本的统计学分析表明：该结果具有显著性。

[0100] 综上所述：在非小细胞肺癌的临床样本中，SRSF5的蛋白水平和乙酰化SRSF5的蛋白水平均显著上调，同时可变剪接中关键成分剪接因子SRSF5的蛋白表达水平和乙酰化SRSF5的蛋白水平均与CCAR1短形式可变剪接产物(CCAR1S)的比例呈正相关。

[0101] 实施例2、抑制SRSF5表达的物质在治疗非小细胞肺癌中的应用

[0102] 一、敲低SRSF5细胞及其相关回转细胞株的构建

[0103] 1、敲低SRSF5细胞的构建及鉴定

[0104] (1)敲低SRSF5的表达质粒

[0105] 将sh-SRSF5-1插入pLKO.1puro慢病毒载体(载体购自addgene,#8453)的AgeI和EcoRI位点间，得到敲低SRSF5的表达质粒#1；

[0106] 将sh-SRSF5-2插入pLKO.1puro慢病毒载体(载体购自addgene,#8453)的AgeI和EcoRI位点间，得到敲低SRSF5的表达质粒#2；

[0107] 将对照序列shRNA插入pLKO.1puro慢病毒载体的AgeI和EcoRI位点间，得到对照质粒。shRNA序列如下：

[0108] sh-SRSF5-1：GAGAAGGACGTGGAAAGATT(序列1)；

[0109] sh-SRSF5-2：GACGGATAAGAGATATTGATCT(序列2)；

[0110] Control(对照序列shRNA)：TTCTCCGAACGTGTCACGTAT。

[0111] (2)慢病毒包装和纯化

[0112] 将步骤(1)中构建的敲低SRSF5的表达质粒#1、敲低SRSF5的表达质粒#2和对照质粒进行慢病毒包装和纯化，形成包被有敲低SRSF5的表达质粒#1、敲低SRSF5的表达质粒#2和对照质粒的病毒浓缩液。具体步骤如下：

[0113] 1)293T细胞(上海博谷生物公司，CBP60439)复苏后1:3传代2次，随后铺至60mm培养皿；

[0114] 2)18小时后换液，维持细胞最佳生长状态6-8小时后进行转染，转染具体步骤如下：

[0115] 将敲低SRSF5的表达质粒#1、包装质粒psPAX2(biovector，BioVector1058 1-52，下同)和pMD2.G(BioVector1058 1-53，下同)按照质量比为1:3:4的比例共同导入293T细胞中；

[0116] 将敲低SRSF5的表达质粒#2、包装质粒psPAX2和pMD2.G按照质量比为1:3:4的比例共同导入293T细胞中；

[0117] 将对照质粒、包装质粒psPAX2和pMD2.G按照质量比为1:3:4的比例共同导入293T细胞中。

[0118] 3)12h后换液完全培养基：随后于24、48、72小时后收取病毒上清；

[0119] 4)收集齐上清后，用0.45μm孔径无菌滤器过滤；将病毒上清利用超滤管进行浓缩(Lenti-Concentin Virus Precipitation Solution，Excell Bio)按照体积比为4:1的比例混匀，4℃静置至少12h，用冷冻离心机3000g，30min，4℃；

[0120] 5)弃上清液，收集沉淀；用PBS对沉淀进行重悬(按照体积比为1:100的浓缩比例)，得到包被有敲低SRSF5的表达质粒#1、敲低SRSF5的表达质粒#2和对照质粒的病毒浓缩液。-80℃冰箱保存。

[0121] (3)感染目的细胞

[0122] 分别将包被有敲低SRSF5的表达质粒#1，#2和对照质粒的病毒浓缩液感染用F12K培养基(cellgro，10-025-CV)培养的目的细胞A549(购自ATCC，货号ATCC CRM-CCL-185)，感染比例控制在1:2-1:3之间，利用2μg/ml puromycin筛选一周，得到敲低SRSF5的稳定细胞系#1、敲低SRSF5的稳定细胞系#2和对照细胞。

[0123] (4)敲低SRSF5细胞的鉴定

[0124] 利用Western Blot检测敲低SRSF5的稳定细胞系#1、敲低SRSF5的稳定细胞系#2和对照细胞的SRSF5蛋白表达水平及长短两种形式的CCAR1L和CCAR1S的蛋白表达水平。

[0125] SRSF5的蛋白表达水平检测结果如图6。从图中可以看出，敲低SRSF5的稳定细胞系#1和敲低SRSF5的稳定细胞系#2均已成功敲除SRSF5。

[0126] 长短两种形式的CCAR1L和CCAR1S的表达水平检测结果如图7所示。从图中可以看出，敲低SRSF5的稳定细胞系#1和敲低SRSF5的稳定细胞系#2中CCAR1长形式可变剪切产物(CCAR1L)的比例明显提高。说明SRSF5蛋白水平与CCAR1短形式可变剪接产物(CCAR1S)成正相关。

[0127] 2、敲低SRSF5细胞后相关回转细胞株的构建及鉴定

[0128] (1)敲低SRSF5并回转CCAR1L细胞株的构建

[0129] 1)表达质粒的构建

[0130] 将序列1所示的sh-SRSF5-1插入pMKO.1puro逆转录病毒载体(载体购自addgene,#8452)的AgeI和EcoRI位点间，得到敲低SRSF5的表达质粒；

[0131] 将对照序列shRNA插入pMKO.1puro慢病毒载体的AgeI和EcoRI位点间，得到对照质粒；

[0132] 将序列3所示的CCAR1L全长序列插入pQCXIH  hygro逆转录病毒(载体购自addgene,#33091)的NotI和XhoI位点间，得到稳定过表达CCAR1L的表达质粒。

