暹罗芽孢杆菌B-3及其应用

摘要

本发明公开了暹罗芽孢杆菌B‑3及其应用。本发明公开的暹罗芽孢杆菌B‑3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13753。实验证明，培养暹罗芽孢杆菌B‑3得到的菌剂可以抑制导致马铃薯疮痂病的疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、酸疮痂病链霉菌(Streptomyces acidiscabies)和/或微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)的生长，表明，本发明的暹罗芽孢杆菌B‑3及相关菌剂可以用来防治马铃薯疮痂病。

权利要求

1.暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）B-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13753。

2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）B-3。

3.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）B-3或权利要求2所述的菌剂的下述任一应用：a1）在制备抑制链霉菌产品中的应用；

a2）在抑制链霉菌中的应用；

a3）在制备防治链霉菌所致病害产品中的应用；

a4）在防治链霉菌所致病害中的应用;

所述链霉菌为疮痂病链霉菌（Streptomyces  scabies）、酸疮痂病链霉菌（Streptomyces acidiscabies）和/或微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）；

所述疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）为疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）CGMCC No.4.76或疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）CGMCC No.4.1765；

所述酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）为酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）CGMCC No.4.1789；

所述微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）为微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）CGMCC No. 4.3598；所述链霉菌所致病害为马铃薯疮痂病。

4.含有权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）B-3或权利要求2所述菌剂的产品；所述产品的功能为下述b1）或b2）：b1）抑制链霉菌；

b2）防治链霉菌所致病害；

所述链霉菌为疮痂病链霉菌（Streptomyces  scabies）、酸疮痂病链霉菌（Streptomyces acidiscabies）和/或微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）；

所述疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）为疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）CGMCC No.4.76或疮痂病链霉菌（Streptomyces scabies）CGMCC No.4.1765；

所述酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）为酸疮痂链霉菌（Streptomyces acidiscabies）CGMCC No.4.1789；

所述微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）为微白黄链霉菌（Streptomyces albidoflavus）CGMCC No. 4.3598；

所述链霉菌所致病害为马铃薯疮痂病。

说明书

暹罗芽孢杆菌B-3及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域中，暹罗芽孢杆菌B-3及其应用。

背景技术

[0002] 马铃薯疮痂病是典型的土传病害，在我国各马铃薯产区均有发生。主要表现为马铃薯块茎表面出现近圆形至不定形木栓化疮痂状淡褐色病斑或斑块，手摸质感粗糙。马铃薯疮痂病一般有网纹状病斑和裂口状病斑两种发病症状。通常情况下，网纹状病斑和裂口状病斑仅限于皮层，发病严重时病斑连片，不耐贮藏，且病薯外观不雅，商品品级大为下降，很大程度上降低薯块的品质和经济价值，而且带病种薯可随调运加速病害的传播。对我国的马铃薯的生产构成了严重威胁，引起广泛关注。近些年来，随着发病面积和发病程度的增大，引起的经济损失也非常可观。

[0003] 国外的研究者己经对马铃薯疮痂病的病原菌进行了较为深入的研究，现已明确该病由多种链霉菌引起。而且近年来不断有新的疮痂致病种被报道。研究者们对该病的防治方法也进行了许多有益的探索。虽有很多种方法，但还是没有非常理想的应用于田间防治化学或生物药剂能够很好的防治马铃薯疮痂病。目前，马铃薯疮痂病主要以化学药剂防治为主。然而长期使用化学药剂，一方面病原菌容易产生抗药性，从而防治效果大大下降；另一方面容易造成严重的环境污染，危及人畜健康。因此，迫切需要对马铃薯疮痂病进行有效生物防治。

[0004] 现有研究表明，引起马铃薯疮痂病的病原菌主要为疮痂病链霉菌，另外微白黄链霉菌也可引发马铃薯疮痂病。疮痂病链霉菌属于条件致病菌，即在土壤环境中性或偏碱性条件下容易生长和引起马铃薯病害，而在偏酸性土壤环境中则很少出现。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何防治链霉菌引发的疮痂病。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)菌株，其名称为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3。

[0007] 本发明所提供的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.13753。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂。所述菌剂含有所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3。

[0009] 所述菌剂的活性成分可为所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3。

[0010] 所述菌剂可为用于抑制链霉菌的菌剂。所述链霉菌为引起疮痂病的链霉菌。所述引起疮痂病的链霉菌可为疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、酸疮痂病链霉菌(Streptomyces acidiscabies)和/或微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)。所述疮痂病可为马铃薯疮痂病。

[0011] 在本发明的一个实施例中，所述疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)为疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)CGMCC No.4.76和疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)CGMCC No.4.1765。

