硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用

摘要

本发明提供了硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用。将硫氢化钠配制成5～15μmol/L硫氢化钠水溶液，加入到IPTG诱导大肠杆菌外源蛋白质表达的体系中，可促进外源蛋白质的表达。

权利要求

1.硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用，以分别含有外源GFP，RFP基因的大肠杆菌BL21菌株为实验材料，在IPTG诱导GFP，RFP外源基因表达的体系中，加入一定浓度的硫氢化钠可以促进外源基因表达，所述硫氢化钠浓度为5～15μmol/L硫氢化钠水溶液。

2.如权利要求1所述的硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用，所述硫氢化钠浓度为10μmol/L。

说明书

硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及硫氢化钠的新用途，确切地说是硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用。技术背景

[0002] IPTG诱导大肠杆菌外源基因表达是分子生物学和基因工程结合的经典方法，为促进分子生物学的发展提供了强有力的帮助。大肠杆菌外源基因表达系统具有遗传背景清楚、操作简单、生长繁殖快、产量高、表达产物纯化过程简单、产物稳定性好、不易污染以及应用范围广等优点，被广泛应用于各种重组蛋白表达。目前，人们已经利用大肠杆菌表达了多种蛋白产品，如抗生素、激素、免疫制剂、抗肿瘤药物、蛋白酶制剂等。

[0003] 尽管大肠杆菌蛋白表达体系优点众多，但由于基因结构、mRNA稳定性和翻译效率、蛋白质折叠等差异，以及宿主细胞蛋白酶对外源蛋白质的降解等原因，并非每一种蛋白质都能被有效表达。因此，促进外源蛋白质在大肠杆菌中有效表达的方法具有重要意义。

[0004] 硫氢化钠溶于水会释放硫化氢，硫化氢作为气体信号分子，在动物体内具有抑制细胞增殖、降低血压、调节血管及神经系统等功能；在植物体中，硫化氢可以调节植物气孔运动、缓解氧化伤害、提高植物对干旱、低温、重金属等胁迫的耐受。

发明内容

[0005] 本发明旨在提供硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用，提高外源蛋白质的含量。

[0006] 本发明提供硫氢化钠在促进大肠杆菌外源蛋白质表达中的应用。以分别含有外源GFP，RFP基因的大肠杆菌BL21菌株为实验材料，在IPTG诱导GFP，RFP外源基因表达的体系中，加入一定浓度的硫氢化钠可以促进外源基因表达。

[0007] 所述硫氢化钠浓度为10mmol/L，现配现用。诱导大肠杆菌表达外源基因时，将配置的硫氢化钠水溶液与IPTG同时加入到大肠杆菌培养液LB中，硫氢化钠在LB培养液中的终浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L。优选浓度为10μmol/L

[0008] 试验结果表明本处理方法可以促进外源GFP，RFP基因的表达，GFP和RFP蛋白质含量升高。

附图说明

[0009] 图1是0、5μmol·L-1、10μmol·L-1和15μmol·L-1终浓度的硫氢化钠对三种IPTG浓度诱导下(0.1mmol·L-1，0.5mmol·L-1，1mmol·L-1)，大肠杆菌表达GFP蛋白的情况，A是利用酶标仪检测GFP的荧光值；B结果示意图。

[0010] 图2是0、5μmol·L-1、10μmol·L-1和15μmol·L-1终浓度的硫氢化钠对三种IPTG浓-1 -1 -1度诱导下(0.1mmol·L ，0.5mmol·L ，1mmol·L )，大肠杆菌表达RFP蛋白的情况，A是利用酶标仪检测RFP的荧光值；B结果示意图。

[0011] 图3是三种浓度的IPTG诱导大肠杆菌BL21菌株表达GFP/RFP蛋白时，5μmol·L-1、10μmol·L-1和15μmol·L-1终浓度的硫氢化钠相对于不加硫氢化钠诱导时，促进GFP/RFP蛋白表达的百分比。

[0012] 图4是三种浓度的IPTG诱导大肠杆菌BL21菌株表达GFP/RFP蛋白时，0、5μmol·L-1、10μmol·L-1和15μmol·L-1终浓度的硫氢化钠处理后，大肠杆菌BL21菌株表达GFP/RFP蛋白的SDS-PAGE电泳检测。

具体实施方式

[0013] 以下给出本发明的非限定实施例。

[0014] 诱导BL21菌株表达GFP/RFP的培养与处理条件

[0015] 配制150mL的LB液体培养基，分装在3个100mL的锥形瓶中，每瓶50mL，高压蒸汽灭菌锅灭。(LB培养基配方：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用1L去离子水溶解)。

[0016] 分别将外源表达GFP/RFP的大肠杆菌BL21菌种转接到50mL LB液体培养基，于37℃摇床培养，至OD600＝0.6～0.8。在超净台分别将培养好的大肠杆菌分装至2mL的EP管中，每管1.5mL菌液，分别加入不同浓度的IPTG和NaHS，其中不加IPTG的为CK，其余NaHS和IPTG的浓度如下：

[0017]

[0018] 将EP管放入摇床(16℃，转速160rpm)，14小时后离心集菌，去上清。收集的菌体在液氮和60℃水浴反复冻融5次，分别加入200μL PBS缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)，震荡混匀后离心，取150μL上清液加入酶标板，酶标仪检测GFP或RFP的荧光值。

[0019] 酶标仪检测GFP表达，结果如图1，CK为不加IPTG和NaHS；GA、GB、GC分别表示IPTG诱导GFP表达的工作浓度为0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L；0/1/2/3表示NaHS的终浓度分别为0、5μmol·L-1、10μmol·L-1和15μmol·L-1。

[0020] 酶标仪检测RFP表达，结果如图2，CK为不加IPTG和NaHS；RA、RB、RC分别表示IPTG诱导RFP表达的工作浓度为0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L；0/1/2/3表示NaHS的终浓度分别为0、5μmol·L-1、10μmol·L-1和15μmol·L-1。

[0021] 根据酶标仪检测结果，计算NaHS促进GFP/RFP表达的百分比，GFP计算公式为(GN-G0)/G0·100％，GN表示不同浓度的IPTG和NaHS处理组合；RFP计算公式为(RN-G0)/R0·100％，RN表示不同浓度的IPTG和NaHS处理组合。结果见图3，NaHS促进IPTG诱导GFP/RFP表达。

[0022] NaHS处理不同浓度IPTG诱导大肠杆菌表达GFP/RFP，大肠杆菌总蛋白的SDS-PAGE检测结果如图4，NaHS促进IPTG诱导GFP/RFP表达，各样品的总蛋白上样量相等。

[0023] 由以上结果可知，本发明能够明显促进IPTG诱导大肠杆菌表达外源蛋白的效率。