可植入治疗递送系统及其方法

摘要

本发明涉及一种可植入治疗递送系统；利用所述可植入治疗递送系统进行治疗的方法；以及制造所述可植入递送系统的方法。本发明的第一方面涉及一种可植入治疗递送系统。这个治疗递送系统包括基底、包围所述基底的内部聚合涂层和包围所述内部聚合涂层的外部水凝胶涂层。一种或多种治疗剂位于所述外部水凝胶涂层中。

权利要求

1.一种可植入治疗递送系统，其包括：

基底；

包围所述基底的内部聚合涂层；和

包围所述内部聚合涂层的外部水凝胶涂层，其中所述外部水凝胶涂层与内部聚合涂层交联，并且其中一种或多种治疗剂位于所述外部水凝胶涂层中。

2.根据权利要求1所述的可植入治疗递送系统，其中所述基底是伸长纤维，并且所述治疗剂沿所述伸长纤维的长度位于所述外部水凝胶涂层内。

3.根据权利要求1所述的可植入治疗递送系统，其中所述基底是两个或更多个扭曲在一起以形成扭曲伸长纤维的伸长纤维的组合，并且所述治疗剂沿所述扭曲伸长纤维的长度位于所述外部水凝胶涂层内。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的可植入治疗递送系统，其中所述基底包含气体渗透性材料，并且具有一个或多个内部流体间隙，其中所述一个或多个内部流体间隙充当一种或多种生物试剂的储集囊。

5.一种可植入治疗递送系统，其包括：

基底，其中所述基底含有并释放适于促进基底材料与外部生物可相容聚合涂层之间交联的交联剂；和包围所述基底的外部生物可相容聚合涂层，其中生物可相容聚合涂层是水凝胶材料，并且其中所述基底具有一个或多个内部间隙，其中一种或多种治疗剂位于一个或多个内部间隙中。

6.根据权利要求4所述的可植入治疗递送系统，其中所述基底的所述一个或多个内部流体间隙包含氧载体材料。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的可植入治疗递送系统，其中所述基底是固体基底。

8.根据权利要求1或5所述的可植入治疗递送系统，其中所述聚合涂层是多孔的。

9.根据权利要求1所述的可植入治疗递送系统，其中所述聚合涂层沿所述基底的长度形成单独锚定粒子。

10.根据权利要求1或5所述的可植入治疗递送系统，其中聚合涂层含有二价阳离子。

11.根据权利要求1或5所述的可植入治疗递送系统，其中所述外部水凝胶涂层包含海藻酸盐。

12.根据权利要求1所述的可植入治疗递送系统，其中所述外部水凝胶和聚合涂层是交联的。

13.根据权利要求1-3中任一项所述的可植入治疗递送系统，其中所述治疗剂从位于所述外部水凝胶涂层内的细胞的制剂释放。

14.根据权利要求13所述的可植入治疗递送系统，其中所述细胞是胰岛细胞。

15.根据权利要求13所述的可植入治疗递送系统，其中所述细胞是干细胞。

16.根据权利要求1-5中任一项所述的可植入治疗递送系统在制造用于将治疗剂递送至受试者的装置中的用途。

17.根据权利要求1-5中任一项所述的可植入治疗递送系统在制造用于将治疗剂递送至糖尿病受试者的装置中的用途。

18.一种制备可植入治疗递送系统的方法，所述方法包括：提供基底；

用聚合物溶液涂布所述基底；以及

在所述涂布基底上提供包含一种或多种治疗剂的外部水凝胶层，其中所述外部水凝胶层与所述涂布基底交联。

说明书

可植入治疗递送系统及其方法

[0001] 本申请要求2014年6月9日提交的美国临时专利申请序列号62/009,674的权益，所述美国临时专利申请据此以引用的方式整体并入本文。发明领域

[0002] 本发明涉及一种可植入治疗递送系统；利用所述可植入治疗递送系统进行治疗的方法；以及制造所述可植入递送系统的方法。

[0003] 发明背景

[0004] 1型糖尿病(“T1D”)是一种自体免疫疾病，其中身体的自身免疫系统攻击和破坏胰腺中的产胰岛素β细胞。据估计T1D仅仅在美国就影响多达300万人，其中每天有80名新患者被确诊。估计T1D在年龄不到14岁的儿童之中的发生率在世界范围内每年增加3％。尽管通过注射或输注外源性胰岛素来小心和严密控制血糖水平允许T1D患者维持生命，但所述方法要求恒久关注和严格顺应。其不治愈疾病或防止它的许多毁灭性影响，诸如致盲、高血压、肾病、神经病变、血管疾病、心脏病和中风(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group，“The Effect of Intensive Treatment of Diabetes on the Development and Progression of Long-Term Complications in Insulin-Dependent Diabetes Mellitus，”N.Engl.J.Med.329：977-986(1993)以及Writing Team for the Diabetes Complications Trial/Epidemiology of Diabetes&Complications Research，“Sustained Effect of Intensive Treatment of Type 1 Diabetes Mellitus on Development and Progression of Diabetic Nephropathy：The Epidemiology of 
Diabetes Interventions and Complications(EDIC)Study，”JAMA 290：2159-2167
(2003))。

[0005] 移植胰岛细胞提供一种针对T1D的潜在替代性治疗，并且已显示会使血糖恢复正常(Shapiro等，“Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen，”N.Engl.J.Med.343：230-238(2000)以及Shapiro等，“International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation，”N.Engl.J.Med.355：1318-1330
(2006))。然而，为避免免疫排斥，患者需要服用已知会导致有害副作用的长期免疫抑制药物(Weir等，“Scientific and Political Impediments to Successful Islet 
Transplantation,”Diabetes 46：1247-1256(1997)以及Naftanel等，“Pancreatic Islet Transplantation，”PLoSMed.1：e58(2004))。胰岛细胞移植的广泛应用也受限于适当供体的极大短缺(Weir等，“Scientific and Political Impediments to Successful Islet Transplantation，”Diabetes 46：1247-1256(1997)以及Naftanel等，“Pancreatic Islet Transplantation，”PLoS Med.1：e58(2004))。

[0006] 移植囊封化免疫保护胰岛细胞是一种用以逆转T1D的更具吸引力且极有前途的方式(Chang，“Therapeutic Applications of  Polymeric Artificial Cells，”Nat.Rev.Drug Discov.4：21-235(2005)；Orive等，“Cell Encapsulation：Promise and Progress，”Nat.Med.9：104-107(2003)；以及Calafiore，“Alginate Microcapsules for Pancreatic Islet Cell Graft Immunoprotection：Struggle and Progress Towards the Final Cure for Type 1 Diabetes Mellitus，”Expert Opin.Biol.Ther.3：201-205(2003))。胰岛细胞移植避免终身免疫抑制，并且也允许使用其它类型的细胞，诸如来自猪的异种异体胰岛(Brandhorst等，“Isolation of Islands of Langerhans from Human and Porcine Pancreas for Transplantation to Humans，”Zentralbl.Chir.123：814-
822(1998)；0’Sullivan等，“Islets Transplanted in Immunoisolation Devices：A Review of the Progress and the Challenges that Remain，”Endocr.Rev.32：827-844(2011)；以及Dufrane等，“Macro-or Microencapsulation of Pig Islets to Cure Type 
1 Diabetes，”World J.Gastroenterol.18：6885-6893(2012))或干细胞源性细胞(Kroon等，“Pancreatic Endoderm Derived from Human Embryonic Stem Cells Generates Glucose-Responsive Insulin-Secreting Cells In vivo，”Nat.Biotechnol.26：443-452(2008)以及Rezania等，“Maturation of Human Embryonic Stem Cell-Derived 
Pancreatic Progenitors Into Functional Islets Capable of Treating Pre-
Existing Diabetes in Mice，”Diabetes 61：2016-2029(2012))。囊封材料或装置保护胰岛免遭宿主免疫排斥，而同时允许进行流畅传质以维持它们的存活和功能。

