花楸树EST-SSR标记、其引物对及应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种花楸树EST‑SSR标记、其引物对及应用。这些分子标记的引物对可用于鉴定等位基因多态性，鉴定相同或相关的植物，区分植物及研究种群中的遗传多样性。分子标记也可用于使用统计学方法的遗传和表型研究，例如，连锁分析、QTL定位、系谱确证、群体遗传多态性研究、连锁不平衡等。所述信息可用于植物特异性状的鉴定和/或新品种分子身份证构建。

权利要求

1.鉴定植物样品基因型的方法，包括：

1）、提取所述植物样品的DNA；

2）、用选自下列的至少一个引物对扩增至少一种EST-SSR标记：SEQ ID NO: 1和2；SEQ ID NO: 3和4；SEQ ID NO: 5和6；SEQ ID NO: 7和8；SEQ ID NO: 9和10；SEQ ID NO: 11和

12；SEQ ID NO: 13和14；SEQ ID NO: 15和16；SEQ ID NO: 17和18；SEQ ID NO: 19和20；

SEQ ID NO: 21和22；SEQ ID NO: 23和24；SEQ ID NO: 25和26；SEQ ID NO: 27和28；SEQ ID NO: 29和30；及

3）、鉴定所述植物样品中的至少一种多态等位基因；

所述植物选自花楸树（S. pohuashanensis）。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤2）包括用对应引物对扩增2种或更多EST-SSR标记。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中步骤2）包括用对应引物对扩增15种EST-SSR标记。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，用所述引物对扩增至少一种EST-SSR标记时，除SEQ ID NO: 21和22的退火温度为56℃ 60℃外，其余引物对的退火温度~均为50℃ 64℃。

~

5.权利要求1 4任一项所述的方法在鉴定植物等位基因多态性和植物变体中的应用。

~

6.权利要求1 4任一项所述的方法在鉴定植物种群中的相同或相关基因型中的应用。

~

7.权利要求1 4任一项所述的方法在研究植物种群中的遗传多样性中的应用。

~

8.用于扩增至少一种花楸树（S. pohuashanensis）EST-SSR标记的分离的寡核苷酸引物对，其选自下列引物对的一对或多对：SEQ ID NO: 1和2；SEQ ID NO: 3和4；SEQ ID NO: 5和6；SEQ ID NO: 7和8；SEQ ID NO: 9和10；SEQ ID NO: 11和12；SEQ ID NO: 13和14；SEQ ID NO: 15和16；SEQ ID NO: 17和18；SEQ ID NO: 19和20；SEQ ID NO: 21和22；SEQ ID NO: 23和24；SEQ ID NO: 25和26；

SEQ ID NO: 27和28；SEQ ID NO: 29和30。

9.由权利要求8所述的引物对以花楸树（S. pohuashanensis）的基因组为模板扩增得到的分离的EST-SSR标记。

说明书

花楸树EST-SSR标记、其引物对及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种花楸树EST-SSR标记、其引物对及应用。

背景技术

[0002] 简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)又称微卫星标记，是由1～6个核苷酸的串联重复单元组成的一类DNA序列。SSR标记具有多态性高、共显性、重复性和稳定性高等优点，是目前最具应用价值的分子标记之一，广泛应用于人类医学、动物、植物及微生物的学科领域。然而，SSR标记物种特异性一定程度上限制了其引物的通用性，对基因序列未知的物种而言，SSR标记的开发较为困难。传统SSR标记开发以基因文库构建法(包括SSR富集文库)为主，其实验过程繁杂、费时费力、效率较低。SSR标记还可以利用公共基因数据库(NCBI，EMBL，DDBJ)中的共享序列来设计开发，但对于非模式生物或新物种来说，有限的基因序列资源依然是SSR标记开发的瓶颈。2005年以来，第二代高通量测序技术的发展为规模化遗传变异检测和标记位点开发带来了新机遇。如何利用高通量测序数据高效、快速地开发SSR标记位点，成为当前分子遗传学领域研究的热点之一。

[0003] SSR根据来源不同可分为基因组SSR(Genomics SSR,gSSR)和表达序列标签SSR(Expressed Sequence Tag SSR,EST-SSR)。EST数据来源于基因的转录区域，其多态性可能与基因功能直接相关，因此，EST-SSR比gSSR标记具有更高通用性。目前，基于转录组信息进行SSR标记引物开发在穗花杉(Amentotaxus spp.)、金钱槭(Dipteronia spp.)、落羽杉(Taxodium‘zhongshansa’)、杜仲(Eucommia ulmoides)、红松(Pinus koraiensis)、杉木(Cunninghamia lanceolata)、以及南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)等林木上得到有效应用。此外，基于DNA测序仪为平台的荧光标记毛细管电泳技术为SSR标记提供了高效自动化检测方法，研究表明该技术检测效率，结果更为精确灵敏，已在杨树(Populus spp.)、桃树(Prunus persica)、蔷薇属(Rosa L.)等树种上得到证实。

