本发明公开了一种微藻胞内代谢物样品提取方法，使用冰浴方式迅速失活胞内酶，通过二氯甲烷或者氯仿超声破碎，以二氯甲烷(或氯仿)：甲醇：水三相体系进行快速极性、非极性化合物、不溶性糖和蛋白的分离，用于后续代谢组学分析。本发明具有操作步骤少，可同时测定极性和非极性胞内组分的特点。
1.一种用于微藻代谢胞内代谢物样品制备的方法，其特征在于，具体操作如下：(1)冰浴失活胞内酶：将微藻液体培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于离心试管冷冻制备冰斜面；所使用的培养基或者等渗溶液体积为最多不超过离心试管体积的一半；取出离心试管，将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积不超过冰斜面所用溶液的体积；剧烈振荡直至离心试管内冰刚刚融化消失，得细胞悬液；
(2)离心收集细胞：将(1)中的细胞悬液迅速转移至预冷的-4至4℃离心机中，在2000～
12000g转速下离心5～10分钟，收集细胞，弃上清；
(3)细胞清洗：将收集的藻细胞用与待分析的微藻培养液体积相同的步骤(1)中制备冰斜面的溶液重悬后，按照步骤(2)条件离心收集细胞，弃上清，进行细胞清洗；其中，制备冰斜面的溶液需要预冷至-4至4℃；重复该步操作1～3次；最终获得的细胞沉淀可以保存于-
(4)超声破碎：按照每1x10～3x10 个细胞加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的比例，将二氯甲烷和/或氯仿加入到所收集的细胞沉淀中，在-4至4℃冰水混合物中进行超声破碎，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体；
(5)萃取：对应于上述每加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的步骤(4)体系，再加入1mL0～4℃预冷的甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇和水的体积比1:3～1:5，体系中甲醇水溶液与二氯甲烷和/或氯仿溶液的体积比为1:2，充分混合，0～4℃静置5～10分钟至体系明显分层，4℃，12000g离心10分钟，获得三相分层体系，其中上层为水相，下层为有机相，中间固形物层；将上述三相分别取出，即可用于后续分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：于所述二氯甲烷和/或氯仿中、以及萃取使用的甲醇水溶液中的一种或二种以上溶液内，可以根据需要加入内标物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：水相内标物可以是同位素标记的氨基酸、核酸、葡萄糖衍生物、甘油衍生物或待检测的目标分子中的一种或二种以上；有机相内标物可以是同位素标记的脂肪酸或待检测的目标分子中的一种或二种以上。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微藻是真核微藻或是原核的蓝藻。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)将经过0.22微米滤膜过滤除菌的微藻培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于15mL或50mL离心试管中存放于-
80℃冰箱中，制备与水平方向成15-75度的冰斜面；所使用的培养基或者等渗溶液体积为离心试管体积的1/20至1/2；取出离心试管，将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积与冰斜面所用溶液体积之比为1/20至1；剧烈振荡直至离心试管内冰刚刚融化消失。
对于淡水藻，其等渗溶液为生理盐水或30～50mM磷酸缓冲液；
对于海水藻，其等渗溶液为质量体积(g/ml)浓度为2.5～3.0％食盐水；
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)的操作；以2mL上述体系为例，超声功率300-500w，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)获得三相分层体系，其中上层为水相，其中主要是极性分子；下层为有机相，其中主要是非极性分子，中间固形物层，其为多糖和蛋白质。