[0007] 尽管在世界范围内进行了巨大研究尝试，并且在过去30年中已取得重大进展，但胰岛细胞的囊封化的临床应用已由于缺乏可转化囊封系统而仍然难以实现(Scharp等，“Encapsulated Islets for Diabetes Therapy：History，Current Progress，and Critical Issues Requiring Solution，”Adv.Drug Deliv.Rev.67-68：35-73(2013))。当前，存在两种主要类型的胰岛细胞囊封系统：宏观装置和水凝胶微囊，其两者均不幸地具有严重局限。宏观囊封装置，诸如扩散室(Geller等，“Use of an Immunoisolation Device for Cell Transplantation and Tumor Immunotherapy，”Ann.N.Y.Acad.Sci.831：438-451(1997))、水凝胶片(Dufrane等，“Alginate Macroencapsulation of Pig Islets Allows Correction of Streptozotocin-Induced Diabetes in Primates Up to 
6Months Without Immunosuppression，”Transplantation 90：1054-1062(2010))或多孔聚合物中空管(Lacy等，“Maintenance of Normoglycemia in Diabetic Mice by 
Subcutaneous Xenografts of Encapsulated Islets，”Science 254：1782-1784(1991))常常是庞大或脆弱的，并且受困于生物相容性不足和传质不充分(Colton，“Implantable Biohybrid Artificial Organs，”Cell Transplant.4：415-436(1995)；Kuhtreiber等，Cell Encapsulation Technology and Therapeutics，Birkhauser，Boston，1999；
Vaithilingam等，“Islet Transplantation and Encapsulation：An Update on Recent Developments，”Rev.Diabet.Stud.8：51-67(2011)；以及Soon-Shiong，“Treatment of Type I Diabetes Using Encapsulated Islets，”Adv.Drug Deliv.Rev.35：259-270(1999))。

[0008] 在另一方面，海藻酸盐水凝胶微囊易于移植，具有较大传质表面积，并且近来已取得关于它们的生物相容性和长期功能的重大进展(Calafiore，“Alginate Microcapsules for Pancreatic Islet Cell Graft Immunoprotection：Struggle and Progress Towards the Final Cure for Type 1 Diabetes Mellitus，”Expert Opin.Biol.Ther.3：
201-205(2003)；Vaithilingam等，“Islet Transplantation and Encapsulation：An Update on Recent Developments，”Rev.Diabet.Stud.8：51-67(2011)；Smink等，“Toward Engineering a Novel Transplantation Site for Human Pancreatic Islets，”
Diabetes 62：1357-1364(2013)；Jacobs-Tulleneers-Thevissen等，“Sustained Function of Alginate-Encapsulated Human Islet Cell Implants in the Peritoneal Cavity of Mice Leading to a Pilot Study in a Type 1 Diabetic Patient，”Diabetologia 
56：1605-1614(2013)；以及Dolgin，“Encapsulate This，”Nat.Med.20：9-11(2014))。然而，主要挑战是在常常以较高数目(约100,000)在腹膜腔内移植囊体之后，在医学并发症或移植失败的情况下，几乎不可能可靠地和完全地取回或替换它们(Calahore，“Alginate Microcapsules for Pancreatic Islet Cell Graft Immunoprotection：Struggle and Progress Towards the Final Cure for Type 1 Diabetes Mellitus，”Expert 
Opin.Biol.Ther.3：201-205(2003)；Vaithilingam等，“Islet Transplantation and Encapsulation：An Update on Recent Developments，”Rev.Diabet.Stud.8：51-67(2011)；Smink等，“Toward Engineering a Novel Transplantation Site for Human Pancreatic Islets，”Diabetes 62：1357-1364(2013)；以及Jacobs-Tulleneers-
Thevissen等，“Sustained Function of Alginate-Encapsulated Human Islet Cell Implants in the Peritoneal Cavity of Mice Leading to a Pilot Study in a Type 
1 Diabetic Patient，”Diabetologia 56：1605-1614(2013))。这使患者对在它们的身体内永久植入生物材料和外来细胞的担忧增加。当使用干细胞时，也存在潜在畸胎瘤形成风险。
另外，不能取回整个植入物使得对于医师和研究者而言不可能在失败之后检查整体移植物。

[0009] 水凝胶微纤维，诸如由海藻酸盐制得的那些，近来已作为一种用以囊封细胞以达成各种应用的潜在生物可相容的高表面积平台而受到许多关注(Onoe等，“Metre-Long Cell-Laden Microfibres Exhibit  Tissue Morphologies and Functions，”Nat.Mater.12：584-590(2013)；Raof等，“One-Dimensional Self-Assembly of Mouse Embryonic Stem Cells Using an Array of Hydrogel Microstrands，”Biomaterials 
32：4498-4505(2011)；Lee等，“Synthesis of Cell-Laden Alginate Hollow Fibers Using Micro fluidic Chips and  Microvascularized Tissue-Engineering 
Applications，”Small 5：1264-1268(2009)；Zhang等，“Creating Polymer Hydrogel Micro fibres with Intemal Alignment Via  Electrical and Mechanical 
Stretching，”Biomaterials 35(10)：3243-3251(2014)；Yu等，“Flexible Fabrication of Biomimetic Bamboo-Like Hybrid Microfibers，”Adv.Mater.26(16)：2494-2499(2014))。
这些微纤维通常通过微流体方法产生。它们在长度方面可从数毫米至数米缩放，并且可使用纤细毛细管和流体流加以进一步编织(Onoe等，“Metre-Long Cell-Laden Micro fibres Exhibit Tissue Morphologies and Functions，”Nat.Mater.12：584-590(2013))。然而，水凝胶材料(尤其是适于细胞囊封应用的那些)的固有机械脆弱性以及高纵横比使得水凝胶微纤维易于断裂并难以处理。两个问题均是最终临床应用的重大关切事项。

[0010] 宿主识别和随后外来体应答可导致移植的生物医学装置失效。尽管海藻酸盐水凝胶已被视为一种相对生物可相容材料，并且已用于许多临床试验中，但它仍然可导致引起纤维化细胞过度生长和胶原蛋白沉积的外来体反应。已知的是移植材料的几何结构可显著影响纤维化。

[0011] 本发明克服在产生用于治疗例如1型糖尿病或2型糖尿病的糖尿病的水凝胶植入物方面的过往缺陷。

[0012] 发明概述

[0013] 本发明的第一方面涉及一种可植入治疗递送系统。这个治疗递送系统包括基底、包围所述基底的内部聚合涂层和包围所述内部聚合涂层的外部水凝胶涂层。一种或多种治疗剂位于外部水凝胶涂层中。

