棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用

摘要

本发明是关于一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用，其保藏编号为CGMCC No.12885，保藏日期2016年8月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌分离于棉花根际土壤中。本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌对棉花黄萎病病菌具有显著的拮抗作用，对其菌丝生长的抑制率为51.23％‑56.25％，同时可以促进棉花出苗，本发明所筛选的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌是从棉花根际土壤中分离得到的，对植物本身、环境、及人都是安全的，不会使人产生抗药性，也没有剧毒性，在使用过程中不产生有害物质。本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液对棉花黄萎病病菌孢子萌发的抑制率为78.54％‑92.47％，同时可以促进棉花出苗。

权利要求

1.一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其特征在于，其由分类为莫哈韦芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌经过发酵培养制得；所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.12885，保藏日期2016年8月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述的发酵滤液对棉花黄萎病病菌孢子萌发的抑制率为82.54%-92.47%。

2.根据权利要求1所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其特征在于，所述的发酵培养的步骤为：将棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌接入NB培养基中，30-37℃、180-200 r·min-1培-1养60-72h，获得发酵液，发酵液于4-6℃，8000-9000 r·min 离心分离，沉淀为菌体，上清液为发酵滤液。

3.根据权利要求1所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其特征在于，所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌分离于棉花根际土壤中。

4.根据权利要求1所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其特征在于，所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌对棉花黄萎病病菌菌丝生长的抑菌率为51.23%-56.25%。

5.根据权利要求1所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其特征在于，所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌的生长pH为4.5-9.0。

6.一种权利要求1所述的莫哈韦芽孢杆菌在促进棉花出苗和防治棉花黄萎病中的应用。

7.根据权利要求6所述的莫哈韦芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的莫哈韦芽孢杆菌的菌株经过无菌水稀释100倍处理。

8.一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液的应用，其特征在于，权利要求1-5任一项所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液应用于促进棉花出苗。

9.根据权利要求8所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液经过无菌水稀释50倍处理。

说明书

棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种芽孢杆菌，特别是涉及一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用。

背景技术

[0002] 棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的土传性真菌病害，侵害棉花的维管束系统，被称为“棉花癌症”。在我国最大商品棉生产基地-新疆，由于长年连作、秸秆还田以及病原菌的变异，病害呈逐年加重、扩大趋势，严重阻碍了新疆棉花产业的健康可持续发展。目前防治棉花黄萎病的主要方法有培育抗性品种、喷施化学农药和生物防治。然而，培育抗性品种局限性较大，喷施化学农药对环境污染非常严重。

发明内容

[0003] 本发明的主要目的在于，提供一种新型棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用，所要解决的技术问题是使其防治棉花黄萎病，从而更加适于实用。

[0004] 本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.12885，分类名称为莫哈韦芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)，保藏日期2016年8月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌分离于棉花根际土壤中。

[0005] 本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

[0006] 优选的，前述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌，其中所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌对棉花黄萎病菌菌丝生长的抑菌率为51.23％-56.25％

[0007] 优选的，前述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌，其中所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌分类为莫哈韦芽孢杆菌。

[0008] 优选的，前述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌，其中所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌生长pH为4.5-9.0。

[0009] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，由本发明所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌经过发酵培养制得。

[0010] 本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

[0011] 优选的，前述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其中所述的发酵培养的步骤为：将棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌接入NB培养基中，30-37℃、180-200r·min-1培养60-72h，获得发酵液，发酵液于4-6℃、8000-9000r·min-1离心分离，沉淀为菌体，上清液为发酵滤液。

[0012] 优选的，前述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，其中所述的发酵滤液对棉花黄萎病病菌孢子萌发的抑制率为78.54％-92.47％。

[0013] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌的应用，本发明所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌应用于促进棉花出苗和防治棉花黄萎病。

[0014] 本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提出的一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液的应用，本发明所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液应用于促进棉花出苗。

[0015] 借由上述技术方案，本发明棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用至少具有下列优点：

[0016] 1、本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌对棉花黄萎病菌丝具有显著的拮抗作用，同时可以促进棉花出芽，本发明所筛选棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌是从棉花根际土壤中分离得到的，对植物本身、环境、及人都是安全的，不会使人产生抗药性，也没有剧毒性，在使用过程中不产生有害物质。

[0017] 2、本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵液对棉花黄萎病病菌孢子萌发的抑制率为78.54％-92.47％，同时可以促进棉花发芽。