[0012] 在本发明的一个实施例中，所述酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)为酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)CGMCC No.4.1789。

[0013] 在本发明的一个实施例中，所述微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC No.4.3598。

[0014] 上述菌剂的制备方法可包括：培养所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3，得到所述菌剂。

[0015] 所述培养利用细菌培养基进行培养。所述细菌培养基具体可为牛肉汁培养基。所述牛肉汁培养基可为利用蛋白胨、牛肉膏、氯化钠制备得到的培养基。所述牛肉汁培养基中蛋白胨、牛肉膏和氯化钠的浓度分别可为10.0g/L、3.0g/L、5.0g/L。

[0016] 上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

[0017] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

[0018] 为解决上述技术问题，本发明还提供了暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或所述菌剂的下述任一应用：

[0019] a1)在制备抑制链霉菌产品中的应用；

[0020] a2)在抑制链霉菌中的应用；

[0021] a3)在制备防治链霉菌所致病害产品中的应用；

[0022] a4)在防治链霉菌所致病害中的应用。

[0023] 为解决上述技术问题，本发明还提供了含有暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或所述菌剂的产品，所述产品的功能为下述b1)或b2)：

[0024] b1)抑制链霉菌；

[0025] b2)防治链霉菌所致病害。

[0026] 所述产品的活性成分可为所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)或所述菌剂。

[0027] 本发明中，所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus  siamensis)可为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3。

[0028] 所述链霉菌可为下述A1)或A2)或A3)：

[0029] A1)引起疮痂病的链霉菌；

[0030] A2)引起马铃薯疮痂病的链霉菌；

[0031] A2)疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、酸疮痂病链霉菌(Streptomyces acidiscabies)和/或微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)。

[0032] 所述链霉菌所致病害可为下述B1)或B2)：

[0033] B1)疮痂病；

[0034] B2)马铃薯疮痂病。

[0035] 实验证明，本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3具有抑制引起疮痂病的链霉菌的功能，具体可以抑制疮痂病链霉菌、酸疮痂病链霉菌和微白黄链霉菌：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3对疮痂病链霉菌4.76的抑菌圈的直径约为18mm，对疮痂病链霉菌4.1765的抑菌圈的直径约为22mm，对酸疮痂链霉菌4.1789的抑菌圈的直径约为17mm，对微白黄链霉菌4.3598的抑菌圈的直径约为11mm。另外，本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3在pH值为4.0-9.0均可以生长，说明其在偏碱和偏酸环境中均可用于抑制引起疮痂病的链霉菌。表明，本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3可以用于防治引起疮痂病的链霉菌所致病害，并且不受环境pH值的影响。

[0036] 生物材料保藏说明

[0037] 生物材料的分类命名：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

[0038] 生物材料的菌株编号：B-3

[0039] 生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心[0040] 生物材料的保藏单位简称：CGMCC

[0041] 生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

[0042] 生物材料的保藏日期：2017年03月14日

[0043] 生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13753

附图说明

[0044] 图1为暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76的抑菌效果。

[0045] 图2为暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.1765的抑菌效果。

[0046] 图3为暹罗芽孢杆菌B-3对酸疮痂链霉菌4.1789的抑菌效果。

[0047] 图4为暹罗芽孢杆菌B-3对微白黄链霉菌4.3598的抑菌效果。

[0048] 图5为暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76、4.1765以及酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598的抑菌效果。

[0049] 图6为在共培养时暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76、4.1765以及酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598的抑菌效果。

具体实施方式

[0050] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0051] 牛肉汁液体培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g和氯化钠5.0g溶于1L蒸馏水，调节pH值至7.0；然后121℃灭菌20min。

[0052] 牛肉汁固体培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g和琼脂15.0g溶于1L蒸馏水，调节pH值至7.0；然后121℃灭菌20min。

[0053] 牛肉汁固体平板：将20mL温度为55℃左右的牛肉汁固体培养基倒入培养皿，冷却后即为牛肉汁固体平板。

[0054] 燕麦固体平板：取燕麦20g，加入蒸馏水1L，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向所述滤液中加入琼脂粉20g，并用蒸馏水定容至1L，调节pH值至7.2-7.4；然后121℃灭菌20min。将20mL温度为55℃左右的燕麦培养基倒入培养皿，冷却后即为燕麦固体平板。

[0055] ISP-2培养基(g/L)：酵母提取物4g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，PH7.3，然后115℃灭菌15min。