[0014] 本发明的另一方面涉及一种将治疗剂递送至受试者的方法。这个方法涉及提供需要治疗剂的受试者，以及将本文所述的可植入治疗递送系统植入所述受试者中。

[0015] 本发明的另一方面涉及一种治疗受试者的方法。这个方法涉及将本文所述的可植入治疗递送系统植入患有糖尿病的受试者中。

[0016] 本发明的另一方面涉及一种治疗受试者的方法。这个方法涉及鉴定需要治疗的受试者，以及将本文所述的可植入治疗递送系统植入所述受试者中以治疗所述受试者。

[0017] 本发明的另一方面涉及一种制备本文所述的可植入治疗递送系统的方法。这个方法涉及提供基底，用聚合物溶液涂布所述基底，以及在所述涂布基底上提供包含一种或多种治疗剂的外部水凝胶层。

[0018] 本发明的另一方面涉及一种可植入治疗递送系统。这个治疗递送系统包括纺制基底和含于所述纺制基底内的水凝胶基质。一种或多种治疗剂位于水凝胶基质中。

[0019] 本文所述的可植入治疗递送系统提供超过当前可用的可植入囊封递送装置的若干优势。相较于包括管状装置与平面装置两者的宏观装置，本文所述的系统具有显著增加的供治疗剂向靶向器官或组织传质的表面积。另外，扩散距离显著较短，此有益于治疗剂递送。在涉及细胞囊封以达成基于细胞来分泌治疗剂的实施方案中，这个缩短距离有益于细胞健康。本发明的纤细柔性却又机械坚固的系统较易于处理和操纵，并且使得能够达成系统的便利非侵袭性植入、取回和替换。此外，不同于许多其它系统，可植入治疗递送系统的长度可为数毫米至数米。

[0020] 根据一个实施方案，本文描述一种用于治疗1型糖尿病的胰岛囊封用丝线强化海藻酸盐纤维(thread-reinforced alginate fiber for islet encapsulation，“TRAFFIC”)系统。在这个系统的一个实施方案中，水凝胶纤维提供免疫保护和高传质表面积，同时纤细柔性绳带样结构赋予机械强度，并且使得能够容易处理、植入和取回。进行实施例(下文)中阐述的一系列研究以探究TRAFFIC系统诱导/防止纤维化的尺寸效应。将两组具有不同直径的TRAFFIC系统植入物植入C57BL/6小鼠(已知其比其它小鼠品系经历更重度纤维化)的腹膜内间隙中。结果显示当使用较大直径TRAFFIC系统植入物(约1.5mm)时，持续至少3个月不出现纤维化。

[0021] 除相对生物可相容之外，本发明系统相较于当前使用的胰岛囊封系统或其它细胞类型的囊封具有若干其它优势。本发明系统具有大的传质表面积，并且易于处理、植入和取回。不同于其它可取回宏观装置，本发明系统不具有密封或泄漏问题。此外，扩散或传质距离(即胰岛相对于表面的位置)可通过调整“绳带”和水凝胶纤维的直径来控制。短扩散距离不仅有益于胰岛存活，而且也有利于快速葡萄糖应答。在本发明系统中，长度也可定制。

[0022] 作为本发明系统的临床潜力的实证，将大鼠胰岛囊封并获得持续至少1个月的对小鼠的化学诱发糖尿病的治愈，在1个月时，所有小鼠(n＝5)都仍然是治愈的。当移除时，小鼠返回它们的糖尿病状态。取回的系统具有中等细胞过度生长，但观察到功能性胰岛。最后，为证明本发明系统是T1D患者的临床可行选项，按比例扩大对系统的制造。通过使用狗模型，显示这种装置可通过最小侵袭性腹腔镜检查程序加以便利地植入，广泛分散在腹膜腔中，并且易于取回。

[0023] 附图简述

[0024] 图1A-C是本文所述的可植入治疗递送系统的一个实施方案的图示。图1A是整体可植入系统的侧视图。图1B是沿可植入系统的一段的长度的横截面侧视图，并且图1C是沿图1A的线Z-Z获取的横截面视图。

[0025] 图2A-N涉及基于“条束上有珠粒”设计的本文所述的可植入治疗递送系统的一个实施方案。图2A是系统的图解说明。图2B是显示图2A的可植入治疗递送系统的制造步骤的图解说明。图2C-E是显示对条束上有珠粒可植入治疗递送系统的形态表征的数字图像：图2C是光学显微镜图像，并且图2D-E是在不同放大倍数下的SEM图像。图2F是未装载细胞的可植入治疗递送系统的光学显微镜图像，其中插图是可植入治疗递送系统的共焦显微镜图像。图2G-J说明水凝胶层直径控制数据：图2G-H是具有0.3mm和1.5mm总直径的可植入治疗递送系统的代表性光学显微镜图像。图2I-J是水凝胶直径校正图。图2K-N是装载有细胞聚集物的可植入治疗递送系统的光学/荧光显微镜图像：图2K-L是装载有大鼠胰岛的可植入治疗递送系统的光学/荧光显微镜图像。图2L是显示在囊封之后1天对大鼠胰岛的活体/死体染色的照片。图2M-N是囊封人胚胎干细胞源性胰腺祖细胞(“hESC PP”)的可植入治疗递送系统的光学显微镜图像。

[0026] 图3A-P说明本文所述的可植入治疗递送系统的一个实施方案的尺寸依赖性纤维化效应。图3A、B、I和J是1.5mm直径可植入治疗递送系统的显微镜图像，并且图3E、F、M和N是0.3mm直径可植入治疗递送系统的显微镜图像，在植入之前(图3A、E、I和M)，在植入之后14天(图3B和F)和90天(图3J和N)。图3C、G、K和O是显示对相应取回可植入治疗递送系统的组织学载片的H&E染色的数字图像(图3C和3K显示1.5mm直径系统，并且图3G和3O显示0.3mm直径系统)。图3D、H、L和P是显示对相应取回可植入治疗递送系统的免疫组织化学染色的数字图像(图3D和3L分别显示在植入之后第14和90天取回的1.5mm直径系统，并且图3H和3P分别显示在植入之后第14和90天取回的0.3mm直径系统)。

[0027] 图4A-I是显示本文所述的可植入治疗递送系统的一个实施方案在狗模型中进行腹腔镜检查植入和取回的数字图像。图4A和D是位于肝颅侧的可植入治疗递送系统在植入期间(图4A)以及在植入之后15天(图4D)的腹腔镜检查图像。图4B和E是可植入治疗递送系统在植入之前(图4B)以及在植入之后15天(图4E)的显微镜图像。图4C和F是显示在植入之前(图4C)以及在植入之后15天(图4F)对可植入治疗递送系统的组织学载片的H&E染色的数字图像。图4G是可植入治疗递送系统在植入之后15天的腹腔镜检查图像，其中箭号显示水凝胶层的断裂。图4H和I是取回的可植入治疗递送系统的数字图像，其显示水凝胶层的断裂。