[0018] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

[0019] 图1是菌株H14的生长曲线图。

[0020] 图2是菌株H14的耐盐曲线图。

[0021] 图3是菌株H14及相关标准菌株的16SrDNA序列采用邻接法建立的系统发育树图。

[0022] 图4是菌株H14的耐酸碱曲线图。

[0023] 图5是菌株H14发酵滤液对热稳定图。

[0024] 图6是菌株H14发酵滤液对紫外线稳定图。

[0025] 图7是菌株H14发酵滤液对蛋白酶稳定图。

[0026] 图8是菌株H14发酵滤液对酸碱稳定图。

[0027] 图9是菌株H14促进棉花出苗图。

[0028] 图10是菌株H14发酵滤液促进棉花出苗图。

具体实施方式

[0029] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌、发酵滤液及其应用其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征或特点可由任何合适形式组合。

[0030] 本发明的一个实施例提出的一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.12885，保藏日期2016年8月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌分离于棉花根际土壤中。计本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌为菌株H14，具体的分离筛选方法如实施例1所示。

[0031] 较佳的，本发明的实施例中的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌对棉花黄萎病菌的抑菌率为51.23％-56.25％。

[0032] 较佳的，本发明的实施例所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌分类为莫哈韦芽孢杆菌。

[0033] 较佳的，本发明的实施例中的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌生长pH为4.5-9.0。

[0034] 实施例1

[0035] 取新疆石河子棉田根际土壤10g，置于装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，振荡均-3 -4 -5匀，在80℃水浴中加热20min得到混合液，取1ml混合液进行梯度稀释，分别取10 、10 、10稀释梯度稀释液0.1mL涂布于NA培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)平板上，将上述NA培养基在
30℃黑暗培养24h，挑取形态、大小、色泽不同的单菌落划线纯化，转接到NA斜面培养基上，在4℃保存，得到棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌，即菌株H14。

[0036] 经观察发现：菌株H14在NA平板上单菌落为乳白色、不透明的圆形，湿润粘稠状，边缘不整齐，中间有突起；革兰氏染色结果表明菌株H14为革兰氏阳性菌株，菌体呈杆状。

[0037] 将菌株H14接入到NB培养基中，30℃、180r·min-1培养12h，0.5mL菌株H14接种至装有50mLNB培养基的100mL三角瓶中，每2h测定600nm的吸光值，菌株H14的生长曲线的测试结果如图1所示，由图1可知，菌株H14在18h后生长稳定。

[0038] 取培养14h的菌株H14的菌液，将菌液分别至NaCl浓度为0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.4％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％、10.0％的NB培养基中，其中，接种的菌液和NB培养基体积比为1％，30℃、180r·min-1培养18h，测定600nm的吸光值，菌株H14的耐盐性测试结果如图2所示，由图2可知，菌株H14能耐7.0％NaCl。

[0039] 实施例2

[0040] 将斜面保存的棉花黄萎病病菌转接到PDA平板上活化，8d后，用灭菌打孔器在该棉花黄萎病菌的菌落边缘区域制备直径为5mm菌饼，将菌饼接种在直径为90mm的PDA平板中央，25℃培养4d，在菌饼四周对称位置，距离菌饼20mm处接种实施例1中的菌株H14，以不接种菌株H14的PDA平板为对照，置于25℃培养箱中黑暗培养7d，计算抑菌率为51.23％。

[0041] 实施例3

[0042] 将斜面保存的棉花黄萎病病菌转接到PDA平板上活化，10d后，用灭菌打孔器在该棉花黄萎病菌的菌落边缘区域制备直径为5mm菌饼，将菌饼接种在直径为90mm的PDA平板中央，25℃培养4d，在菌饼四周对称位置，距离菌饼20mm处接种实施例1中的菌株H14，以不接种菌株H14的PDA平板为对照，置于25℃培养箱中黑暗培养10d，计算抑菌率为56.25％。

[0043] 实施例4

[0044] 以16SrDNA通用引物27F/1492R作为PCR引物，以本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌H14基因组DNA为模板，扩增菌株染色体DNA上的16SrDNA基因。PCR产物在含EB的1％琼脂糖上电泳，检测其纯度及片段大小。产物经试剂盒纯化后，送上海美吉生物医药科技有限公司测序。将菌株H14的16SrDNA序列与GenBank中所有已测定的原核生物进行BLAST比较。根据比较结果，利用MEGA4软件中邻接法方法构建系统发育树，bootstrap检验值≥50％，1000次重复。菌株H14的16SrDNA基因序列扩增目的基因序列长度为1435bp。将H14菌株的16SrDNA序列与GenBank中所有已测定的细菌16SrDNA序列进行比对分析，然后通过MEGA 4软件采用邻接法绘制系统发育树。结果表明，供试菌株H14芽孢杆菌属的标准菌株同源相似度都在97％以上，将该菌株归属为芽孢杆菌属。菌株H14与标准菌株NR118290莫哈韦芽孢杆菌处在同一分支，序列相似性高达99.58％。图3为基于菌株H14及相关标准菌株的16SrDNA序列采用邻接法建立的系统发育树图，菌株H14核苷酸序列如下所示。根据16SrDNA序列相似性分析，结合形态特征及生理生化试验，确定菌株H14为莫哈韦芽孢杆菌。