[0004] 花楸树(Sorbus pohuashanensis)为蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科(Maloideae)花楸属(Sorbus)落叶小乔木，又名百花花楸，其果实称“花楸果”，是一种重要的观叶、观花、观果树种，具有极高的园林及生态价值。早在《中华本草》就有记载：花楸果具有止咳化痰，健脾利水的功效。现代研究表明，花楸树中含有较丰富的黄酮、花青素、生氰苷、醌等成分，具有强抗氧化、抗癌、抗辐射和止咳平喘等药理作用。近年来，花楸树因其独具魅力的观赏价值日益受到人们的喜爱，市场上对其新品种的需求也十分迫切。然而，目前关于花楸树的研究大多集中在种群天然更新、群体交配系统、苗期形状地理种源变异、人工繁育技术以及引种驯化等方面，对于该物种的遗传多样性研究主要局限于同工酶等生化标记技术。

发明内容

[0005] 本发明涉及EST-SSR标记和用于扩增EST-SSR标记的引物。本发明的EST-SSR标记可用于分子基因分型和/或遗传指纹图谱构建。

[0006] 根据本发明的一方面，本发明涉及一种鉴定植物样品基因型的方法，包括：

[0007] 1)、提取所述植物样品的DNA；

[0008] 2)、用选自下列的至少一个引物对扩增至少一种EST-SSR标记：SEQ ID NO:1和2；SEQ ID NO:3和4；SEQ ID NO:5和6；SEQ ID NO:7和8；SEQ ID NO:9和10；SEQ ID NO:11和
12；SEQ ID NO:13和14；SEQ ID NO:15和16；SEQ ID NO:17和18；SEQ ID NO:19和20；SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:27和28；SEQ ID NO:29和
30；

[0009] 或扩增各引物对对应的扩增产物的片段或变体；及

[0010] 3)、鉴定所述植物样品中的至少一种多态等位基因。

[0011] 在一些实施方式中，所述植物样品的DNA的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

[0012] 优选的，如上所述的方法，其中步骤2)包括用对应引物对扩增2种或更多EST-SSR标记；

[0013] 更优选的，其中步骤2)包括用对应引物对扩增3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种EST-SSR标记。根据特定实施方式，分析全部15种标记的多态性。各扩增反应可独立地实施，或2种或更多SSR标记的扩增可在单个反应中一起实施(多重PCR)。

[0014] 优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种EST-SSR标记时，除SEQ ID NO:21和22的退火温度为56℃～60℃外，其余引物对的退火温度均为50℃～64℃。

[0015] 具体的，所述方法包括：

[0016] 用对应引物对扩增15种EST-SSR标记中的每一种；及自15种扩增产物中的每一种鉴定样品中的至少一种多态等位基因。

[0017] 本发明的分子基因分型和/或遗传指纹方法可用于：

[0018] (i)鉴定植物种群中的相同或相关基因型；

[0019] (ii)鉴定植物等位基因多态性和区分植物种群中的植物变体；或者

[0020] (iii)研究植物种群中的遗传多样性。

[0021] 例如，可对相关的植物基因型进行分类。鉴定相关的植物基因型也包括亲子关系鉴定。

[0022] 尽管本发明的EST-SSR标记从花楸树(Sorbus pohuashanensis)得到，但它们可应用于花楸属(Sorbus)植物的分子基因分型；优选的，前述任一项所述的方法及应用，所述植物包括但不仅限于水榆花楸S.alnifolia、黄山花楸S.amabilis、锐齿花楸S.arguta、毛背花楸S.aronioides、多变花楸S.astateria、美脉花楸S.caloneura、冠萼花楸S.coronata、白叶花楸S.cuspidata、北京花楸S.discolor、棕脉花楸S.dunnii、附生花楸S.epidendron、麻叶花楸S.esserteauiana、锈色花楸S.ferruginea、纤细花楸S.filipes、石灰花楸S.folgneri、圆果花楸S.globosa、球穗花楸S.glomerulata、疣果花楸S.granulosa、巨叶花楸S.harrowiana、钝齿花楸S.helenae、江南花楸S.hemsleyi、湖北花楸S.hupehensis、卷边花楸S.insignis、毛序花楸S.keissleri、俅江花楸S.kiukiangensis、陕甘花楸S.koehneana、大果花楸S.megalocarpa、泡吹叶花楸S.meliosmifolia、维西花楸S.monbeigii、多对花楸S.multijuga、宾川花楸S.obsoletidentata、褐毛花楸S.ochracea、少齿花楸S.oligodonta、灰叶花楸S.pallescens、花楸树S.pohuashanensis、侏儒花楸S.poteriifolia、西康花楸S.prattii、蕨叶花楸S.pteridophylla、台湾花楸S.randaiensis、铺地花楸S.reducta、西南花楸S.rehderiana、鼠李叶花楸S.rhamnoides、红毛花楸S.rufopilosa、晚绣花楸S.sargentiana、梯叶花楸S.scalaris、四川花楸S.setschwanensis、太白花楸S.tapashana、康藏花楸S.thibetica、滇缅花楸S.thomsonii、天山花楸S.tianschanica、川滇花楸S.vilmorinii、尼泊尔花楸S.wallichii、华西花楸S.wilsoniana、黄脉花楸S.xanthoneura、长果花楸S.zahlbruckneri。