[0028] 图5A-R涉及基于“扭曲条束”结构的可植入治疗递送系统的一个实施方案。图5A是结构构型的图解说明。图5B是图5A中所示的可植入治疗递送系统的制造步骤的图解说明。图5C-E是裸露扭曲缝合线(图5C)、具有聚合物涂层的扭曲缝合线(图5D)和完整可植入治疗递送系统(图5E)的数字图像。图5F是裸露扭曲缝合线的SEM图像。图5G和5H是具有聚合物涂层的扭曲缝合线的SEM图像。图5I-K是扭曲缝合线(图5I)、具有聚合物涂层的扭曲缝合线(图5J)和完整可植入治疗递送系统(图5K)的荧光图像。图5L-N是扭曲缝合线的EDS元素测绘的数字图像。图5O是扭曲缝合线表面的EDX光谱。图5P-Q是装载有人胚胎干细胞源性胰腺祖细胞聚集物(PP)的可植入治疗递送系统的显微镜图像。图5R是囊封PP的活体/死体染色的荧光显微镜图像。

[0029] 图6A-H涉及针对1型糖尿病的胰岛囊封和体内实验。图6A是在小鼠中植入装载在可植入治疗递送系统中的大鼠胰岛的图解说明。图6B是分离的大鼠胰岛的显微镜图像。图6C是含有大鼠胰岛的TRAFFIC系统(即本文所述的可植入治疗递送系统的一个实施方案)在移植之前的数字图像。图6D是在1个月之后从糖尿病小鼠取回的含有大鼠胰岛的TRAFFIC系统的数字图像。图6E-F是对取回的含有大鼠胰岛的TRAFFIC系统组织学载片的H&E染色的数字图像。图6G是显示3只STZ诱发糖尿病小鼠和5只STZ诱发糖尿病小鼠在移植含有大鼠胰岛的TRAFFIC系统之后的血糖浓度的图；在植入4周之后取回装置。图6H是在STZ诱发糖尿病小鼠、正常小鼠和移植有含有大鼠胰岛的TRAFFIC系统的STZ诱发糖尿病小鼠中进行腹膜内葡萄糖耐受性测试(IPGTT)的图。

[0030] 图7A-J涉及可植入治疗递送系统在狗模型中的腹腔镜检查植入和取回。图7A是将可植入治疗递送系统植入狗模型中的图解说明。图7B是腹腔镜检查程序的数字图像。图7C是在植入之后4周，切口创伤的数字图像。图7D是取回的可植入治疗递送系统的数字图像。图7E-G是与肝接触的可植入治疗递送系统在移植期间(图7E)以及在移植之后4周(图7G)的腹腔镜检查图像。图7F和H是可植入治疗递送系统在移植之前(图7F)以及在取回之后(图
7H)的显微镜图像。图7I是对取回的可植入治疗递送系统的组织学载片的H&E染色的数字图像。图7J是一系列数字图像，其显示可植入治疗递送系统的腹腔镜检查取回过程。

[0031] 图8A是显示可植入治疗递送系统的条束上有珠粒实施方案的EDS元素测绘的数字图像。图8B是来自图8A的可植入治疗递送系统的珠粒表面的EDX光谱。

[0032] 图9A-D是PMMA：CaCl2/DMF溶液湿润的单一条束尼龙缝合线(图9A-B)和扭曲缝合线(图9C-D)的角度计图像。

[0033] 图10A-C涉及可植入治疗递送系统的一个实施方案的机械稳定性测试。图10A是动态机械分析(DMA)测试的图解说明。图10B是通过DMA收集的应力-应变曲线。如这个图中所描绘，单独编织条束和用海藻酸盐涂布的编织条束的拉伸强度(曲线重叠于图10B的图中)比单独海藻酸盐的拉伸强度大得多。图10C是在比较海藻酸盐纤维(左侧图像)和可植入治疗递送系统(右侧图像)的情况下显示处理容易性的数字图像。

[0034] 图11A-B是可植入治疗递送系统的两个不同实施方案的强化条束的SEM图像。图11A是条束上有珠粒结构，其中箭号指向缝合线的裸露光滑区域。图11B是扭曲条束结构。

[0035] 图12A-D是强化条束结构的两个不同实施方案的3-D模型。图12A-B是条束上有珠粒设计。图12A显示3-D模型，并且图12B是沿条束轴的截面图像。图12C-D是扭曲条束设计。图12C显示3-D模型，并且图12D是沿条束轴的截面图像。

[0036] 图13是条束上液滴的图解(桶形)。

[0037] 图14是显示在两个条束之间的楔形部分内部的液体薄膜的透视图。

[0038] 图15是在两个圆形纤维(例如具有图14中所示的结构)之间的楔形部分内的液体的横截面视图。

[0039] 图16A-F显示纳米纤维强化水凝胶微装置(NHM)(即本文所述的可植入治疗递送系统的一个实施方案)的制造过程。图16A是在旋转模板上进行电纺过程的图解说明。图16B是海藻酸盐水凝胶通过Ca2+释放性纳米纤维进行的自动交联过程的图解说明。图16C-E是显示NHM的组分的荧光显微镜图像，所述组分包括尼龙纳米纤维(图16C；以红色标记)和海藻酸盐水凝胶(图16D，以绿色标记)。图16E是显示尼龙纳米纤维和海藻酸盐水凝胶的合并图像。图16F是多隔间NHM装置的图解说明。

[0040] 图17A-D提供对NHM装置的表征。图17A是具有不同尺寸或容量(顶部)和多微隔间(底部)的电纺尼龙纳米纤维装置的数字图像。图17B是纳米纤维微包装的SEM图像，其中插图显示开口端。图17C是冷冻干燥的NHM装置壁的SEM图像。插图显示NHM装置的数字图像(顶部)和NHM装置的横截面的共焦图像(底部，红色：纳米纤维，绿色：海藻酸盐)。图17D是显示电纺尼龙纳米纤维片、海藻酸盐水凝胶片和纳米纤维强化海藻酸盐水凝胶片的应变-应力曲线的图。图17D的插图是测试样品的数字图片。

[0041] 图18A-I描绘使用NHM装置进行的体外细胞囊封和培养。图18A和18B是第0天(图18A)和在囊封之后5天(图18B)，用钙-AM(绿色，活体)和乙非啶(ethidium)均二聚体(红色，死体)染色的囊封MDA-MB-231细胞的图像。图18C是通过MTT分析获得的囊封MDA-MB-231细胞生长曲线(平均值±标准偏差，n＝3)。图18D是用钙-AM(绿色，活体)和乙非啶均二聚体(红色，死体)染色的囊封胰岛的荧光图像。图18E是对囊封胰岛的免疫组织化学染色的图像(绿色：胰岛素，蓝色：核)。图18F是显示囊封在NHM中的胰岛的葡萄糖刺激胰岛素分泌的图(平均值±标准偏差，n＝3)。图18G-18I是囊封在隔间化NHM装置中的MDA-MB-231-EGFP(绿色)和MDA-MB-231-dTomato(红色)细胞的图像。图18G是荧光显微镜图像。图18G的插图提供对装置的横截面的说明。图18H是囊封细胞在较高放大倍数下的共焦图像，并且图18I是显示囊封细胞的定位的三维荧光图像。

[0042] 图19A-E显示使用NHM装置进行的体内细胞递送。图19A是显示STZ诱发糖尿病小鼠在移植囊封大鼠胰岛之后的血糖数据的图；在植入8周之后取回NHM装置(平均值±标准偏差，n＝3)。图19B是取回的装置的代表性数字图像。图19C是对取回的装置的组织学分析。用H&E染色切片，并且在光学显微镜下观察。图19D是图19C中所示的取回的装置的器壁的放大图像，其中用箭号指示纳米纤维、海藻酸盐水凝胶和细胞过度生长。图19E中描绘对取回的装置中的囊封胰岛的免疫组织化学染色的代表性图像(绿色：胰岛素，蓝色：核)。

