蒽贝素的质量控制方法

摘要

本发明公开了一种蒽贝素的质量控制方法，特别是以酸藤子属植物酸藤子（Embelia laeta(Linn.)Mez）成熟干果为原料，提取高纯度蒽贝素并对其进行检测的方法，其过程是：取酸藤子植物提取后，以酸藤子干果为原料，用乙醚提取，经硅胶柱层析分离，用TLC检测合并，收集含有蒽贝素的流分，再用反相制备高效液相法分离，对所收集的每一份洗脱液利用分析型高效液相色谱检测，合并保留高纯度蒽贝素组分，采用薄层色谱和液相色谱进行质量控制，该方法不仅能提高蒽贝素纯度，而且能降低生产成本。

权利要求

1.一种蒽贝素的质量控制方法，其特征在于：以酸藤子属植物酸藤子成熟干果为原料，提取高纯度蒽贝素，然后对其进行检测；

所述高纯度蒽贝素的制备方法如下：

1）提取：取酸藤子成熟干果，加乙醚提取，浓缩，过滤，经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯溶液体系进行梯度洗脱，收集含有蒽贝素的洗脱液，合并，浓缩，即得蒽贝素粗结晶；

2）精制：用制备型高效液相色谱法分离纯化蒽贝素粗结晶，用C-18色谱柱，配合甲醇-水体系进行梯度洗脱，用甲醇-水体系将蒽贝素粗结晶溶解后，注入制备型高效液相色谱仪，收集纯度在90%以上的蒽贝素溶液，减压浓缩，即得；

所述蒽贝素的检测包括采用薄层色谱法进行定性检测和采用高效液相色谱法进行定量检测，检测过程如下：（1）采用薄层色谱法进行定性检测：用蒽贝素对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，层析板用3%草酸浸泡过，分别以甲苯-乙酸乙酯重量比例10-15:1-2为展开剂，石油醚：乙酸乙酯重量比例10-15:1.2-2为展开剂，石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5-

8:5-8:1-2为展开剂；然后浓硫酸乙醇显色，置于白光下检视，在薄层色谱中三个展开系统下均为黄色的单一的荧光斑点，则代表纯度符合要求，否则不符合要求；

取蒽贝素样品用甲醇制1mg/ml的溶液，在同一硅胶G层析板上，层析板用3%草酸浸泡过，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20μg、40μg、60μg、80μg、100μg；分别以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1为展开剂，或者石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2为展开剂，或者石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5:5:1为展开剂；置展开缸分别展开，展距为15cm，然后浓硫酸乙醇显色，置于白光下检视，在5个不同浓度的梯度点样及三个展开系统薄层色谱中，均为黄色的单一的荧光斑点；

（2）采用高效液相色谱法进行定量检测：其色谱条件为：

色谱柱为十八烷基键合硅胶填充剂；

分别以乙腈-醋酸水体积比为10-90:90-10，甲醇-醋酸水体积比为20-80:90-10为流动相；

检测波长280-310nm；

流速为0.5～5毫升/分钟；

含量与纯度测定：分别用2个流动相溶剂系统和2个检测波长，记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，结果系统测定样品含量在均98%以上；杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于

2.0%。

2.根据权利要求1所述的蒽贝素的质量控制方法，其特征在于：所述的以乙腈-醋酸水体积比为85:15，甲醇-醋酸水体积比为87:13为流动相；

检测波长290nm；

流速为0.8～1.2毫升/分钟。

3.根据权利要求1所述的蒽贝素的质量控制方法，其特征在于：所述步骤1)中，梯度洗脱时分组收集不同浓度的洗脱液，不同洗脱液采用薄层色谱法检测，用蒽贝素对照品参比的方法，其色谱条件为:以硅胶G为层析板，层析板用3%草酸浸泡过，以甲苯-乙酸乙酯重量比例10-15：1-2为展开剂，或者石油醚：乙酸乙酯重量比例10-15:

1.2-2为展开剂，或者石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5-8：5-8：1-2为展开剂，展距为15cm；

浓硫酸乙醇显色，置于白光下检视，选择在薄层色谱中，黄色单一荧光斑点亮度高的洗脱液，合并，浓缩，即得蒽贝素粗结晶。

4.根据权利要求1所述的蒽贝素的质量控制方法，其特征在于：所述的步骤2)精制中，分别收集纯度在90%-98%之间和纯度大于98%以上的洗脱液，减压浓缩，得到纯度在90%-98%之间以及大于98%以上的蒽贝素。

5.根据权利要求1所述的蒽贝素的质量控制方法，其特征在于：所述的步骤2)精制中，收集纯度在90%以上的蒽贝素溶液后，采用高效液相色谱再次测定其纯度，其色谱条件为：色谱柱为十八烷基键合硅胶填充剂；

分别以乙腈-醋酸水体积比为10-90:90-10，甲醇-醋酸水体积比为20-80:90-10为流动相；

检测波长280-310nm；

流速为0.5～5毫升/分钟。

说明书

蒽贝素的质量控制方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种药材化学对照品的质量控制方法领域，具体涉及一种蒽贝素的提取和质量控制方法。

背景技术

[0002] 蒽贝素是一种二萜糖苷类化学成分，是植物活性成分之一，也是许多植物和药品标准质量控制的指标性成分。目前尚未相应的国家药品标准物质，国内外对蒽贝素对照品的系统研究未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对蒽贝素化学对照品进行研究，建立蒽贝素化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立蒽贝素化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。

[0003] 高纯度的蒽贝素对照品，是控制植物酸藤子及含酸藤子的质量的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的蒽贝素对照品，其市场需求很大，由于蒽贝素在药材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行蒽贝素中药化学标准品制备及其质量控制技术研究，解决高纯度蒽贝素化学对照品的问题，对中药现代化的作用是显而易见的，具有重大的实际意义和学术价值。

[0004] 蒽贝素是从酸藤子植物分离得到的活性物质，已有文献报道蒽贝素的提取方法，如：1.【题名】应用水溶助长剂从酸藤果中提取摁贝素：建立一种用水溶助长剂从酸藤果中提取摁贝素的方法。酸藤果经干燥，粉碎，加入异丙苯磺酸钠(Na CS)水溶液，搅拌，滤过。滤液加酸水稀释到最小助溶浓度(MHC)以下，静置60 min使摁贝素沉淀，悬液离心分离富含摁贝素提取物。结果最佳提取条件如下，提取温度:25 30℃，药材粉粒度:100目，水溶助长剂~浓度:2.0 mol/L，搅拌提取时间:60 min。该方法提取率>90%，蒽贝素纯度>85%。

[0005] 上述方法论述了蒽贝素的提取分离，分离纯度较高，但纯度均未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，分离过程繁琐，且没有蒽贝素纯度与质量控制方法，无法满足高纯度蒽贝素化学对照品的需要。

发明内容

[0006] 本发明的目的为了克服现有的蒽贝素提取纯度低、收率低或生产成本高的不足，以及无系统蒽贝素提取纯化与质量控制方法，提供一种高纯度蒽贝素的制备及其质量控制方法，该方法制备得到的蒽贝素纯度高、质量好，可以作为化学对照品或标准品，质量控制方法有效、稳定、均一。

[0007] 本发明药材来源：

[0008] 酸藤子：紫金牛科酸藤子属植物酸藤子Embelia laeta (L.) Mez的叶子。

[0009] 蒽贝素：从酸藤子中提取、分离、精制、纯化而制得，英文名：Embelin。

[0010] 分子式：C17H26O4；

[0011]