[0045]

[0046]

[0047]

[0048] 实施例5

[0049] 将菌株H14接入NB培养基(营养肉汤培养基)中，30℃、180r·min-1培养14h，得到菌液，将该菌液按1％分别接种至pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的NB培养基中，30℃、180r·min-1培养18h后测定600nm的吸光值。测试结果如图4所示，由图4可知本发明的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌生长pH为4.5-9.0。

[0050] 本发明的另一个实施例提出一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液，由本发明的菌株H14经过发酵培养制得。

[0051] 较佳的，本发明的实施例中的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液其中所述的发酵培养的步骤为：将棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌接入NB培养基中，30-37℃、180-200r·min-1培-1养60-72h，获得发酵液，发酵液于4-6℃，8000-9000r·min 离心分离，沉淀为菌体，上清为发酵滤液。

[0052] 较佳的，本发明的实施例中的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液其中所述的发酵滤液对棉花黄萎病菌孢子的萌发抑制率为78.54％-92.47％。

[0053] 实施例6

[0054] 将菌株H14接入NB培养基中，30℃、200rpm培养60h，获得发酵液，发酵液于4℃，8500r·min-1离心20min分离，沉淀为菌体H14，上清液为发酵滤液。

[0055] 将取5个5mL离心管，每个离心管中添加3mL发酵滤液，将5只试管分别在45℃、65℃、85℃、100℃、121℃恒温水浴锅处理30min，对照液(CK)为不经过热处理的发酵滤液，通过牛津杯法测定对照液和热处理后发酵滤液的对棉花黄萎病菌的抑菌活性，测量抑菌圈直径，每个实验设置3个平行实验，最终数据表示成平均值±标准差的形式，实验测试结果如图5所示，由图5可知，菌株H14的发酵滤液经过高温45-121℃处理后仍具有较强的抑菌性。

[0056] 将发酵滤液置于25W的紫外线灯下，距灯15cm处分别照射处理20min、40min、60min、80min、100min、120min、140min、160min、180min，对照液(CK)为不经过紫外线照射处理的发酵滤液，用牛津杯法测定经紫外线照射处理过的样品及对照液对棉花黄萎病菌的抑菌活性，测量抑菌圈直径，每个实验设置3个平行实验，最终数据表示成平均值±标准差的形式，实验结果如图6所示，由图6可知紫外线照射20-180min处理后仍具有较强的抑菌性。

[0057] 取3个5mL离心管，每个离心管加入3mL发酵滤液，然后分别加胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K至酶反应终浓度为1mg·mL-1，在37℃恒温水浴条件下反应90min，继续在50℃恒温水浴1h终止酶反应，对照液(CK)为不经过酶处理的发酵滤液，用牛津杯法测定经过酶处理过的发酵液和对照液对棉花黄萎病菌的抑菌活性，测量抑菌圈直径，每个实验设置3个平行实验，最终数据表示成平均值±标准差的形式，实验测试结果如图7所示，由图7可知，菌株H14的发酵滤液对胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K具有耐受性。

[0058] 取9个5mL离心管，每个离心管中添加3mL发酵滤液，在25℃下分别调pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，4℃静置过夜，再依次调pH至7.0，对照液(CK)为不经过酸碱处理的发酵滤液，用牛津杯法测定经过酸碱处理过的发酵液和对照液对棉花黄萎病菌的抑菌活性，测量抑菌圈直径，每个实验设置3个平行实验，最终数据表示成平均值±标准差的形式，实验测试结果如图8所示，由图8可知，菌株H14的发酵滤液经过酸碱(pH：2-10)处理后仍具有较强的抑菌性。

[0059] 实施例7

[0060] 将活化的棉花黄萎病菌菌饼接种到装有100mL察氏培养基250mL三角瓶中，26℃、220r·min-1摇床培养7d，用双层纱布除去菌丝，获得孢子悬浮液，用无菌水稀释浓度为1×
5 -1
10个·mL ，取0.1mL孢子稀释液涂布于PDA培养基平板上(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，然后等距放置两个牛津杯，向牛津杯中加入经微孔滤膜(滤孔：0.22μm)过滤除菌的实施例5中的发酵滤液200μL，设置三组平行实验，25℃培养7d，测量抑菌圈直径为18mm.[0061] 实施例8