[0056] ISP-2固体平板：将20mL温度为55℃左右的ISP-2固体培养基倒入培养皿，冷却后即为ISP-2固体平板。

[0057] 马铃薯液体培养基的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加入1.0L蒸馏水，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向所述滤液中加入葡萄糖20.0g，并用蒸馏水定容至1.0L，pH值自然，然后115℃灭菌15min。

[0058] 马铃薯液体培养基1的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加入1.0L蒸馏水，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向所述滤液中加入葡萄糖20.0g，并用蒸馏水定容至1.0L，调节pH值至4.0；然后115℃灭菌15min。

[0059] 马铃薯液体培养基2：将马铃薯液体培养基1的制备方法中的“调节pH值至4.0”替换为“调节pH值至5.0”，其它步骤均相同。

[0060] 马铃薯液体培养基3：将马铃薯液体培养基1的制备方法中的“调节pH值至4.0”替换为“调节pH值至6.0”，其它步骤均相同。

[0061] 马铃薯液体培养基4：将马铃薯液体培养基1的制备方法中的“调节pH值至4.0”替换为“调节pH值至7.0”，其它步骤均相同。

[0062] 马铃薯液体培养基5：将马铃薯液体培养基1的制备方法中的“调节pH值至4.0”替换为“调节pH值至8.0”，其它步骤均相同。

[0063] 马铃薯液体培养基6：将马铃薯液体培养基1的制备方法中的“调节pH值至4.0”替换为“调节pH值至9.0”，其它步骤均相同。

[0064] 疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)CGMCC  No.4.76、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)CGMCC No.4.1765、酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)CGMCC No.4.1789和微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC No.4.3598均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编：100101)，菌种目录编号依次为4.76、4.1765、4.1789和4.3598，公众可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得。疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)CGMCC No.4.76在下文中简称疮痂病链霉菌4.76。疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)CGMCC No.4.1765在下文中简称疮痂病链霉菌4.1765。酸疮痂病链霉菌(Streptomyces acidiscabies)CGMCC No.4.1789在下文中简称酸疮痂病链霉菌4.1789。微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC No.4.3598在下文中简称微白黄链霉菌
4.3598。

[0065] 实施例1、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3 CGMCC No.13753的分离、鉴定和保藏

[0066] 一、分离

[0067] 1、土壤样品的处理

[0068] (1)在90mL无菌水中加入10g土壤样品(采自宁夏回族自治区平吉堡种植马铃薯的土壤)和适量玻璃珠，振荡10min，静置30s，制成土壤原液(此时稀释度记为10-1)。吸取1mL土壤原液的上清液加入盛有9mL无菌水的试管中充分混匀(此时稀释度为10-2)，然后从此试管中吸取1mL加入到另一盛有9mL无菌水的试管中混合均匀，以此类推制成稀释液甲(稀释度为10-3)和稀释液乙(稀释度为10-4)。

[0069] 2、取疮痂病链霉菌4.76，接种于燕麦固体平板，28℃静置培养10d；然后向燕麦固体平板上加入适量无菌水，用无菌接种铲刮取疮痂病链霉菌4.76的孢子，获得病原菌悬液1(疮痂病链霉菌4.76的浓度约为1.0×108cfu/mL)。

[0070] 3、完成步骤1和步骤2后，将50μL稀释液乙和50μL病原菌悬液1混合，然后均匀涂布在牛肉汁固体平板上，30℃静置培养2d。将可以形成抑菌圈的菌落在牛肉汁固体平板上进行菌种纯化。

[0071] 将筛选到的一株细菌命名为细菌B-3。

[0072] 二、鉴定

[0073] 1、形态学鉴定

[0074] 将步骤一得到的细菌B-3接种至牛肉汁固体培养基上，30℃培养，2d后观察单菌落的形态。

[0075] 结果表明，细菌B-3的菌落圆形，表面扁平，边缘微突起，呈白色，菌落直径为1-3mm。

[0076] 2、16S rDNA序列同源性分析

[0077] 细菌B-3的16S rDNA如序列表中的序列1所示。

[0078] 经过比对，细菌B-3与暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)的同源性最高，达到100％。

[0079] 因此，细菌B-3鉴定为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。

[0080] 三、保藏

[0081] 步骤一分离的细菌B-3已于2017年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13753。细菌B-3的全称为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B-3CGMCC No.13753，简称为暹罗芽孢杆菌B-3。

[0082] 实施例2、暹罗芽孢杆菌B-3的扩繁

[0083] 实施例1的暹罗芽孢杆菌B-3扩繁的具体步骤如下：

[0084] 1、将暹罗芽孢杆菌B-3在牛肉汁固体培养基上活化三次，然后挑取单菌落接种于装有50mL牛肉汁液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃、200r/min的恒温摇床上培养2d，得到培养液。

