北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法

摘要

本发明公开了北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，该方法利用高速逆流色谱分离纯化北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯。该方法利用高速逆流色谱仪对红球菌B7740所产类异戊二烯物质进行有效的分离纯化，得到三种稀有海洋来源类胡萝卜素，并用高精度质谱对三种稀有海洋来源类胡萝卜素进一步鉴定。

权利要求

1.北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，其特征在于：利用高速逆流色谱分离纯化北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯，所述的类异戊二烯为synechoxanthin、chlorobactene和isorenieratene。

2.根据权利要求1所述的北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

2.1、按正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:6-8:2-4配制溶剂体系，充分摇匀，待溶剂体系开始分层，静置分层并分离，得上层液和下层液，上层液作为固定相，下层液作为流动相；

2.2、将类异戊二烯提取液用部分下层液溶解，配制成100-1000ug/ml样品溶液；

2.3、打开恒温水浴，将温度设置为18-22℃；

2.4、用无水乙醇清洗泵中的螺旋柱管；

2.5、泵入固定相；

2.6、平衡两相溶剂体系：

打开紫外检测器，待预热完成后，将波长设置为450nm；正转转动主机，同时以10ml/min流速泵入流动相，待检测器出口端流出流动相且紫外信号稳定不变时，则溶剂体系已平衡；

2.7、进样；

2.8、接收流分。

3.根据权利要求2所述的北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，其特征在于：正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:8:2、10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25。

说明书

北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法

技术领域

[0001] 本发明属于红球菌B7740产类异戊二烯分离纯化的技术领域，具体涉及北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法。

背景技术

[0002] 红球菌属是一类广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，在土壤、海底沉积物和食草动物粪便中含量丰富，且多数为营腐生生活。红球菌属(Rhodococcus sp.)是在1891年由Zoof建立的，从建立至今，分类地位一直不确定。目前，红球菌归属于放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌亚纲(Actinobacteridae)，放线菌目(Actinomycetales)，棒杆菌亚目(Croynebacterineae)，诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，红球菌属(Rhodococcus)。

[0003] 目前，国内外对红平红球菌的研究较多，主要集中在其生物降解能力研究和分子学研究，而对红球菌产类异戊二烯物质研究较少，尤其对极地海洋来源的红球菌B7740产类异戊二烯物质的鉴定与研究尚十分匮乏，红球菌B7740是我国北极科考队于第三次北极科考时从B77站点20米的表层海水中发现，对于该菌所产物质的纯化尚未有任何文献报道。红球菌B7740产类胡萝卜素因该微生物独特的代谢通路，与常见高等植物来源类胡萝卜素相比，结构相差较大，结构种类不单一，其独特的结构不仅赋予了它独特的活性，也增大了其纯化的难度。

发明内容

[0004] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，该分离方法操作方便快捷，能对红球菌B7740所产类异戊二烯物质进行有效的分离纯化。

[0005] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

[0006] 北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，利用高速逆流色谱分离纯化北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯。

[0007] 北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化方法，包括如下步骤：

[0008] 1、按正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:6-8:2-4配制溶剂体系，充分摇匀，待溶剂体系开始分层，静置分层并分离，得上层液和下层液，上层液作为固定相，下层液作为流动相；

[0009] 2、将类异戊二烯提取液用部分下层液溶解，配制成100-1000ug/ml样品溶液；

[0010] 3、打开恒温水浴，将温度设置为18-22℃；

[0011] 4、用无水乙醇清洗泵中的螺旋柱管；

[0012] 5、泵入固定相；

[0013] 6、平衡两相溶剂体系：

[0014] 打开紫外检测器，待预热完成后，将波长设置为450nm；正转转动主机，同时以10ml/min流速泵入流动相，待检测器出口端流出流动相且紫外信号稳定不变时，则溶剂体系已基本平衡；

[0015] 7、进样；

[0016] 8、接收流分。

[0017] 进一步，正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:8:2、10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25。

[0018] 与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

[0019] 本发明利用TBE-300C高速逆流色谱仪对红球菌B7740所产类异戊二烯物质进行有效的分离纯化，得到三种稀有海洋来源类胡萝卜素。此三种北极海洋来源的稀有类胡萝卜素，具有与常见高等植物来源类胡萝卜素完全不同的端基，该三种类胡萝卜素经鉴定为芳香类胡萝卜素，独特的结构赋予其独特的活性，具有应用于食品、药品、化妆品的价值，并因为其独特的天然来源，比人工合成的类胡萝卜素更易受市场青睐。

