肺结核相关血清标识蛋白TIMP-1及其应用

摘要

本发明属于生化免疫和分析技术领域，具体涉及肺结核相关血清标识蛋白TIMP‐1及其应用。本发明利用细胞因子和全蛋白芯片对宿主蛋白进行筛选，提供了一种可检测肺结核相关血清生物标识蛋白即蛋白基质金属蛋白酶抑制因子TIMP‐1，该抑制因子TIMP‐1的蛋白质序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的抑制因子TIMP‐1可在制备肺结核病血清诊断试剂盒中作为标识抗原蛋白应用。

权利要求

1.如序列表SEQ ID NO：1所示序列的血清蛋白基质金属蛋白酶抑制因子TIMP-1在制备检测肺结核病血清检测试剂盒中作为唯一标识抗原蛋白的应用。

说明书

肺结核相关血清标识蛋白TIMP-1及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生化免疫分析领域，具体涉及肺结核相关血清标识蛋白TIMP-1及其应用。

背景技术

[0002] 人结核病是主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)引起的一种慢性消耗性传染病。尽管结核分枝杆菌可侵害人体多个器官组织，但肺结核是最主要的结核病类型。据估计，全球每年有约800万新发病例，约200万死亡病例，80％的病人在发展中国家。目前国内外用于结核病预防的唯一疫苗是卡介苗(BCG)。该疫苗对儿童具有一定的保护作用，但对成人的保护效果极差。而且对儿童的保护效果世界各地报道不一，波动很大。因此，早诊断早治疗仍然是结核病防控的重要手段。

[0003] 目前用于结核病诊断的方法除了临床上常用的胸部X光透视、气管内窥镜结合活检取样检测、痰液涂片镜检和细菌培养等检测方法之外，还有免疫学和分子生物学方法。细菌分离培养检测通常对生物安全水平的要求很高，且该菌生长慢，分离和纯化鉴定需1月以上，费时费力，分菌率低，因此，不适合作常规检测；分子生物学方法对仪器设备和操作人员均有较高要求；因此，免疫学方法在结核病诊断方面的应用比较普遍。

[0004] 一般认为，结核病的免疫反应特点表现为细胞免疫和体液免疫分离，在感染初期表现为细胞免疫占优势，发病后期则表现为体液免疫占优势。传统的结核菌素(PPD)皮内变态方法主要是基于细胞免疫原理，该方法灵敏性高，已沿用百余年，但是特异性较差，环境分枝杆菌感染者具有交叉反应，免疫低下个体可能不出现反应；由于BCG与结核菌素具有交叉反应，发展中国家儿童普遍接种BCG，疫苗免疫反应干扰皮试检测。目前市场上以外周血淋巴细胞在结核分枝杆菌抗原体外刺激下释放IFN-γ为原理设计的检测方法灵敏度高，但检测的是感染状态，与结核病的病理过程无直接联系。结核病是一高感染率、低发病率的慢性疾病，只有5％-10％的感染者将发展成为活动性结核病，而其中绝大多数病人为肺结核。因此，寻找与发病相关、尤其是与肺结核相关的诊断标识分子对结核病治疗和控制具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明目的在于克服现有技术的缺陷，利用细胞因子和全蛋白芯片对结核病人的宿主蛋白进行筛选，提供一种与检测肺结核相关的血清生物标识蛋白，该标识蛋白可用于肺结核患者血清蛋白生物标识物，建立肺结核患者基质金属蛋白酶抑制因子((Metalloproteinase inhibitor 1，简称TIMP-1)表达的检测方法，为活动性和原发性肺结核的及时诊断和治疗提供支持。

[0006] 本发明利用结核分枝杆菌特异蛋白CFP10/ESAT6模拟结核分枝杆菌对全血进行刺激，利用细胞因子芯片(RayBiotech 516点)对刺激后的上清液进行检测，共分析了510种细胞因子。经CE蛋白刺激后，有67种细胞因子表达量增高了1.9倍以上，43种下调了至少2.0倍。其中包括炎性因子，免疫调节因子，趋化因子，生长因子，血管原性因子，可溶性受体，粘附因子等。同时，利用蛋白芯片分析(SpringBio芯片656点)，对活动性结核病人、潜伏感染者、肺癌病人和健康对照人血浆中651种蛋白进行了直接检测，结果仅在活动性结核病人血浆中表达升高1.9倍以上的蛋白有21种，下调2.0倍以上的蛋白有72种。在上调的蛋白中包括角蛋白，神经丝蛋白，与基因修复相关蛋白，热休克蛋白等。