[0012] 结构式：

[0013] 本发明蒽贝素的质量控制方法通过以下方案来实现的：

[0014] 蒽贝素的质量控制方法可以采用高效液相色谱法测定，其色谱条件如下：

[0015] 色谱柱为十八烷基键合硅胶填充剂；

[0016] 分别以乙腈-水体积比为10-90:90-10，甲醇-水体积比为20-80:90-10为流动相；

[0017] 检测波长280-310nm；

[0018] 流速为0.5～5毫升/分钟。

[0019] 优选地，采用高效液相色谱法测定时，色谱条件如下：

[0020] 分别以乙腈-水体积比为10-90:90-10，甲醇-水体积比为20:80-90:10为流动相；

[0021] 流速为0.8～1.2毫升/分钟。

[0022] 蒽贝素的质量控制方法还包括薄层色谱检测方法，可以在蒽贝素粗结晶制备的时候进行快速预检测，提高蒽贝素粗结晶的质量，也可以在精制获得结晶后，进行质量监控，该方法用蒽贝素对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，层析板用3%草酸浸泡过，以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1为展开剂，石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2为展开剂，石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1为展开剂；然后浓硫酸乙醇显色，置于白光下检视，在薄层色谱中三个展开系统下均为黄色的单一的荧光斑点，则代表纯度符合要求，否则不符合要求。

[0023] 优选地，蒽贝素的质量控制方法中薄层色谱检测方法为：

[0024] 取蒽贝素样品用甲醇制1mg/ml的溶液，在同一硅胶G层析板上，层析板用3%草酸浸泡过，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20μg、40μg 、60μg、80μg、100μg；分别以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1为展开剂，石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2为展开剂，石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1为展开剂；置展开缸分别展开，展距为15cm，然后浓硫酸乙醇显色，置于白光下检视，在5个不同浓度的梯度点样及三个展开系统薄层色谱中，均为黄色的单一的荧光斑点。

[0025] 本发明所述的蒽贝素的质量控制方法，其特征在于，所述的蒽贝素样品由以下方法制备而成：

[0026] 1）提取：取酸藤子成熟干果，加乙醚提取，浓缩，过滤，经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯溶液体系进行梯度洗脱，收集含有蒽贝素的洗脱液，合并，浓缩，即得蒽贝素粗结晶；

[0027] 2）精制：用制备型高效液相色谱法分离纯化蒽贝素粗结晶，用C-18色谱柱，配合甲醇-水体系进行梯度洗脱，用甲醇-水体系将蒽贝素粗结晶溶解后，注入制备型高效液相色谱仪，收集纯度在90%以上的蒽贝素溶液，减压浓缩，即得。

[0028] 优选地，所述步骤1)中，梯度洗脱时分组收集不同浓度的洗脱液，不同洗脱液采用薄层色谱法检测，用蒽贝素对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，层析板用3%草酸浸泡过，以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1为展开剂，或者石油醚：乙酸乙酯重量比例
10:1.2为展开剂，或者石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1为展开剂展距为15cm；然后浓硫酸乙醇显色，置于白光下检视，选择在薄层色谱中，黄色单一荧光斑点亮度高的洗脱液，合并，浓缩，即得蒽贝素粗结晶。

[0029] 优选地，所述的步骤2)精制中，分别收集纯度在90%-98%之间和纯度大于98%以上的洗脱液，减压浓缩，得到纯度在90%-98%之间以及大于98%以上的蒽贝素。

[0030] 优选地，所述的步骤2)精制中，收集纯度在90%以上的蒽贝素溶液后，采用高效液相色谱法再次测定其纯度，其色谱条件为：

[0031] 色谱柱为十八烷基键合硅胶填充剂；

[0032] 分别以乙腈-水体积比为10-90:90-10，甲醇-水体积比为20-80:90-10为流动相；

[0033] 检测波长280-310nm；

[0034] 流速为0.5～5毫升/分钟。

[0035] 与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

[0036] 1、本发明提取的蒽贝素纯度很高，可以达到98%以上，纯度符合化学对照品要求，解决了蒽贝素化学对照品的供应问题，为酸藤子药材的质量控制提供了提供科学基础和保证。