[0020] 说明书附图

[0021] 图1为实施例1中红球菌B7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:8:2时)的HSCCC色谱图。

[0022] 图2为实施例1中红球菌B7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.5:3.5时)的HSCCC色谱图。

[0023] 图3为实施例1中红球菌B7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:7:3时)的HSCCC色谱图。

[0024] 图4为实施例1中红球菌B7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.75:3.25时)的HSCCC色谱图。

[0025] 图5为实施例1中分离产物一的高精度质谱图。

[0026] 图6为实施例1中分离产物二的高精度质谱图。

[0027] 图7为实施例1中分离产物三的高精度质谱图。

具体实施方式

[0028] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

[0029] 北极海洋红球菌B7740，是发明人于2008年7-9月中国第三次北极科学考察期间，用Seabird911Plus CTD系统从北冰洋B77站点(146°49.28′W，76°58.08′N)25m深的表层海水样品中分离得到，宁波市微生物与环境工程重点实验室通过16S rDNA序列Blast在线比对，判定该菌为红球菌属。

[0030] 实施例1

[0031] 北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的分离纯化实验

[0032] 1、实验材料

[0033] 1.1、实验试剂

[0034] 溶菌酶(20000U/mg)购自国药集团化学试剂有限公司，醋酸锌、氯化钠、甲醇和二氯甲烷购自国药集团化学试剂有限公司，正己烷、二氯甲烷购自国药集团化学试剂有限公司；色谱级甲醇、乙腈购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；色谱级甲基叔丁基醚购自上海阿拉丁生化科技技股有限公司。

[0035] 1.2、实验仪器

[0036] TBE-300C高速逆流色谱仪购自上海同田生物科技有限公司；2695高效液相色谱仪购自美国Waters公司；LTQ-Orbitrap Elite质谱仪购自赛默飞世尔科技(美国)有限公司。

[0037] 1.3、实验原料

[0038] 按照中国专利(一种红球菌B7740类胡萝卜素的微胶囊制备方法、201510016005.8)公开的方法制备类异戊二烯提取液：

[0039] 称取0.8g北极海洋红球菌B7740冻干菌粉(浙江万里学院提供)置于离心管中，加入16ml溶菌酶溶液(1mg/ml)，置于37℃水浴中，避光放置1h，然后加入24ml饱和醋酸锌溶液使已破壁的红球菌沉降，将该离心管于7000rpm、4℃下离心10min，丢弃上清液，再将64ml混合有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝4:1，体积比)加入到红球菌沉淀中，用玻璃棒搅拌均匀，离心，分离出上清液，继续向离心管中加入混合有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝4:1，体积比)，如此反复提取2-3次，合并上清液，得到类异戊二烯提取液。

[0040] 2、实验方法：

[0041] 2.1、用1000ml分离漏斗按正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:8:2配制2L溶剂体系，充分振荡摇匀，待溶剂体系开始分层，在室温(25℃)下静置15min进行分层，分离，得上层液(固定相)和下层液(流动相)，将上层液和下层液分别放入蓝盖瓶中，超声排气20min，备用；

[0042] 2.2、将类异戊二烯提取液用20ml下层液溶解，配制成300ug/ml样品溶液；

[0043] 2.3、打开恒温水浴，将温度设置为20℃；

[0044] 2.4、用无水乙醇清洗泵中的螺旋柱管：

[0045] 以50ml/min流速泵入无水乙醇，泵入1min后停止，再打开气泵，排气5min，将螺旋柱管中的残留液体吹干；重复此过程3次(最后一次排气1h)；

[0046] 2.5、泵入固定相：

[0047] 以50ml/min流速泵入固定相，待检测器出口端流出约30-50ml固定相时，停泵；

[0048] 2.6、平衡两相溶剂体系：

[0049] 打开紫外检测器，待预热完成后，将波长设置为450nm；正转转动主机(REV为反转，FWD为正转)，转速为800r/min，同时以10ml/min流速泵入流动相，待检测器出口端流出流动相且紫外信号稳定不变时，则溶剂体系已基本平衡；

[0050] 2.7、进样；

[0051] 将进样六通阀切至到load，在装样柱的注射器中倒入样品溶液20ml，推排气泡后，将样液吸入到进样圈中，直至样液剩余1ml为止，再将load切换至inject，并将检测器、工作站调零，重新记录；