[0085] 2、完成步骤1后，取步骤1的培养液，12000r/min离心1min，弃上清，收集沉淀。

[0086] 3、完成步骤2后，取步骤2的沉淀，用50mL无菌水重悬，得到菌悬液(暹罗芽孢杆菌B-3的浓度约为1.0×1011cfu/mL)。

[0087] 实施例3、暹罗芽孢杆菌B-3的抑菌效果

[0088] 检测实施例1的暹罗芽孢杆菌B-3对病菌的抑菌效果，实验重复三次，取平均值。每次实验的具体步骤如下：

[0089] 一、暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76的抑制效果

[0090] 1、取疮痂病链霉菌4.76，接种于燕麦固体平板，28℃静置培养10d。

[0091] 2、完成步骤1后，取所述燕麦固体平板，加入适量无菌水，然后用无菌接种铲刮取所述燕麦固体平板表面的孢子，获得病原菌悬液1(疮痂病链霉菌4.76的浓度约为1.0×108cfu/mL)。

[0092] 3、完成步骤2后，取50μL病原菌悬液1，均匀涂布于ISP-2固体平板。

[0093] 4、完成步骤3后，取步骤3所得涂布有病原菌悬液1的ISP-2固体平板，先在其中心放置直径为5mm的无菌滤纸，然后在所述无菌滤纸上点接10μL实施例2中步骤3获得的菌悬液。30℃静置培养，培养2d后，观察抑菌效果。

[0094] 将步骤4中的暹罗芽孢杆菌B-3菌剂替换为无菌水，其它步骤均不变，作为阴性对照。

[0095] 暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76的抑菌效果见图1。结果表明，点接暹罗芽孢杆菌B-3培养后，有抑菌圈的出现(抑菌圈的直径约为18mm)；而点接无菌水培养后，无抑菌圈的出现。因此，暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76有一定的抑制效果。

[0096] 二、暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.1765的抑制效果

[0097] 按照步骤一的方法，将疮痂病链霉菌4.76替换为疮痂病链霉菌4.1765，其他步骤均不变，得到暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.1765的抑制效果。

[0098] 暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.1765的抑菌效果见图2。结果表明，点接暹罗芽孢杆菌B-3培养后，有抑菌圈的出现(抑菌圈的直径约为22mm)；而点接无菌水培养后，无抑菌圈的出现。因此，暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.1765有一定的抑制效果。

[0099] 三、暹罗芽孢杆菌B-3对酸疮痂链霉菌4.1789的抑制效果

[0100] 按照步骤一的方法，将疮痂病链霉菌4.76替换为酸疮痂链霉菌4.1789，其他步骤均不变，得到暹罗芽孢杆菌B-3对酸疮痂链霉菌4.1789的抑制效果。

[0101] 暹罗芽孢杆菌B-3对酸疮痂链霉菌4.1789的抑菌效果见图3。结果表明，点接暹罗芽孢杆菌B-3培养后，有抑菌圈的出现(抑菌圈的直径约为17mm)；而点接无菌水培养后，无抑菌圈的出现。因此，暹罗芽孢杆菌B-3对酸疮痂链霉菌4.1789有一定的抑制效果。

[0102] 四、暹罗芽孢杆菌B-3对微白黄链霉菌4.3598的抑制效果

[0103] 按照步骤一的方法，将疮痂病链霉菌4.76替换为微白黄链霉菌4.3598，其它步骤均不变，得到暹罗芽孢杆菌B-3对微白黄链霉菌4.3598的抑制效果。

[0104] 暹罗芽孢杆菌B-3对微白黄链霉菌4.3598的抑菌效果见图4。结果表明，点接暹罗芽孢杆菌B-3培养后，有抑菌圈的出现(抑菌圈的直径约为11mm)；而点接无菌水培养后，无抑菌圈的出现。因此，暹罗芽孢杆菌B-3对微白黄链霉菌4.3598有一定的抑制效果。

[0105] 五、暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76、4.1765，酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598的混合抑制效果

[0106] 1、取疮痂病链霉菌4.76，接种于燕麦固体平板，28℃静置培养10d；然后向所述燕麦固体平板上加入适量无菌水，用无菌接种铲刮取疮痂病链霉菌4.76的孢子，获得病原菌悬液1(疮痂病链霉菌4.76的浓度约为1.0×108cfu/mL)。

[0107] 2、取疮痂病链霉菌4.1765，接种于燕麦固体平板，28℃静置培养10d；然后向所述燕麦固体平板上加入适量无菌水，用无菌接种铲刮取疮痂病链霉菌4.1765的孢子，获得病原菌悬液2(疮痂病链霉菌4.1765的浓度约为1.0×108cfu/mL)。