所述后续分析是指包括重量法测定各组分重量，和/或下述分析方法中的一种或二种以上；
或利用薄层色谱、柱层析、气相色谱、液相色谱或色谱-质谱联用方法测定有机相代谢物；
或利用液相色谱或色谱-质谱联用方法或衍生化后通过气相色谱或色谱-质谱联用方法测定水相代谢物；
或利用酶解、消化方法处理后测定中间固形物中糖的构成以及氨基酸或多肽的构成。
一种微藻胞内代谢物样品提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微藻胞内代谢物样品提取方法。
背景技术
[0002] 微藻为自养型微生物，因其细胞内存在光合作用系统也称为微藻植物。微藻具有高效吸收太阳能、固定二氧化碳产生生物质的能力(即光合作用能力)；同时微藻作为微生物的一种，其增殖速度较快。作为单细胞生物，微藻的主要组成为蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已经是重要的养殖饵料被养殖企业广泛应用，同时微藻也已经成为类胡萝卜素、蛋白质、多糖等保健食品的来源。随着化石能源枯竭的预期加剧，微藻在能源制品和精细化学品的潜在应用也得到了极大关注。为了有效利用微藻生物资源，或将微藻作为细胞工厂而定向调控微藻，微藻胞内代谢物分析都在其中起了重要作用。越来越多的研究表明，在代谢物研究过程中，样品提取方法对后期结果有很大的营养，一方面，胞内酶系的存在，有可能在样品处理过程中产生内源性转化，使得结果偏离预期，另一方面，不同极性和溶解性物质的存在，大多现有方法会丢失一部分样品，降低了样品的利用率，或操作复杂，耗时长(CN102472741B，CN103713075A，CN102495152B和CN102517349B)。
[0003] 针对内源性降解，常用的方法包括低温失活、低温溶剂失活或高温溶剂失活几种。对于微藻来说，其培养体系为水环境，干基生物质质量含量通常在千分之几水平，因此现有方法是先离心再失活处理。尽管4℃离心时间仅有几分钟，但是该过程中细胞仍具有一定的活性。比较好的方法应先使胞内酶失活再进行生物质收集。离心收集的微藻生物质含水量在10-90％之间。
[0004] 常规提取方法中，样品收集后会采用冷冻干燥进行水分的去除。但是无论是对极性物质的水提，还是利用有机溶剂进行抽提，通常提取剂的用量会远远高于离心收集到微藻细胞沉淀中的水量，后者对于大多数后续测定不产生实质影响。
[0005] 同时，在常规提取方法中，多仅选择性收集其中一相进行后续分析，如果能够对多个组分进行分析，能够从有限的样品中获得更多的信息。
[0006] 因此，本发明基于上述分析，针对微藻代谢物研究，尤其是组学层次研究特点，提出了一种新的胞内代谢物样品制备流程。
发明内容
[0007] 本发明涉及一种用于微藻代谢胞内代谢物样品制备的方法，首先通过低温冰浴失活胞内酶，再离心收集细胞，并在二氯甲烷或者氯仿中超声破碎细胞，使用含有甲醇的水相进行代谢物分离，获得可溶的极性(水相)、非极性(溶剂相)和不溶的多糖及蛋白组分，用于后续的代谢组学研究。具体操作如下：
[0008] (1)冰浴失活胞内酶。将经过0.22微米滤膜过滤除菌的微藻培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于15mL或50mL离心试管中存放于-80℃冰箱中，制备冰斜面。所使用的培养基或者等渗溶液最多不超过离心试管体积的一半。将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积不超过冰斜面所用溶液的体积。剧烈振荡直至冰刚刚融化消失。
[0009] (2)离心收集细胞。将(1)中的细胞悬液迅速转移至遇冷的4℃离心机中，在2000～12000g转速下离心5～10分钟，收集细胞，弃上清。
[0010] (3)细胞清洗。将收集的藻细胞用与经过预冷至4℃的、取样时藻液体积相同的(1)中0.22微米滤膜过滤除菌的溶液重悬后，按照(2)条件离心收集细胞，弃上清。重复该步操作2～3次。最终获得的细胞沉淀可以保存于-80℃或者直接进行步骤(4)的操作。
[0011] (4)超声破碎。按照初始每2～8mg细胞加入2mL二氯甲烷或者氯仿的比例，加入到所收集的细胞沉淀中，在冰水混合物中进行超声破碎。以2mL上述体系为例，超声功率300-500w，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体。