[0062] 分别取1％wt葡萄糖溶液、浓度为1×105个·mL-1黄萎病病菌孢子悬浮液和菌株H14发酵滤液各30μL滴于凹玻片内，以无菌水代替菌株H14发酵滤液作为对照，将凹玻片放于铺有湿润滤纸的培养皿内保持湿度，26℃培养，实验设三次重复；菌株H14发酵滤液分别稀释10倍、稀释20倍，用稀释10倍、稀释20倍的菌株H14发酵滤液进行以上实验，其他条件不变；以无菌水替代菌株H14发酵滤液作为对比实验。6h后使用显微镜(10×40)观察分生孢子的萌发情况，计算孢子萌发率。孢子萌发率(％)＝(萌发孢子数/总孢子数)×100％；孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100％。测试结果如表1所示。

[0063] 表1 菌株H14发酵滤液对棉花黄萎病菌孢子萌发抑制作用

[0064]

[0065] 由表1可知，菌株H14的发酵滤液对棉花黄萎病病菌孢子萌发的抑制率为78.54-92.47％。

[0066] 本发明的另一个实施例提出一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌的应用，本发明所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌应用于促进棉花出苗和防治棉花黄萎病。

[0067] 实施例9

[0068] 挑选饱满、大小一致的棉花种子，75％乙醇浸泡45s，无菌水冲洗3次，然后将种子浸于10％H2O2中2h，再用无菌水冲洗3次，将表面杀菌的种子播种于装有2/3的体积发芽盒中。将实施例5中的菌体H14分别用无菌水分别稀释10、100、1000倍，将稀释后的菌体H14水悬液分别浇灌到3个上述装棉花种子的体积营养盒，记A1,A2,A3，对照组用无菌水浇灌，记为S，每个实验设置3个平行实验，最终数据表示成平均值±标准差的形式，每盒浇灌量为350mL，温室25℃培养，每天调查出苗数，实验结果如图9所示，由图9可知，菌株H14可以促进棉花出苗，其中经无菌水稀释100倍的菌株处理出苗效果最好。

[0069] 实施例10

[0070] 棉花种子表面杀菌后，25-30℃下催芽，种子露白后播种装有灭菌土的营养袋中，每袋1株，常规管理。待棉苗长至2片真叶时灌根接种菌株H14发酵液，每袋接种5mL(菌体个数：1×107个·mL-1)，24h后伤根接种棉花黄萎病菌孢子悬浮液5mL(1×107个·mL-1)；设置两组对照，对照组1：棉花种子表面杀菌后，25-30℃下催芽，种子露白后播种装有灭菌土的营养袋中，每袋1株，常规管理，待棉苗长至2片真叶时伤根接种棉花黄萎病菌；对照组2：棉花种子表面杀菌后，25-30℃下催芽，种子露白后播种装有灭菌土的营养袋中，每袋1株，常规管理，伤根不接种；每个实验设置3个平行实验。接种后常规管理，25d后记录发病情况，每个实验的发病情况如表2所示。

[0071] 表2 棉花的发病情况

[0072]  发病率(％) 病情指数 防治效果(％)
菌株H14发酵液接种组 30.20±0.08 16.70±1.80 79.40±0.90
对照组1 100.00±0.00 81.20±5.00 /
对照组2 0.00±0.00 0.00±0.00 /

[0073] 由表2可知，棉花根际接种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌H14显著降低了棉花黄萎病的病情指数，定殖25d后温室相对防效达到80％。

[0074] 本发明的另一个实施例提出一种棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液的应用，本发明所述的棉花黄萎病拮抗芽孢杆菌发酵滤液应用于促进棉花出苗。

[0075] 实施例11

[0076] 挑选饱满、大小一致的棉花种子，75％乙醇浸泡45s，无菌水冲洗3次，然后将种子浸于10％H2O2中2h，再用无菌水冲洗3次，将表面杀菌的种子播种于装有2/3的体积营养盒中。将实施例5中的发酵滤液分别用无菌水分别稀释10、20、50倍，将稀释后的发酵滤液分别浇灌到3个上述装棉花种子的体积营养盒，记B1,B2,B3，对照组用无菌水浇灌，记为S，每个实验设置3个平行实验，最终数据表示成平均值±标准差的形式，每盒浇灌量为350mL，温室25℃培养，每天调查出苗数，实验结果如图10所示，由图10可知，菌株H14的发酵滤液可以促进棉花出苗，其中经无菌水稀释50倍的发酵滤液出苗效果最好。

[0077] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。