[0043] 图20A-J是包括以下各物的各种电纺纳米纤维和纳米纤维(管状)微包装的一组显微镜图像和数字图像：尼龙6纤维(图20A-B)、聚丙烯腈(图20C-D)、聚己内酯(图20E-F)、聚砜(图20G-H)和聚苯乙烯(图20I-J)

[0044] 图21A-D是尼龙6纳米纤维强化海藻酸盐水凝胶(图21A-B)和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)水凝胶(图21C-D)微装置的显微镜图像和数字图像。水凝胶的位置由箭号指示。

[0045] 图22A-C显示在囊封后过夜培养之后对细胞的活体/死体染色，所述细胞包括MDA-MB-231乳腺癌细胞(图22A)、人胚胎干细胞(hESC)源性胰腺祖细胞(PP)(图22B)和人肝细胞-基质细胞聚集物(图22C)。

[0046] 图23A-D是与本文所述的TRAFFIC系统相关的图像，当在肝颅侧放置在狗中时，TRAFFIC系统在肝上产生压痕。深达压痕的肝实质是完全正常的，从而表明TRAFFIC系统具有生物惰性。

[0047] 发明详述

[0048] 本发明的第一方面涉及一种可植入治疗递送系统。这个治疗递送系统包括基底、包围所述基底的内部聚合涂层和包围所述内部聚合涂层的外部水凝胶涂层。一种或多种治疗剂位于外部水凝胶涂层中。

[0049] 图1A-1C是本发明的可植入治疗递送系统的一个实施方案的图示。如图lA中所示，可植入治疗递送系统10具有纤细柔性条束或绳带样设计。这个设计是有利的，因为它提供增加的用于转移和递送囊封在如本文所述的装置内的治疗剂的表面积，并且易于处理、植入和取回。可植入系统10可为在数毫米至数米的范围内的任何所需长度，并且将视靶向递送区域以及待递送的治疗剂的量和植入物接受者的身材而变化。举例来说，在一个实施方案中，可植入系统10的长度是约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫米。在另一实施方案中，可植入系统10的长度是约20、30、40、50、60、70、80、90或100cm。在另一实施方案中，可植入系统的长度大于100cm。

[0050] 可植入系统的直径通常在数微米至数厘米的范围内。在一个实施方案中，可植入系统的直径是＜50微米。在另一实施方案中，可植入系统的直径是50、100、200、300、400、500、600、700、800、900μm。在另一实施方案中，可植入系统是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、
5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mm。在另一实施方案中，可植入系统的直径是＞10mm。
当可植入系统在外部水凝胶层中含有细胞时，本文所述的可植入系统的最优直径可根据细胞的需氧量来控制，即直径必须足够小以允许足够氧扩散至分散在水凝胶层中的细胞以避免缺氧。然而，当可植入系统包括一个或多个如下文所述的充当储氧囊的内部流体间隙时，系统的直径可较大。

[0051] 图1B是沿图1A的可植入系统的一部分的长度的横截面视图，并且图1C是沿图1A的线Z-Z获取的横截面视图。如这些图中所描绘，可植入系统的核心包含基底12。在一个实施方案中，基底是单一伸长条束(参见例如图2A)。在另一实施方案中，基底包含两个或更多个扭曲或编织在一起以形成扭曲伸长条束的伸长条束(参见例如图5A)。根据这个实施方案，基底可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个扭曲在一起的伸长条束。伸长条束由柔性固体或半固体材料组成。在一个实施方案中，基底含有一个或多个内部流体间隙。一个或多个内部流体间隙可具有任何构型。举例来说，在一个实施方案中，基底包含构造成单一中空管的单一内部流体间隙。在另一实施方案中，基底包含构造成中空管、隔间化中空管或两个或更多个中空管的内部流体间隙。在另一实施方案中，内部流体间隙是分布在整个半固体基底基质中的连续间隙。基底可包含气体不渗透性、半渗透性或渗透性材料。基底也可包含液体不渗透性、半渗透性或渗透性材料。在一个实施方案中，基底包含一个或多个由柔性半固体气体渗透性、液体不渗透性材料组成，具有一个或多个内部流体间隙的伸长条束。内部流体间隙充当一种或多种生物试剂(诸如像氧)的储集囊，如下文更详细所述。基底穿过可植入系统的长度，并且包括约1μm至约25mm之间的直径。

[0052] 适合基底材料包括不溶于包围基底的聚合涂层(下文描述)中的材料。适合基底材料包括例如且不限于由尼龙、丝(例如蜘蛛丝和蚕丝)、聚(醚砜)、聚丙烯、聚酯、聚丁酯(polybutester)组成的合成或天然纤维。基底也可包含天然聚合物(例如明胶、壳聚糖、透明质酸、丝纤蛋白和胶原蛋白)或合成聚合物(例如聚(乳酸)(PLA)、聚氯基甲酸酯(PU)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)(PEVA)和聚(1-丙交酯-共-ε-己内酯)(PLLA-CL))的纳米纤维。为增强基底材料的拉伸强度，它可用石墨烯或碳纳米管强化(参见例如属于Ko的美国专利公布号20070082197，其据此以引用的方式整体并入本文)。

[0053] 如图1B和1C中所说明，内部聚合涂层14包围基底12。在一个实施方案中，聚合涂层是多孔的和具有渗透性，例如气体渗透性和/或液体渗透性。在另一实施方案中，聚合涂层具有气体和/或液体不渗透性。聚合涂层包含可与基底材料相容的材料，即聚合涂层由不溶解基底材料，并且不同于基底材料的材料组成。适合聚合涂料包括相对亲水性和水不溶性聚合物，诸如像且不限于聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯腈、聚(乳酸)(PLA)、聚氯基甲酸酯(PU)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)(PEVA)、聚(l-丙交酯-共-ε-己内酯)(PLLA-CL)以及这些或其它聚合物的任何组合。

[0054] 在一个实施方案中，聚合涂层含有并释放适于使聚合涂层交联于可植入治疗递送系统的外部水凝胶层(下文描述)的阳离子交联剂。在一个实施方案中，阳离子交联剂是二价阳离子，诸如Ba2+、Ca2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、pb2+、Sn2+、Sr2+和Zn2+。在一个实施方案中，二价交联剂是氯化钙。其它适合阳离子交联剂包括不限于Al3+和Fe3+。交联剂在足以交联和粘着外部水凝胶层的浓度(例如聚合涂布溶液的＞0.5％)下存在于聚合涂层中。因此，在一些实施方案中，交联剂以过量浓度(例如＞2％)存在。交联剂的适合浓度在1-
20％之间。

[0055] 用于制备聚合涂布材料的溶剂是溶解和/或分散聚合物涂层的交联剂，但不导致基底溶解的任何有机溶剂。适合有机溶剂是具有低表面张力的那些，包括例如且不限于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、乙醇、甲醇或其任何组合。聚合物与溶剂的比率视例如利用哪种聚合物-溶剂组合以及聚合物重量而变化。然而，通常，聚合物占涂布溶液的1-40％，即聚合物占涂布溶液的约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％。在另一实施方案中，聚合物占聚合物涂布溶液的＞40％。