[0108] 3、取酸疮痂链霉菌4.1789，接种于燕麦固体平板，28℃静置培养10d；然后向所述燕麦固体平板上加入适量无菌水，用无菌接种铲刮取酸疮痂链霉菌4.3598的孢子，获得病原菌悬液3(酸疮痂链霉菌4.1789的浓度约为1.0×108cfu/mL)。

[0109] 4、取微白黄链霉菌4.3598，接种于燕麦固体平板，28℃静置培养10d；然后向所述燕麦固体平板上加入适量无菌水，用无菌接种铲刮取微白黄链霉菌4.3598的孢子，获得病原菌悬液4(微白黄链霉菌4.3598的浓度约为1.0×108cfu/mL)。

[0110] 5、完成步骤1、步骤2、步骤3和步骤4后，将病原菌悬液1、病原菌悬液2、病原菌悬液3和病原菌悬液4等体积混合，得到混合菌悬液甲。

[0111] 6、完成步骤5后，取150μL混合菌悬液甲，均匀涂布于ISP-2固体平板。

[0112] 7、完成步骤6后，取步骤6所得涂布有混合菌悬液甲的ISP-2固体平板，先在其中心放置直径为5mm的无菌滤纸，然后在所述无菌滤纸上点接10μL实施例2中步骤3获得的菌悬液。30℃静置培养，培养2d后，观察抑菌效果。

[0113] 将步骤7中的“实施例2中步骤3获得的菌悬液”替换为无菌水，其它步骤均不变，作为阴性对照。

[0114] 暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76、4.1765以及酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598的抑菌效果见图5。结果表明，点接暹罗芽孢杆菌B-3培养后，有抑菌圈的出现(抑菌圈的直径约为11mm)；而点接无菌水培养后，无抑菌圈的出现。因此，暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76、4.1765以及酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598组成的混合菌有一定的抑制效果。

[0115] 五、共培养抑菌效果

[0116] 1、同步骤四中1。

[0117] 2、同步骤四中2。

[0118] 3、同步骤四中3。

[0119] 4、同步骤四中4。

[0120] 5、完成步骤1、步骤2、步骤3和步骤4后，将50μL病原菌悬液1、50μL病原菌悬液2、50μL病原菌悬液3、50μL病原菌悬液4和10μL实施例2中步骤3获得的菌悬液混合，得到混合菌悬液乙。

[0121] 6、完成步骤5后，取混合菌悬液乙，均匀涂布于ISP-2固体平板。30℃静置培养，培养2d后，观察抑菌效果。

[0122] 共培养抑菌效果见图6。结果表明，共培养的过程中，仅有暹罗芽孢杆菌B-3生长，而疮痂病链霉菌4.76、4.1765，酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598没有生长的迹象。因此，暹罗芽孢杆菌B-3对疮痂病链霉菌4.76、4.1765，酸疮痂病链霉菌4.1789和微白黄链霉菌4.3598均有抑制效果。

[0123] 实施例4、暹罗芽孢杆菌B-3的pH值生长范围

[0124] 1、将实施例1的暹罗芽孢杆菌B-3在牛肉汁固体培养基上活化三次，然后挑取单菌落接种于5mL马铃薯液体培养基中，30℃、200r/min的恒温摇床上培养1d，得到初始菌液。将初始菌液接种(接种量为2％(体积百分比))至装有50mL马铃薯液体培养基1的250mL锥形瓶中，30℃、200r/min的恒温摇床上培养2d，得到培养液。

[0125] 2、完成步骤1后，取所述培养液，检测其在600nm波长处的吸光值。

[0126] 结果表明，所述培养液在600nm波长处的吸光值为3.75。可见，暹罗芽孢杆菌B-3在马铃薯液体培养基1中的生长情况良好。

[0127] 按照上述步骤，将马铃薯液体培养基1分别替换为马铃薯液体培养基2、马铃薯液体培养基3、马铃薯液体培养基4、马铃薯液体培养基5和马铃薯液体培养基6，得到的培养液在600nm波长处的吸光值依次为4.21、4.17、4.16、4.10和3.96。可见，暹罗芽孢杆菌B-3在马铃薯液体培养基1、马铃薯液体培养基2、马铃薯液体培养基3、马铃薯液体培养基4、马铃薯液体培养基5和马铃薯液体培养基6中的生长情况良好且基本一致。

[0128] 上述结果表明，暹罗芽孢杆菌B-3的pH值生长范围为4.0-9.0。