[0133] 2)逆转录病毒的包装与纯化

[0134] 将步骤1)获得的敲低SRSF5的表达质粒、对照质粒和稳定过表达CCAR1L的表达质粒进行逆转录病毒包装和纯化，分别得到包被有敲低SRSF5的表达质粒、对照质粒和稳定过表达CCAR1L表达质粒的病毒浓缩液。具体方法同步骤1(2)中的1)。

[0135] 3)感染目的细胞

[0136] 考虑到筛选标记的双向性，首先分别用包被有敲低SRSF5的表达质粒、对照质粒的病毒浓缩液感染A549细胞(感染比例调整为1:3)。48小时后，进行敲低细胞株的首轮筛选(3ug/ml puromycin，1周)。随后将包被有稳定过表达CCAR1L的表达质粒的病毒浓缩液感染至首轮筛选的阳性细胞(感染比例调整为1:2)。36小时后，将包被有CCAR1L(挽救)的阳性细胞进行二轮筛选(hygromycin，350mg/ml，2周)，最终得到敲低SRSF5并回转CCAR1L细胞株。在病毒感染时可加入polybrene(8ug/ml)提高感染效率。

[0137] (2)敲低SRSF5并回转CCAR1S细胞株的构建

[0138] 将序列4所示CCAR1S全长序列插入pQCXIH hygro逆转录病毒载体的NotI和XhoI位点间，得到稳定过表达CCAR1S的表达质粒。

[0139] 将上述步骤(1)中的稳定过表达CCAR1L的表达质粒替换为稳定过表达CCAR1S的表达质粒，且保持其余步骤不变，得到敲低SRSF5并回转CCAR1S细胞株。

[0140] 二、裸鼠成瘤实验

[0141] 将试验用Balb/c裸鼠(雄性，5-6周龄大小，18.0±2.0g)饲养于SPF级动物房，待小鼠适应SPF环境后，利用随机分组的原则分成两组，根据处理方式不同分为如下各组：

[0142] 1、对照组

[0143] 将步骤一的1中制备的对照细胞(3×106/ml)和Matrigel(BD Bioscience，#356234)按照体积比为0.25：1的比例混匀，得到对照体系；并将100ul对照体系皮下注射于裸鼠的腋窝处。

[0144] 2、敲低SRSF5组

[0145] 将步骤一的1中制备的敲低SRSF5的稳定细胞系#1(3×106/ml)和Matrigel按照体积比为0.25：1的比例混匀，得到敲低SRSF5体系；并将100ul敲低SRSF5体系皮下注射于裸鼠的腋窝处。

[0146] 3、敲低SRSF5组并回转CCAR1L组

[0147] 将步骤一的2中制备的敲低SRSF5并回转CCAR1L细胞株(3×106/ml)和Matrigel按照体积比为0.25：1的比例混匀，得到敲低SRSF5并回转CCAR1L体系；并将100ul敲低SRSF5并回转CCAR1L体系皮下注射于裸鼠的腋窝处。

[0148] 4、敲低SRSF5组并回转CCAR1S组

[0149] 将步骤一的2中制备的敲低SRSF5并回转CCAR1S细胞株(3×106/ml)和Matrigel按照体积比为0.25：1的比例混匀，得到敲低SRSF5并回转CCAR1S体系；并将100ul敲低SRSF5并回转CCAR1S体系皮下注射于裸鼠的腋窝处。

[0150] 注射后7-10天对照组出现肿瘤，利用游标卡尺每周两次对肿瘤大小进行测量，肿瘤的大小计算方法遵循以下公式L×W2×0.52(L代表最大直径，W代表最小直径)。35-40天后，裸鼠麻醉处死，随后切割实体瘤进行称重和记录，并利用多聚甲醛进行固定，后续HE染色确定肿瘤的组织形态以区分癌和癌旁组织。肿瘤组织通过福尔马林固定16小时后，按照经典石蜡包埋法进行处理并进行石蜡切片，随后利用TUNEL实验检测肿瘤细胞原位凋亡情况，相关实验方法参照Promega DeadEndTMColorimetric TUNEL System试剂盒说明书。上述石蜡切片步骤：

[0151] 1)将固定好的肿瘤组织修块后放入包埋盒中，按照70％、80％、90％I、90％II、95％I、95％II，100％I、100％II梯度脱水，时间分别为10min，10min，8min，8min，5min，
5min，3min，3min；

[0152] 2)在二甲苯中透明化组织：二甲苯I、II各10min；

[0153] 3)浸蜡：蜡I、蜡II各20min；

[0154] 4)利用Leica石蜡包埋机进行包埋，按照蜡-组织-蜡的步骤；

[0155] 5)按照3.5μm厚度进行切片；

[0156] 6)经过展片机展平并在烘片机上拷片6小时以上，长期保存可置于4℃，使用前在60℃过夜烘干。

[0157] 肿瘤体积和重量的检测结果表明：和对照组相比，敲低SRSF5组的裸鼠肿瘤的体积明显减小(图8)，重量明显减轻(图9)。TUNEL实验检测结果表明：肿瘤细胞原位凋亡比例明显增加(图10)。进一步，在敲低SRSF5的水平基础上回转CCAR1L和CCAR1S发现，当且仅当回转CCAR1S后，裸鼠成瘤体积变大(图11)，重量增加(图12)，肿瘤细胞原位凋亡比例减少(图13)。说明SRSF5蛋白是通过调控细胞中CCAR1可变剪接产物含量进而调控肿瘤细胞生长。