[0037] 2、本发明设计合理，工艺简单，利用水溶剂提取，经过硅胶柱层析后即可得到纯度较高的蒽贝素，最后经制备高效液相色谱法制备出纯度达到98%以上的蒽贝素化学对照品，方法简便易行。

[0038] 3、本发明分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。

[0039] 4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确保产品的质量。

[0040] 通过对蒽贝素化学对照品进行研究，建立蒽贝素化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立蒽贝素化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。研究结果可为蒽贝素化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。

附图说明

[0041] 分别取实施例1的最终样品在流动相为乙腈-醋酸水体积比为85:15系统下检测。

[0042] 图1：蒽贝素色谱峰紫外吸收光谱图；

[0043] 图2：蒽贝素色谱峰纯度检查三维光谱图，表明为单一纯物质峰；

[0044] 图3：蒽贝素 DAD峰纯度检查HPLC色谱图(>98%)，色谱图为单一的峰，表明为纯物质峰；

[0045] 图4：蒽贝素质量控制的HPLC检测色谱图，主成分蒽贝素的含量大于98.0%。其中图4中分析结果表
定量方法：归一化法

[0046]

具体实施方式

[0047] 实施例1：高纯度蒽贝素的制备

[0048] 取酸藤子成熟干果，加乙醚提取3次，每次加乙醚量为药材重量8倍，每次提取时间为2小时，合并提取液，过滤，滤液浓缩，得浸膏，经硅胶柱吸附，用石油醚-乙酸乙酯（0: 100～90:10）梯度洗脱，收集含有蒽贝素的洗脱部分，浓缩，得到蒽贝素粗结晶。

[0049] 将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C-18柱；流动相：甲醇:水体积比为87:13；检测波长为290nm；流速为5ml/min），分别收集纯度在90%-98%之间和纯度大于98%以上的洗脱液，减压浓缩，得到纯度在90%-98%之间以及大于98%以上的蒽贝素。

[0050] 用HPLC分析方法对所有制备液进行检测：色谱柱C-18柱；流动相为乙腈:醋酸水体积比为85:15；检测波长为290nm；流速1ml/min；合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于重量98%以上的蒽贝素制备液，减压浓缩，得到纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的蒽贝素红褐色粉末。

[0051] 实施例2：高纯度蒽贝素的制备

[0052] 取酸藤子成熟果子，加乙醚提取2次，每次加乙醚量为药材重量10倍，每次提取时间为3小时，滤过，合并滤液，浓缩，得浸膏，提取物经硅胶柱吸附，用石油醚-乙酸乙酯（0: 100～85:15）梯度洗脱，收集含有蒽贝素的洗脱部分，浓缩，得到蒽贝素粗结晶。

[0053] 将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C-18柱；流动相甲醇:水体积比为80:20；检测波长为290nm；流速为5ml/min），分别收集纯度在90%-98%之间和纯度大于98%以上的洗脱液，减压浓缩，得到纯度在90%-98%之间以及大于98%以上的蒽贝素。

[0054] 用HPLC分析方法对所有制备液进行检测：色谱柱：C-18柱；流动相乙腈: 醋酸水体积比为80:20；检测波长为290nm；流速为1ml/min）；合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于重量98%以上的蒽贝素，减压浓缩，得到纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的蒽贝素红褐色粉末。

[0055] 实施例3：高纯度蒽贝素的制备

[0056] 取酸藤子成熟干果，加乙醚提取8次，每次加乙醚量为药材重量2倍，每次提取时间为1小时，滤过，合并滤液，浓缩，得浸膏，提取物经硅胶柱吸附，用石油醚-乙酸乙酯（0: 100～80:20）梯度洗脱，收集含有蒽贝素的洗脱部分，浓缩，得到蒽贝素粗结晶。