[0007] 对TIMP-1实施进一步验证，利用基于TIMP-1抗原的ELISA检测了125份活动性结核病例和90份健康对照者血清验证发现TIMP-1对活动性肺结核病人的检测敏感性可达100％，特异性可达92％。

[0008] 本发明首次发现TIMP-1可以作为一个重要的生物学指标，在肺结核病临床诊断、鉴别诊断和有效观察中具有标识蛋白的作用，为以后结核病患者血清蛋白的研究提供了技术基础，并为从分子水平诊断结核提供新的技术思路，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。

[0009] 本发明通过以下技术方案实现：

[0010] 一种与肺结核病相关的血清蛋白的筛选和检测，包括以下步骤：

[0011] 1.利用细胞因子芯片检测外周血刺激表达蛋白

[0012] 利用RayBiotech细胞因子抗体芯片(RayBiotech 516点)对结核分枝杆菌特异性抗原CFP10/ESAT6刺激后的结核病人和健康对照者外周血血浆进行芯片检测，包括510种细胞因子。获得上调与下调的细胞因子。

[0013] 2.蛋白芯片检测血浆蛋白

[0014] 利用蛋白芯片(SpringBio芯片656点)直接检测结核病人和对照者血浆蛋白：对活动性结核病人、潜伏感染者、肺癌病人和健康对照人血浆中651种蛋白进行了直接检测，获得仅在活动性结核病人血浆中表达显著升高或降低的蛋白质。

[0015] 3.TIMP-1的鉴别检测肺结核中的应用

[0016] 两种芯片的检测结果均表明，TIMP-1表达与肺结核相关。因此建立了TIMP-1检测的ELISA方法，进一步对125份活动性结核病例和90份健康对照者血清进行验证检测，发现TIMP-1对活动性结核病的敏感性可达100％，特异性可达92％；且能够区分原发性结核病及继发性结核病例。因此确定TIMP-1可用于肺结核病患者诊断的血清标识蛋白质。

[0017] 生物功能验证表明，本发明的肺结核病相关血清蛋白生物标识物TIMP-1可在制备肺结核病血清液检测试剂盒中应用。

[0018] 本发明的效果在于：首次发现并筛选到一种血清蛋白基质金属蛋白酶抑制因子TIMP-1作为一个重要的血清液生物学检测指标，在肺结核病的诊断、鉴别诊断和有效观察中发挥作用，为今后肺结核病血清蛋白的研究提供了依据，并从血清液蛋白分子水平诊断肺结核病提供新方向，具有重要的理论价值和潜在实用意义。

附图说明

[0019] 序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的血清蛋白基质金属蛋白酶抑制因子TIMP-1的蛋白质序列。

[0020] 图1：血清蛋白TIMP-1在肺结核患者和健康对照者中的差异表达。

[0021] 图2：血清蛋白TIMP-1在肺结核患者和健康对照者全血ESAT6/CFP10刺激后上清中的差异表达。

[0022] 图3：血清蛋白TIMP-1在M.bovis和BCG感染的人巨噬细胞系THP-1中的表达水平差异。

[0023] 图4：SpringBio抗体高通量芯片主要原理图。附图标记说明：用Biotin标记的蛋白样品，与芯片进行杂交，加入链霉亲和素与样品中蛋白结合后被荧光标记的抗体识别。

具体实施方式

[0024] 实施例1

[0025] 以下通过肺结核相关标识蛋白的发现实施例对本发明进行详细说明。

[0026] 1.血液样本的搜集与制备

[0027] (1)样本收集

[0028] 结核病人血液样本(抗凝全血或血清)样本来自于武汉市医疗救治中心，根据临床诊断、X影像、痰菌培养等各种手段，确定为活动性肺结核病，存在有明显结核病灶或空洞，且排除掉爱滋病、泌尿道疾病等并发症的新收治病人。111个活动性肺结核病人中，男性71人，女性40人；痰涂片阳性病例58份，阴性20份，其余病例没有对应结果；痰菌培养阳性病例13份，阴性23份，其余为没有对应结果；PPD皮试阳性病例46份，阴性12份，其余为没有对应结果；74例病人有明显病灶。