[0052] 2.8、接收流分：

[0053] 待工作站开始记录，按色谱出峰的信号的顺序收集流分；

[0054] 2.9、清洗HSCCC仪器：

[0055] 断开主机与泵的连接，关闭主机，以50ml/min流速将无水乙醇泵入，冲洗螺旋柱管，泵入1min后停止，再将主机的进口与气泵的气管连接，打开气泵，排气5min，将螺旋柱管中的残留液体吹干；重复此过程3次(最后一次排气30min)；

[0056] 2.10、将收集的各分流用旋转蒸发仪旋干，再用甲基叔丁基醚复溶，经氮气吹干后，得到各待测流分样品，放置于冰箱负一层进行低温、避光贮藏；

[0057] 2.11、重复步骤2.1-2.10三次，每次重复只改变正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比，正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比分别变为10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25，其他操作不变。

[0058] 3、一级检测：

[0059] 将每次操作所得的各待测样品用高效液相色谱和紫外吸收进行检测：

[0060] 高效液相色谱检测条件如下：

[0061] 色谱柱YMCC30(5um×4.6mm×150mm)，柱温25℃，紫外吸收检测器，检测波长450nm，进样量10uL；

[0062] 流动相：流动相A为甲醇，B为甲基叔丁基醚，流速：1ml/min.

[0063] 洗脱程序：

[0064] 第一阶段：采用流动相A和流动相B的混合液洗脱30分钟，其中流动相A的体积百分含量由95变为70％，流动相B的体积百分含量由5变为30％；

[0065] 第二阶段：采用流动相A和流动相B的混合液洗脱20分钟，其中流动相A的体积百分含量由70变为50％，流动相B的体积百分含量由30变为50％；

[0066] 第三阶段：采用流动相A和流动相B的混合液洗脱10分钟，其中流动相A的体积百分含量由50变为95％，流动相B的体积百分含量由50变为5％。

[0067] 4、一级实验结果：

[0068] 4.1、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:8:2时的分离效果[0069] 溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:8:2的条件下，类异戊二烯提取液的HSCCC色谱图如图1所示，由图1可知，出现了三个峰，三个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二和峰三。

[0070] 峰一、峰二和峰三所对应的待测流分样品的HPLC和紫外吸收检测结果如表1所示：

[0071] 表1类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:8:2时分离产物的HPLC和紫外吸收检测结果

[0072]

[0073] 从表1可以看出，峰一的分离效果不好，含有三种主要成分，峰二的分离效果虽然好一些，纯度达到了80.33％，但杂峰太多，峰三的分离效果最好，纯度高达95.21％，其最大紫外吸收波长为452nm。

[0074] 4.2、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.5:3.5时的分离效果[0075] 溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:6.5:3.5的条件下，类异戊二烯提取液的HSCCC色谱图如图2所示，由图2可知，出现了八个峰，八个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六、峰七和峰八。

[0076] 峰一-峰八所对应的待测流分样品的HPLC和紫外吸收检测结果如表2所示：

[0077] 表2类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.5:3.5时分离产物的HPLC和紫外吸收检测结果

[0078]HSCCC分离产物 HPLC出峰时间 HPLC出峰面积 HPLC出峰面积％ 紫外吸收λmax峰一 乱，峰杂 ＿ ＿  
峰二 乱，峰杂 ＿ ＿  
峰三 22.0 361307 81.62 274,452,468
峰四 26.8 1791658 56.79 434,458,484
峰五 32.2 4562003 93.41 282,452,476
峰六 29.5 831778 93.92 284,434,460,486
峰七 乱，峰杂 ＿ ＿  
峰八 24.1 2537273 80.36 250,274

[0079] 由表2可知，峰一、峰二和峰七的分离效果很差，全是杂峰，峰三的纯度达到了81.62％，但还有一些杂峰，分离效果一般般，峰四的分离效果也不好，纯度只有56.79％，杂峰太多，峰五的分离效果非常好，纯度达到了93.41％，其最大紫外吸收波长为452nm，峰六的纯度虽然达到了93.41％，但存在拖尾现象，峰八虽然纯度达到了80.36％，但没有出现单峰，两个峰连在了一起，分离效果也一般。

[0080] 4.3、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:7:3时的分离效果[0081] 溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:7:3的条件下，类异戊二烯提取液的HSCCC色谱图如图3所示，由图3可知，出现了四个峰，四个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二、峰三和峰四，同时标出间一(峰一之前的曲线部分)、间二(峰三和峰四之间的曲线部分)和间三(峰四之后的曲线部分)。