[0057] 用HPLC检测，收集含有蒽贝素的流分，合并，浓缩，得到蒽贝素粗结晶。将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C-18柱；流动相甲醇:水体积比为90:10；检测波长为290nm；流速为5ml/min），分别收集纯度在90%-98%之间和纯度大于98%以上的洗脱液，减压浓缩，得到纯度在90%-98%之间以及大于98%以上的蒽贝素。

[0058] 用HPLC分析方法对所有制备液进行检测：色谱柱：C-18柱；流动相：乙腈:醋酸水体积比为90:10；检测波长为290nm；流速为1ml/min）；合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于重量98%以上的蒽贝素，减压浓缩，得到纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的蒽贝素红褐色粉末。

[0059] 实施例4：蒽贝素的检测

[0060] 取实施例1-3制得的含量在98%以上的蒽贝素，通过以下质量控制方法进行检测：

[0061] 1、薄层色谱检测方法：

[0062] 分别取实施例1-3的最终样品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅胶G为层析板上，层析板用3%草酸浸泡过，分别按20μg、40μg、60μg、80μg、100μg不同的浓度梯度点样；分别采用以下展开剂系统置展开缸分别展开，展距为15cm：

[0063] 展开剂系统1：以甲苯-乙酸乙酯重量比例10：1；

[0064] 展开剂系统2：以甲苯-乙酸乙酯重量比例9：1；

[0065] 展开剂系统3：石油醚：乙酸乙酯重量比例10:1.2；

[0066] 展开剂系统4：石油醚：乙酸乙酯重量比例9:1；

[0067] 展开剂系统5：石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例5：5：1；

[0068] 展开剂系统6：石油醚-甲苯-乙酸乙酯重量比例7:7:1；

[0069] 展开后取出，晾干，碘显色，置白光下检视；结果在薄层色谱中，可见黄色的单一的荧光斑点，6种展开剂系统，3个样品5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。

[0070] 2、高效液相色谱法：

[0071] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0072] 分别采用以下流动相系统，流速为1.0毫升/分钟：

[0073] 流动相系统1：乙腈-醋酸水溶液体积比为85:15；

[0074] 流动相系统2：乙腈-醋酸水溶液体积比为90:10；

[0075] 流动相系统3：乙腈-醋酸水溶液体积比为80:20；

[0076] 流动相系统4：甲醇-醋酸水体积比为87:13；

[0077] 流动相系统5：甲醇-醋酸水体积比为90:10；

[0078] 流动相系统6：甲醇-醋酸水体积比为80:20；

[0079] 检测波长分别为290nm、310nm，理论板数按蒽贝素峰计算应不低于3000。

[0080] 测定法 取于105℃干燥至恒重的本品适量，精密称定，分别加以上六个流动相系统溶液制成每1ml含3mg的溶液，摇匀，精密量取 10μg注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，结果样品测定蒽贝素含量在均98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%。

[0081] 峰纯度检测：取对照品适量，分别按以上两个流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，蒽贝素的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。

[0082] 【结构确证】

[0083] UV λCDCl3max nm：290nm。

[0084] IRν KBr max cm-1 ：3300（-OH），1640（羰基）、1608（苯环）。

[0085] 橙红色结晶，mp 141-143℃。EI-MS m/z: 294[M]+, 154[M-C11H20]+ (100)。1H-NMR (600MHz,CDCl3) δ ppm：6.03 (1H, s, H-6), 2.40 (2H, t, J=7.5 Hz, H-1ʹ), 1.43 (2H, m, H-2) , 1.28-1.30 (16H, m, H-3ʹ 10ʹ), 0.89(3H, t, J=6.6Hz, H-11ʹ)；13C-~NMR (150 MHz, CDCl3) δ ppm：117.0 (C-3), 102.2 (C-6), 22.52 (C-1ʹ)~31.9(C-10ʹ), 14.1 (C-11ʹ)。

[0086] 实验结果表明：本发明分离、纯化的蒽贝素化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经本发明公开的6个展开系统TLC检测，6个流动相系统和2个不同波长的HPLC检测，同时对色谱峰用DAD做纯度检查，表明符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于98%。