[0056] 在一个实施方案中，由于由瑞利不稳定性(Rayleigh instability)驱动的表面张力，在干燥过程期间，聚合涂层沿基底的长度形成单独锚定粒子或珠粒(参见例如图2A)。在一个实施方案中，珠粒或粒子具有横向直径是约100-300μm的椭圆略微伸长形状。珠粒具有高度多孔性，并且提供增加的用于交联剂释放的表面积，此转而可改进涂布基底与外部水凝胶层之间的粘着。

[0057] 如图1B和1C中所说明，外部水凝胶涂层16包围内部聚合涂层14。这个水凝胶层16含有一种或多种治疗剂18作为可植入治疗递送系统10的一部分。

[0058] 水凝胶涂层由与内部聚合涂层交联的材料组成。适合水凝胶材料包括天然和合成聚合材料。水凝胶涂层在组成方面可为均聚的，共聚的或多聚的。适合水凝胶材料包括不限于源于胶原蛋白、透明质酸盐、纤维蛋白、海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、细菌纤维素、弹性蛋白、角蛋白、MATRIGELTM、DNA(作为真性聚合物)及其组合的那些。在其它实施方案中，适合水凝胶是合成聚合物，包括源于聚乙二醇(PEG)、聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(氧化乙烯)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的那些。

[0059] 适于本文所述的可植入系统的外部涂层的其它生物可相容材料包括各向异性材料聚砜(PSF)、纳米纤维垫、聚酰亚胺、四氟乙烯/聚四氟乙烯(PTFE；也称为TeflonTM)、ePTFE(膨胀聚四氟乙烯)、聚丙烯腈、聚醚砜、丙烯酸树脂、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)膜。

[0060] 如图1B和1C中所描绘，可植入治疗递送系统10的治疗剂18位于外部水凝胶涂层16内，并且沿可植入系统10的整个长度分布在整个外部水凝胶涂层16中。治疗剂可为任何生物反应剂，包括例如且不限于治疗性蛋白质、肽、抗体或其片段、抗体模拟物以及其它结合分子、核酸、小分子、激素、生长因子、血管生成因子、细胞因子和消炎剂。

[0061] 可使用本文所述的可植入递送系统递送的药物(或治疗剂)的类型是众多的，并且包括大小在100道尔顿(dalton)至约1,000道尔顿的范围内的小分子量化合物以及大小在约1,000道尔顿至约100,000道尔顿的范围内以及超出所述范围的较大大分子药物(诸如肽和蛋白质药物)两者。系统特别充分适于递送具有例如在微克/天、纳克/天、乃至皮克/天的范围内的相对较低有效剂量的药物。

[0062] 可含于可植入系统内以在受试者中植入后递送的蛋白质和/或肽治疗剂包括不限于肽激素，诸如胰岛素、升糖素、甲状旁腺激素、降血钙素、血管加压素、肾素、催乳素、生长激素、促性腺激素，包括绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激激素、促甲状腺激素、甲状腺刺激激素和促黄体生成激素；生理活性酶，诸如转移酶、水解酶、溶解酶、异构酶、磷酸酶、糖苷酶、超氧化物歧化酶、因子VIII、纤维蛋白溶酶原活化因子；和其它治疗剂，包括蛋白质因子，诸如表皮生长因子、胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子、转化生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板源性生长因子、红血球生成素、集落刺激因子、骨形态发生蛋白质、白介素和干扰素。也可使用本发明系统来递送非蛋白质大分子，特别包括多糖、核酸聚合物和治疗性次级代谢物，包括植物产物，诸如长春花碱、长春新碱、泰素(taxol)等。也可递送小分子量化合物。

[0063] 在一个实施方案中，治疗剂是从囊封在或存在于可植入系统的外部水凝胶层内的组织和/或细胞制剂产生和/或分泌或释放的生物试剂。细胞可包括可呈单一细胞和/或细胞簇形式的天然存在的细胞或遗传工程改造的细胞。在一个实施方案中，可植入系统的水凝胶外层内的细胞分泌一种或多种适用于治疗疾病或病状的生物因子。这些因子从细胞分泌，从水凝胶层释放，并且被递送至或扩散至有需要的周围靶标细胞、组织或器官。适合细胞包括不限于一种或多种选自由以下组成的组的细胞类型：平滑肌细胞、心脏肌细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、尿道上皮细胞、纤维母细胞、胚胎纤维母细胞、肌母细胞、软骨细胞、软骨母细胞、骨母细胞、破骨细胞、角质化细胞、肝细胞、胆管细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、下丘脑细胞、垂体细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、唾液腺细胞、脂肪细胞、胚胎干细胞、间质干细胞、神经细胞、内皮祖细胞、造血细胞和前体细胞。

[0064] 在一个实施方案中，细胞是胰岛素分泌细胞，诸如胰岛细胞。

[0065] 如上所指示，适合细胞包括祖细胞和/或干细胞。适合干细胞可为多能、专能、寡能或单能细胞或细胞群体，并且包括胚胎干细胞、上胚层细胞、原始外胚层细胞和原始生殖细胞。在另一实施方案中，适合干细胞也包括诱导多能干(iPS)细胞，其是源于非多能细胞的多能干细胞。参见Zhou等，Cell Stem Cell 4：381-384(2009)；Yu等，Science 324(5928)：797-801(2009)；Yu等，Science 318(5858)：1917-20(2007)；Takahashi等，Cell 131：861-
72(2007)；以及Takahashi和Yamanaka，Cell 126：663-76(2006)，其据此以引用的方式整体并入本文。根据这个实施方案，水凝胶层可进一步包含适于促进干细胞分化成能够产生和释放目标治疗剂的所需细胞群体的生长和分化因子。

[0066] 适于囊封在本文所述的可植入系统中的细胞可源于能够产生所需细胞的任何动物。从其收集细胞的动物可为脊椎动物或无脊椎动物、哺乳动物或非哺乳动物、人或非人。动物来源的实例包括但不限于灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物或猪科动物。细胞可从初级细胞制剂或永生化细胞制剂获得，或包括初级细胞制剂或永生化细胞制剂。囊封细胞可从与植入物接受者相同的物种，或从不同于植入物接受者的物种分离。

[0067] 在一些实施方案中，本文所述的系统包括在约1×105或1×106个细胞/毫升至约1×1010个细胞/毫升之间或更大的细胞密度。在一个实施方案中，系统的细胞容纳能力至少部分地基于系统的长度。细胞能够在可植入系统中以某一功能性在体内存活至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或1年或更久，所述功能性代表在将细胞引入系统中时或在细胞在系统中完全发育和/或成熟(例如植入需要在体内进一步发育或成熟成功能性细胞的祖细胞)时表现的功能的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在一些实施方案中，在体内植入系统后，系统中的细胞或细胞制剂在系统内扩增以增加细胞密度和/或细胞功能。

[0068] 当系统的外部水凝胶涂层含有细胞或细胞制剂时，可添加额外细胞特异性生长和/或分化因子至水凝胶溶液中以增强细胞生长、分化和存活。这些因子包括补充剂(例如谷氨酰胺、非必需氨基酸)、生长因子(例如表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、转化生长因子/骨形态发生蛋白质、血小板源性生长因子、胰岛素生长因子、细胞因子)、细胞外基质蛋白质(例如纤维结合蛋白、层粘连蛋白、肝素、胶原蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、弹性蛋白、几丁质衍生物、纤维蛋白和纤维蛋白原)、血管生成因子(例如FGF、bFGF、酸性FGF(aFGF)、FGF-2、FGF-4、EGF、PDGF、TGF-β、促血管生成素-1、促血管生成素-2、胎盘生长因子(PlGF)、VEGF和PMA(佛波醇(phorbol)12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯))和信号传导因子和/或转录因子。