[0023] 用于扩增至少一种EST-SSR标记的分离的寡核苷酸引物，其包含选自下列的序列：SEQ ID NO:1～30所示核苷酸序列或其片段或变体。优选的，所寡核苷酸引物可组成15对引物对，分别对应SEQ ID NO:1和2；SEQ ID NO:3和4；SEQ ID NO:5和6；SEQ ID NO:7和8；SEQ ID NO:9和10；SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:13和14；SEQ ID NO:15和16；SEQ ID NO:17和
18；SEQ ID NO:19和20；SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:25和26；SEQ ID NO:27和28；SEQ ID NO:29和30。

[0024] 寡核苷酸引物片段可包含部分SEQ ID NO:1～30，长度可以为5～25bp不等。

[0025] 变体寡核苷酸引物不需要与SEQ ID NO:1～30共享任何重叠，但仅需能扩增本发明的EST-SSR标记。变体寡核苷酸引物也包括与侧接本发明的EST-SSR标记的区互补的任何寡核苷酸引物。如本领域技术人员明晰，用于PCR的变体寡核苷酸引物的3’端可不与SSR标记或侧接SSR标记的区具有任何错配，而5’端可具有错配。

[0026] 由如上所述的引物扩增得到的分离的EST-SSR标记，或所述EST-SSR标记的片段或变体。本发明的EST-SSR标记即以花楸树(Sorbus pohuashanensis)的基因组为模板，SEQ ID NO:1～30所示的引物扩增得到的序列，该序列应当具有对应的重复单元，如(AAG)n，(CTT)n，(TC)n等(具体如表2所示)。

[0027] 本发明也提供一种试剂盒，其包含来自SEQ ID NO:1～30的至少一种寡核苷酸引物或其片段或变体。

[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0029] 本发明提供的引物对能在植物样本中扩增出条带清晰、多态性高的EST-SSR标记条带，使得本发明提供的引物能够应用于植物，尤其是花楸属植物的种群遗传结构和遗传变异水平等方面的研究，采用EST-SSR标记可以对花楸属植物的种群遗传学研究提供较为丰富的遗传基础信息。

附图说明

[0030] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0031] 图1为花楸树SSR位点重复长度分布；

[0032] 图2为花楸树SSR位点重复次数分布；

[0033] 图3为花楸树SSR不同重复单元类型；

[0034] 图4为二核苷酸重复中不同重复单元的比例。

具体实施方式

[0035] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0036] 1.材料与方法

[0037] 1.1转录组数据来源

[0038] 花楸树转录组数据来源于发明人课题组2014年对花楸树叶片进行Illumina高通量测序的结果。测序时采取3株5年生花楸树的叶片，提取RNA后委托上海伯豪生物技术有限公司进行RNA-Seq转录组测序，并通过De Novo方法组装得到96 213条Unigene，作为分析背景数据。

[0039] 1.2植物材料及其DNA提取

[0040] 实验中用于引物筛选所用的植物材料为国家林木种质资源共享服务平台资源保存单位-北京农学院林木种质资源圃收集保存的山东崂山种源8个2年生花楸树实生苗。

[0041] 试验材料基因组DNA提取方法为CTAB法。

[0042] 1.3转录组SSR位点鉴别及SSR引物设计

[0043] 对花楸树叶片转录组测序获得的96213条Unigene，采用MISA程序(http：//pgrc.ikp-gatersleben.de/misa)进行SSR位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为6、4、3、3和3次。

[0044] 利用Primer 3.0在线引物批量设计程序(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)对含有SSR位点的Unigene序列设计引物。

[0045] 1.4EST-SSR引物筛选与PCR扩增

[0046] 按照SSR引物设计原则，随机选取并合成140对EST-SSR引物(北京睿博兴科生物技术有限公司)，SSR位点包括2～3个核苷酸重复单元，引物序列及其相关信息见附表1。PCR反应体系为20μL：模板DNA(50ng)1μL，Taq(+day)聚合酶10μL，dd水8.2μL，引物各0.4μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性4min，94℃变形30s，最佳退火温度30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。