[0029] 284个健康对照为大学生志愿者。所有志愿者均经过X射线胸透检测，均未见病灶或空洞。经专业医师对志愿者对其中46人进行PPD皮试反应检测，阳性35人，阴性11人，其中包括男性30人，女性16人。

[0030] (2)血液样本处理

[0031] 抽取肝素抗凝全血5mL，将全血与RPMI-1640完全培养基(购自Hyclone公司)以体积比为1:1混合，按总体积2mL/每孔的量分别转移至24孔细胞培养板中。于第1个孔中加入20μg的植物血凝素(PHA)，作为阳性对照；在第2个孔中加入20μg结核分枝杆菌特异蛋白CFP10/ESAT6融合蛋白)，作为测试孔，于第3孔中加入10μl生理盐水，作为阴性对照。将孔中各试剂与血液轻轻混合，放于37℃含5％CO2的培养箱中培养14～16h。CFP10/ESAT6融合蛋白基因来自于人结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37RV菌株基因组(GenBan序列号：
GenBank:AL123456.3)，该菌株由北京市结核病胸部肿瘤研究所李传友教授惠赠。克隆和大肠杆菌表达和融合蛋白纯化按常规方法进行[1]。

[0032] 2.细胞因子芯片检测

[0033] (1)样本准备

[0034] 用IFN-γ体外释放方法[2]检测样本后，在111份活动性肺结核病例中筛选出IFN-γ释放法阳性值最高的5份刺激液上清，将结核分枝杆菌特异蛋白ESAT6/CFP10刺激后上清和生理盐水刺激上清(阴性对照)每份各吸取20μL充分混合后进行RayBiotech细胞因子抗体芯片检测。

[0035] (2)芯片检测

[0036] RayBiotech细胞因子抗体芯片由上海康成生物工程有限公司制备和完成检测，检测所需试剂均由该公司提供。主要检测步骤如下：

[0037] 1)将细胞因子抗体芯片膜于封闭液(RayBio)中封闭。

[0038] 2)加入100μL处理好的样本，4℃作用过夜。

[0039] 3)加入标记好的抗体(来源于芯片配套试剂)，在室温下作用1h。

[0040] 4)加入化学发光底物后，将芯片进行化学发光检测，将X射线胶片曝光在胶片上显示检测结果。

[0041] 利用RayBiotech细胞因子抗体芯片共检测了ESAT6/CFP10刺激后上清及阴性对照各510种细胞因子。胶片曝光后得到2组结果，每组结果各516点信号(包括6个对照点)。ESAT6/CFP10刺激后上清中细胞因子与阴性对照相比差异较为显著。67种细胞因子的表达量增高了1.9倍以上，其中包括炎性因子，免疫调节因子，趋化因子，生长因子，血管原性因子，可溶性受体，粘附因子等。相反的，43种细胞因子经结核分枝杆菌特异蛋白ESAT6/CFP10刺激后下调了至少2.0倍。其它细胞因子的变化倍数介于0.6～1.0或1.0～1.8倍之间。

[0042] 3.蛋白芯片检测

[0043] (1)样本准备

[0044] IFN-γ体外释放方法检测后，在111份活动性肺结核病例中筛选出IFN-γ释放法阳性值最高的5份血浆，每份吸取20μL后充分混合备用。选取5份IFN-γ检测最低，同时抗体检测最低，PPD反应为阴性的健康志愿者血浆，每份吸取20μL后充分混合备用。选取5份IFN-γ检测为阳性的健康志愿者血浆作为潜伏感染者血浆，每份吸取20μL后充分混合备用。选取5份肺癌病人血浆，每份吸取20μL后充分混合备用。每份混合血浆分别进行SpringBio抗体高通量芯片检测。

[0045] (2)芯片检测

[0046] SpringBio抗体高通量芯片(656点，其中651个蛋白点，4个对照点)由上海康成生物工程有限公司制备和完成检测，检测所需试剂均由该公司提供。主要检测步骤如下：