[0012] (5)萃取。对于每2mL二氯甲烷或氯仿，加入1mL 0～4℃预冷的甲醇水溶液(其中甲醇和水的体积比约1:4)，充分混合，0～4℃静置5～10分钟至体系明显分层，4℃，12000g离心10分钟，获得三相。其中上层为水相，主要是极性分子，下层为有机相，主要是非极性分子，中间固形物为多糖和蛋白质等。将上述三相分别取出用于后续分析。
[0013] 在上述方法中，可以根据后续分析的需要，在二氯甲烷或氯仿中，以及萃取使用的甲醇水溶液中，加入内标物，进行定量。
[0014] 实验表明，该方法即适用于真核微藻，也适用于原核的蓝藻。
[0015] 本发明使用冰浴方式迅速失活胞内酶，通过二氯甲烷或者氯仿超声破碎，以二氯甲烷(或氯仿)：甲醇：水三相体系进行快速极性、非极性化合物、不溶性糖和蛋白的分离，用于后续代谢组学分析。本发明具有操作步骤少，可同时测定极性和非极性胞内组分的特点。
具体实施方式
[0016] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0017] 实施例1
[0018] 1)湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)培养于添加F/2培养基的海水中，所使用的F/2营养盐主要成分的终浓度为NaNO375mg/L，NaH2PO4·2H2O 5mg/L，VitaminB120.5μg/L，Biotin 0.5μg/L，vitamin B10.1mg/L，FeCl3·6H2O 3.16mg/L,Na2EDTA·2H2O 4.36mg/L，CuSO4·5H2O 9.8μg/L，Na2MoO4·2H2O 6.3μg/L，ZnSO4·7H2O 22μg/L，CoCl2·6H2O 12μg/L，MnCl2·4H2O 0.18mg/L。在500mL光生物反应器中培养六天，分别于3、4、5和6天取样各7mL(对应生物量为3.4,5.5,7.5和7.2mg)。提前一天，取经0.22微米滤膜过滤除菌的海水7mL，装入15mL带盖离心试管中，水平放置于-80℃冰箱中,制备成与水平面成45度的冰斜面。取样后，直接加入到制备好冰斜面的15mL离心式管中，盖好盖子，剧烈振荡直至肉眼可见的冰刚刚溶解。迅速转移至遇冷的4℃离心机中，在10000g转速下离心10分钟，收集细胞，弃上清。
[0019] 2)将收集的金藻细胞用预冷至4℃的、经0.22微米滤膜过滤除菌的海水7mL重悬，再按照前述条件离心进行清洗操作。重复清洗操作过程1次，即清洗操作进行2次。
[0020] 3)在藻细胞沉淀中加入2mL氯仿，在冰水混合物的保护下，进行超声破碎。超声功率300-500w，按照超声6s，停止6s间隔循环操作3次，溶液中无肉眼可见细胞聚集体。
[0021] 4)以初始氯仿体积进行计算，按照2:1的体积比，在上述细胞裂解液中加入加入1mL 4℃预冷的甲醇水溶液(其中甲醇和水的体积比约1:4)，充分混合后，4℃静置5～10分钟至体系明显分层，4℃，12000g离心10分钟，获得三相。其中上层为水相，主要是极性分子，下层为有机相，主要是非极性分子，中间固形物为多糖和蛋白质等。将上述三相分别取出用于后续分析。
[0022] 实施例2：同实施例1的操作，与实施例1不同之处在于：在上述操作过程中，在甲醇水溶液中加入终浓度为0.125μg/mL的同位素标记的乳酸、苹果酸和琥珀酸，用于后续通过色质联用对水相中有机小分子进行定量。
[0023] 实施例3：在上述实施例1操作过程后，将有机相取出，以N2气吹扫溶剂至恒重后称重，获得重量法测定的总脂溶性物质量。或，同时可以将有机相稀释至1mg/mL(使用体积比为65:35的乙腈：异丙醇溶液)，对其中的脂质进行进行质谱测定。
[0024] 实施例4：在上述实施例1操作过程后，将固形物取出，将实施例1中的固形物使用硫酸蒽酮法测定总糖。
[0025] 实施例5：同实施例1的操作，与实施例1不同之处在于：在步骤1)后获取5mg亚心型四爿藻细胞，按照实施例1方法制备游离氨基酸水相代谢物样品。
[0026] 实施例6：同实施例1的操作，与实施例1不同之处在于：取约4mg使用TAP培养基培养的莱茵衣藻细胞，使用经过过滤除菌的TAP培养基替代实施例1中的海水，收集样品，用于蛋白质谱解析。