[0069] 对于细胞和组织囊封/免疫分离领域的一个阻碍已为缺乏足够氧和营养物跨越用于囊封细胞和组织的聚合物膜进行转运。这个气体和营养物交换不足的结果是代谢活性降低和细胞死亡。因此，在一个实施方案中，可植入系统包括被设计以包括可易于为囊封细胞或组织所用的氧来源和/或生物活性剂的构型。举例来说，如上文所述，可植入系统的基底可包含一个或多个充当储氧囊的内部流体间隙。可含于基底的内部间隙内的适合氧载体包括全氟代有机化合物，例如全氟化碳(“PFC”)、PFC乳液、或PFC与某一基质的混合物。PFC是良好氧载体，因为它们相比于水具有高数倍的氧溶解度。举例来说，在正常条件下，液体PFC溶解40体积％与55体积％之间的氧和100体积％与150体积％之间的CO2。PFC衍生物是不能被代谢的大密度、化学惰性和水不溶性化合物。

[0070] 适合PFC物质包括但不限于全氟三丁胺(FC-43)、全氟萘烷、全氟溴辛烷、双-全氟丁基-乙烯、全氟-4-甲基吗啉、全氟三乙胺、全氟-2-乙基四氢呋喃、全氟-2-丁基四氢呋喃、全氟戊烷、全氟-2-甲基戊烷、全氟己烷、全氟-4-异丙基吗啉、全氟二丁基醚、全氟庚烷、全氟辛烷及其混合物。优选惰性含氟化学物质液体包括全氟己烷、全氟-2-丁基四氢呋喃、全氟庚烷、全氟辛烷及其混合物。适用于本文所述的实施方案中的可商购获得的PFC包括1990年产品公告(#98-0211-5347-7(101.5)NPI，FFU ORINERTTM fluids)中所述的FFUORINERTTM流体(可从Minnesota Mining and Manufacturing Company，St.Paul，Minn.获得)，例如FC-72、FC-75、FC-77和FC-84及其混合物。

[0071] 可植入系统的外部水凝胶层可进一步包含一种或多种帮助降低和/或消除宿主对植入装置的炎症性或纤维化应答的消炎试剂。适合消炎剂包括不限于非类固醇消炎药物(NSAID)(例如双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenopro比n)、氟比洛芬(flurbipro比n)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲灭酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘普酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、双水杨酯(salsalate)、舒林酸(sulindac)和托美丁(tolmetin))、止痛剂(例如乙酰胺酚(acetaminophen)、羟考酮(oxycodone)、曲马多(tramadol)和普洛帕吩盐酸盐(propoxyphene hydrochloride))、糖皮质素(例如可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)和泼尼松(prednisone))和二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤(methotrexate))。

[0072] 在另一实施方案中，本文所述的可植入系统包含一种或多种造影剂以有助于体内监测植入物放置、植入物在植入之后某一时间点的位置、植入物的健康、对非靶标细胞类型的有害影响、炎症和/或纤维化。适合造影剂包括不限于纳米粒子、纳米晶体、钆、氧化铁、铁铂、锰、碘、钡、微泡、荧光染料和为本领域技术人员所知的其它造影剂。

[0073] 体内监测的方法包括但不限于共焦显微术、双光子显微术、高频超声、光学相干断层摄影术(OCT)、光声断层摄影术(PAT)、计算机断层摄影术(CT)、磁共振成像(MRI)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)和正电子发射断层摄影术(PET)。这些方法单独或组合可提供适用于监测可植入系统的手段。

[0074] 在另一实施方案中，治疗剂通过囊封在或存在于可植入系统的外部水凝胶层内的生物芯片或纳米生物芯片来由本文所述的系统产生和/或从本文所述的系统释放。举例来说，生物芯片或纳米生物芯片装置可实施半导体和/或微电子机械系统技术以用于提供针对各种人疾病的治疗方案(参见例如属于Kline的美国专利申请公布号2013/0345525，其据此以引用的方式整体并入本文)。

[0075] 本发明的另一方面涉及可植入治疗递送系统的一种替代性构型。这个治疗递送系统包括纳米纤维核心基底，其具有一个或多个适于隔间囊封一种或多种类型的细胞、细胞制剂或治疗剂的内部间隙。外部生物可相容聚合涂层包围这个系统的纳米纤维基底。

[0076] 适合基底材料包括不限于如上文所述的天然和合成材料。然而，根据这个实施方案，本发明的这个方面的基底含有并释放适于促进基底材料与外部生物可相容聚合涂层之间交联的交联剂。上文描述适合交联剂。在一些实施方案中，基底材料进一步含有一种或多种生物反应性试剂，诸如像缓慢释放以缓和任何宿主免疫系统炎症性应答和纤维化的消炎试剂。或者，基底材料可含有并释放一种或多种治疗活性试剂。

[0077] 根据本发明的这个方面的囊封细胞可呈单一细胞或细胞聚集物形式，并且可源于上文所述的任何适合来源。同样，细胞或细胞制剂可包括初级细胞、永生化细胞、遗传工程改造细胞等。上文描述适合细胞类型，包括干细胞和祖细胞类型。

[0078] 以定制设计方式将囊封细胞装载至这个系统中，即在细胞外基质和间隙受控制的情况下，即必要时可将细胞特异性环境因素和条件并入这个系统中以增强细胞存活、生长、增殖、分化和功能。这个设计特征极大增强植入细胞的健康和总体寿命。

[0079] 这个方面的系统的外部生物可相容聚合涂层由水凝胶材料组成。在一个实施方案中，水凝胶由超级可相容的化学改性海藻酸盐制得。在另一实施方案中，水凝胶由光可交联聚乙二醇制得。在另一实施方案中，水凝胶由外来体应答抗性两性离子聚合物制得。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂位于外部水凝胶涂层中。

[0080] 本发明的其它方面涉及治疗方法，其涉及将治疗系统植入待治疗的受试者中。因此，本发明的另一方面涉及一种将治疗剂递送至受试者的方法。这个方法涉及将本文所述的可植入治疗递送系统植入受试者中。本发明的另一方面涉及一种治疗受试者的方法。这个方法涉及将本文所述的可植入治疗递送系统植入患有病状或疾病的受试者中。适于使用可植入治疗递送系统治疗的病状或疾病尤其包括需要长期重复施用治疗剂的慢性病状或疾病状态。在一个实施方案中，病状是需要持续胰岛素疗法的糖尿病。

[0081] 本文所述的可植入系统可用于治疗需要向生物体连续供给生物活性物质的多种疾病和病状。系统可含有生物活性剂和/或细胞或产生一种或多种目标生物活性物质的细胞的均质或异质混合物。生物活性剂和/或细胞被完全囊封在外部半渗透性水凝胶层内。这种半渗透性外层允许囊封的目标生物活性物质(例如在治疗糖尿病的情况下，胰岛素、升糖素、胰多肽等)穿过系统，从而使得活性物质可为在系统外部以及在接受受试者的身体内的靶标细胞所用。在一个实施方案中，半渗透性膜允许天然存在于受试者中的营养物穿过膜以对水凝胶中存在的细胞提供必需营养物。同时，这种半渗透性膜阻止接受受试者的细胞(更特定来说，他们的免疫系统细胞)穿过以及进入可植入系统以伤害系统中的细胞。举例来说，在糖尿病的情况下，这个方法可允许葡萄糖和氧(例如含于身体内)刺激植入系统的产胰岛素细胞以释放如由身体实时所需的胰岛素，同时阻止宿主免疫系统细胞识别和破坏植入细胞。