[0082] 峰一-峰四以及间一-三所对应的待测流分样品的HPLC和紫外吸收检测结果如表3所示：

[0083] 表3类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:7:3时分离产物的HPLC和紫外吸收检测结果

[0084]HSCCC分离产物 HPLC出峰时间 HPLC出峰面积 HPLC出峰面积％ 紫外吸收λmax间接液一 ＿ ＿ ＿  
峰一 22.0 18926349 92.82 274,452,468
峰二 ＿ ＿ ＿  
峰三 26.8 2834863 85.1 434,458,484
间接液二 32.2 1235196 83.79 282,452,476
峰四 32.2 3291241 78.96 282,452,476
间接液三 29.5 1996169 91.79 284,434,460,486

[0085] 从表3可知，间接液一、峰二的分离效果很差，峰一和间接液三的分离效果比较好，纯度分别达到了92.82％、91.79％，其最大紫外吸收波长分别为452nm、460nm，峰四的纯度虽然纯度达到了78.96％，但没有单峰出现，两峰连在了一起，分离效果一般，峰三的纯度虽然达到了85.1％，但没有单峰出现，两峰连在了一起，分离效果不好，间接液二虽然达到了83.79％，但存在拖尾现象，而且有较多小杂峰。

[0086] 4.4、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.75:3.25时的分离效果[0087] 溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:6.75:3.25的条件下，类异戊二烯提取液的HSCCC色谱图如图4所示，由图4可知，出现了六个峰，六个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六。

[0088] 峰一-峰六所对应的待测流分样品的HPLC和紫外吸收检测结果如表4所示：

[0089] 表4类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.75:3.25时分离产物的HPLC和紫外吸收检测结果

[0090]HSCCC分离产物 HPLC出峰时间 HPLC出峰面积 HPLC出峰面积％ 紫外吸收λmax峰一 22.0 3262502 72.56 274,452,468
峰二 24.1 1441997 62.6 250,274
峰三 32.3 9490917 92.87 282,452,476
峰四 29.5 4359151 96.39 284,434,460,486
峰五 乱，峰杂 ＿ ＿  
峰六 26.8 7564664 89.7 434,458,484

[0091] 从表4可知，峰一、峰二的分离效果一般，纯度分别只有72.56％和62.6％，峰三和峰四的分离效果较好，纯度分别达到了92.87％和96.39％，其最大紫外吸收波长分别为452nm、460nm，峰五的分离效果很差，峰六的分离效果较好，纯度为89.7％，其最大紫外吸收波长为458nm，经分析，峰六为β-胡萝卜素。

[0092] 5、二级检测

[0093] 取分离产物一(4.3中峰一对应的流分)、分离产物二(4.4中峰四对应的流分)、分离产物三(4.1中峰三对应的流分)进行高精度质谱分析：

[0094] 质谱条件：

[0095] ESI离子源，扫描范围m/z400-700，分辨率60000，离子阱DDA模式，运用碰撞诱导解离(CID)和35％的碰撞能量，扫描时选取3个信号最强的离子进行串联质谱分析，加热温度250℃，毛细管温度350℃，鞘气流速：35，辅助气体流速：15，喷雾电压：3.5kV，S-lens射频水平60％，样品溶解于色谱甲醇中，进样量2ul，流速0.2ml/min。

[0096] 6、二级实验结果：

[0097] 如图5所示，分离产物一在高精度质谱中其分子离子峰为m/z＝589.3283，即为其实际测量高精度加氢分子量值，其与理论值的偏差见表5，其误差为4.9ppm以内，鉴定分离产物一为synechoxanthin。

[0098] 如图6所示，分离产物二在高精度质谱中其分子离子峰为m/z＝533.4095，即为其实际测量高精度加氢分子量值，其与理论值的偏差见表5，其误差为8.8ppm，鉴定分离产物二为chlorobactene。

[0099] 如图7所示，分离产物三在高精度质谱中其分子离子峰为m/z＝529.3835，即为其实际测量高精度加氢分子量值，其与理论值的偏差见表5，其误差为1.1ppm，鉴定21号峰为isorenieratene。

[0100] 分离产物一-三的高精度质谱数据如图5所示：

[0101]product Formula Calculated mass Error(ppm) Experimental mass
分离产物一 C40H4404+H+ 589.3312 4.9 589.3283
+
分离产物二 C40H52+H 533.4142 8.8 533.4095
分离产物三 C40H48+H+ 529.3829 1.1 529.3835