[0047] 1)将抗体芯片膜至于封闭液(SpringBio)中封闭。

[0048] 2)加入用Biotin标记的样品，与芯片进行杂交，4℃作用过夜。

[0049] 3)加入链霉亲和素，与样品中蛋白结合。

[0050] 4)加入荧光标记的抗体，在室温下作用1h。

[0051] 5)扫描仪扫描荧光信号。(见图4)

[0052] SpringBio抗体高通量芯片检测了不同样品中各651种蛋白，扫描荧光信号，得到三组结果。与健康对照相比，活动性结核病人血浆中53种蛋白表达量上调1.9倍以上，其中包括角蛋白，神经丝蛋白，与基因修复相关蛋白，热休克蛋白等。116种蛋白表达量下调2.0倍以上。在肺癌病人血浆中，上调1.9倍以上的蛋白有132种，下调2.0倍以上蛋白有119种。

[0053] 3.TIMP-1蛋白在鉴别诊断肺结核的验证

[0054] 两种芯片的检测结果均表明，TIMP-1表达与肺结核相关。因此申请人建立了TIMP-1检测ELISA方法，进一步确定其在建立肺结核血液检测方法中的应用。

[0055] (1)TIMP-1在肺结核患者血液中的差异表达验证

[0056] 新收集125例肺结核病患者和166例健康对照者血清。收集标准同前。检测TIMP-1的ELISA操作步骤如下：

[0057] 如图1和图2所示，本发明利用商购的TIMP-1ELISA试剂盒(购自RayBiotech公司,USA)对125例肺结核病患者和90例健康对照者血清和全血ESAT6/CFP10刺激后上清验证TIMP-1蛋白的表达差异，灵敏度为100.0％(95％CI:97,100)，特异性为92％(95％CI:86,96)，曲线下面积(AUC)是0.782(P<0.0001,95％CI，0.688-0.876)。

[0058] (2)TIMP-1在感染巨噬细胞中的差异表达验证

[0059] 受本实验室生物安全的限制，本发明在华中农业大学农业微生物学国家重点实验室病毒分室的实验室中以牛分枝杆菌(M.bovis)AF2122/97(由北京市结核病胸部肿瘤研究所李传友教授惠赠)模式菌检测了TIMP-1表达与结核分枝杆菌感染的相关性实验。试验所用的人源巨噬细胞系THP-1细胞(ATCC TIB-202)(由北京市结核病胸部肿瘤研究所李传友教授惠赠)感染牛分枝杆菌和疫苗株牛分枝杆菌BCG Tokyo strain(ATCC 35737)(由北京市结核病胸部肿瘤研究所李传友教授惠赠)为模式菌。将THP-1细胞接种于145mm细胞培养皿中，加入PMA(巨噬细胞诱导剂)，终浓度为40ng/mL，混合，放于CO2培养箱中诱导12h。去除培养基(含PMA)，用温育的培养基洗涤两遍，备用。细胞由原来的悬浮状态变成贴壁，伸出伪足，开始行使巨噬细胞的作用。将已经分散好的细菌加入细胞培养皿中，感染比为：10:1，互作12小时，将上清(含细菌)收集作为胞外菌对照，用新鲜培养基洗涤两遍，彻底去除未进入细胞的细菌，再过12小时，24小时收集胞内菌和细胞样本。然后进行感染前后巨噬细胞总RNA的提取与质量检测(为常规方法)，利用荧光定量PCR(为常规方法)检测TIMP-1在不同组别中的差异表达(P<0.05)(参见图3)。

[0060] 本发明获得TIMP-1具有潜在标识意义的宿主蛋白，同时对TIMP-1蛋白进行了差异分析。结果显示TIMP-1血清蛋白的表达水平在两组之间均存在差异。

[0061] 主要参考文献：

[0062] [1]张书环，吴波，颜邦芬，曹莎，陈颖钰，晁彦杰，凌洁玉，谭亚娣，陈焕春，郭爱珍.牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析.中国人兽共患病杂志，2007，23(12):38-43.

[0063] [2]陈颖钰.人IFN-γ体外释放检测法的建立及其在结核病诊断中的应用[J].生物工程学报.2008,24(9)：1-6。