[0047] 首先选用一个DNA模板对140对引物进行扩增，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行初步检验，选出只有一个扩增条带且条带清晰的引物；之后用四个DNA模板对上述初筛出的引物进行扩增，筛选出条带清晰且扩增反应稳定的引物。选择上述扩增反应稳定、条带清晰的引物，委托北京睿博兴科生物技术有限公司合成荧光(FAM)标记引物，采用8个DNA模板进行PCR扩增，PCR扩增后，取1μLPCR产物，加入8.5μL去离子甲酰胺、0.5μL ROX-500分子量内标，95℃变性5min，于4℃保温10min，3 000r·min-1离心1min，1×Buffer缓冲液，于ABI3730DNA分析仪上进行毛细管电泳，并收集数据，验证多态性。

[0048] 1.5数据分析

[0049] 用Genemarker2.2.0软件对收集的原始数据进行分析，系统将各峰值的位置与其泳道中的Rox-500分子质量内标予以比较，读取SSR标记片段大小，记录等位基因。

[0050] 2结果与分析

[0051] 2.1花楸树转录组中SSR位点的数量与分布特点

[0052] 在花楸树转录组的96213条Unigene序列中发现7473个SSR位点，分布在6604个Unigene中，发生频率(含有SSR的Unigene数量与总Unigene数量之比)为6.87％，其中，含2个及2个以上的SSR位点的Unigene序列有764条，5840条序列含1个SSR位点，SSR的分布频率(SSR的个数与总Unigene的数量比)为7.77％，花楸树转录组序列中平均9.1kb发现1个SSR位点(表1)。

[0053] 表1花楸树转录组中SSR重复单元的分布特点

[0054]

[0055] 对花楸树转录组SSR位点的序列长度分布分析发现，二、三、四、五、六核苷酸重复的平均长度分别为17、15、21、24、29bp，平均长度21bp(表2)。SSR位点的重复序列长度分布从12～84个碱基不等，重复序列长度12～21bp的最多，占79.97％；其次是长度22～30bp的序列重复，占12.98％,；而大于40bp的重复序列仅占2.40％(图1)。

[0056] 花楸树转录组SSR位点重复单元的重复次数分布在5～42次之间。其中5～10次重复的数量最多，有6212个SSR位点；其次是11～15次重复，有762个SSR位点；大于20次重复的数量最少，仅有136个SSR位点(图2)。

[0057] 2.2花楸树转录组SSR位点的重复类型与频率

[0058] 对花楸树转录组中SSR位点深入分析发现，7473个SSR位点中共包含139种重复单元，其中，二、三、四、五、六核苷酸重复单元分别有8、30、52、31、18种。SSR位点的主要重复类型是二核苷酸重复(占SSR总数的66.49％)；其次是三核苷酸重复(占SSR总数的31.02％)；四、五、六核苷酸重复类型的数量很少，总计2.49％(图3)。从出现频率来看，频率最高的重复单元为AG/CT，共有1957个SSR位点，占总SSR位点的25.19％；其次是GA/TC，有1571个SSR位点，占总SSR位点的21.02％(图4)。分析还发现，AG/CT、GA/TC两类重复基元在二核苷酸中出现次数最多，占所有二核苷酸SSRs的71％；同时在二核苷酸重复中还发现了少量的CG、GC重复，各占二核苷酸SSRs的0.10％(图4)。

[0059] 2.3EST-SSR引物筛选与验证

[0060] 参试的140对SSR引物，分别通过1个DNA模板、4个DNA模板PCR扩增、检测，共筛选出扩增稳定、条带清晰的引物24对，占参试引物数的17.14％。然后对这筛选出的24对引物利用ABI3700DNA分析仪进行检测发现共有15对引物具有多态性(表2)。

[0061] 表2SSR引物序列与重复类型

[0062]

[0063]

[0064] 3结论

[0065] 通过花楸树96213条转录组Unigene序列中共查找到SSR位点7473个，这些SSR位点共包含139种重复单元，其中最主要的重复类型为二核苷酸重复；在二核苷酸SSRs中，AG/CT、GA/TC两类重复单元元出现次数最多，所占比例高达71％；在参试的140对SSR引物中，检测到15对SSRs具有多态性。这些基于花楸树转录组数据库开发获得的SSR标记，对于研究花楸树不同种群的遗传结构和遗传多样性分析十分必要，为花楸树的合理保护提供科学依据，也为后期的遗传资源评价分子标记辅助育种、功能基因挖掘和遗传图谱构建等提供了理论依据；同时，这些标记也将为同属其它物种的遗传多样研究提供了有效标记。

[0066] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。