[0082] 在一个实施方案中，半渗透性膜防止水凝胶中的细胞逃离可植入系统。

[0083] 可植入系统可通过手术植入受试者中。在一个实施方案中，使用诸如腹腔镜检查的最小侵袭性手术技术植入系统。视所递送的治疗剂、待治疗的病状、以及所靶向进行递送的组织或器官而定，系统可经皮、皮下、腹膜内、胸内、肌肉内、关节内、眼内或脑内植入。

[0084] 在一个实施方案中，将可植入系统锚定或固定(例如通过缝合线)在植入部位以维持系统和/或释放的治疗剂在植入部位处或附近。在一个实施方案中，锚定部位在作为治疗焦点的组织或器官处或紧密接近于所述组织或器官。在其中从系统递送治疗剂不依赖于位置，并且药剂的生物分布依赖于受试者的血管结构或体液的其它实施方案中，可将系统植入和锚定在远端位置中。在一个实施方案中，将可植入递送系统经皮或皮下植入在腹部、前臂、侧腹、背部、臀部、腿部等上的皮肤下，它大致上保持在所述部位处直至需要将它移除时。

[0085] 在一个实施方案中，可植入系统在植入之后是可取回的。如上文所述锚定或固定系统会阻止系统在患者内部迁移、移动或横移，并且有助于容易取回。根据这个实施方案，系统可进一步包括有助于取回的系绳。在治疗剂整体释放之后，或在其中可植入系统含有细胞的一实施方案中，当细胞停止释放足量治疗剂时，取回是合乎需要的。在取回之后，取回的系统可用另一系统替换以维持受试者中的治疗剂递送。可将第二或随后植入系统植入相同或不同位置中。

[0086] 本文所述的可植入治疗递送系统提供超过被开发用于递送胰岛素分泌细胞以治疗糖尿病的其它细胞囊封技术的若干优势。主要优势是细胞分散在可植入系统的外部水凝胶层中产生提供快速葡萄糖应答的短扩散距离。短扩散距离也增强营养物和氧递送至系统内的胰岛细胞中，由此极大改进长期胰岛细胞存活和功能性。

[0087] 含有胰岛素产生和分泌细胞(例如胰岛细胞)的可植入系统适于治疗患有I型(青少年糖尿病)或II型糖尿病的受试者。适合受试者包括患有胰岛素缺乏症的儿童、成人和年长受试者。

[0088] 根据一个实施方案，以腹腔镜检查方式将含有产胰岛素细胞的可植入系统植入腹腔或胸腔中。糖尿病患者利用可植入系统将实质上降低对监测血糖水平的需要，并且可完全消除对胰岛素注射的需要。可定期(例如每月一次或两月一次)监测植入系统以确保植入物的细胞充分起作用。

[0089] 根据本发明的涉及治疗糖尿病的方面，可植入系统包括产胰岛素细胞。适合胰岛素分泌细胞包括胰岛细胞。因为本文所述的可植入系统内的细胞被保护免遭宿主免疫系统，所以胰岛细胞可源于任何适合来源，即人或非人。适合动物来源的实例包括不限于灵长类动物、猪、牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物和啮齿动物。在一个实施方案中，胰岛细胞是分化成产胰岛素胰岛细胞的干细胞或祖细胞，包括诱导多能干细胞。适合胰岛素分泌细胞群体和用于产生所述群体的方法在本领域中是已知的，参见例如且不限于属于Martinson等的美国专利号8,425,928；属于Fiore的美国专利号5,773,255和5,712,159；属于Perfetti等的美国专利号6,642,003；Rezania等，“Reversal of Diabetes with 
Insulin-Producing Cells Derived In vitro from Human Pluripotent Stem Cells，”Nat.Biotech.32：1121-1133(2014)；Kuo等，“Stem Cell Therapy：Differentiation Potential of Insulin Producing Cells from Human Adipose Derived Stem Cells and Umbilical Cord MSCs，”Int’l.J.Clin.Med.1(1)：21-25(2014)；Thakkar等，“Insulin-secreting Adipose-derived Mesenchymal Stromal Cells with Bone 
Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells from Autologous and Allogenic Sources for Type I Diabetes Mellitus，”Cytotherapy doi.org/10.1016/j.jcyt.2015.03.608(2015年4月在线发表)，其据此以引用的方式整体并入本文。

[0090] 本发明的另一方面涉及一种制备本文所述的可植入治疗递送系统的方法。这个方法涉及提供基底，用聚合物溶液涂布所述基底，以及在所述涂布基底上提供包含一种或多种治疗剂的外部水凝胶层。

[0091] 制备本发明的可植入治疗递送系统的示例性方法描述于以下实施例中。这些方法是简单和温和的，并且不需要使用微制造装置或复杂化器具，诸如用于产生微囊的小滴产生器。

[0092] 方法以用不溶解基底的聚合材料涂布基底，即一个或多个纤细柔性机械稳定绳带或条束开始。上文描述适合基底材料和构型。

[0093] 聚合涂料在基底上形成薄涂层，并且在一些实施方案中，沿绳带形成单独“锚定”珠粒或粒子。在这个和所有实施方案中，聚合涂层沿基底的长度是连续的。例如通过将基底浸泡或浸渍至聚合溶液中来用聚合材料涂布基底的方法可重复一次或多次以增加聚合涂层的厚度，此转而将增强所得系统的机械强度和尺寸。聚合涂层含有如上文所述的二价阳离子或其它交联剂。交联剂对于聚合涂层与外部水凝胶层之间的内部交联是重要的。作为一种控制可植入系统的直径的手段，可改变(即增加或降低)交联剂的浓度。

[0094] 接着将聚合涂布基底浸渍于水凝胶溶液中以形成可植入系统的外部生物可相容层。基底在水凝胶溶液中的浸渍时间可在1-60分钟之间变化或更久，并且提供控制可植入系统的直径的另一手段，即浸渍时间越长，外部水凝胶层的直径越大。

[0095] 根据一个实施方案，可使目标治疗剂或产生或分泌目标治疗剂的细胞在涂布聚合涂布基底的过程之前或期间分布在整个水凝胶材料中。水凝胶层内的治疗剂浓度或细胞密度将视所治疗的病状和个体而变化，并且可易于由本领域技术人员确定和/或调整。

[0096] 在一些实施方案中，通过暴露于第二外部交联剂(例如CaCl2、BaCl2或上文公开的任何交联剂)来进一步交联水凝胶涂布系统。

[0097] 为制造本发明的细胞装载系统，根据一个实施方案，首先用高度多孔性Ca2+释放性聚合层涂布纤细缝合线。接着将改性缝合线浸没在含有细胞的海藻酸盐溶液中，在所述溶2+ 2+
液中，由于Ca 释放而围绕改性缝合线发生交联。可通过调整聚合层的Ca 含量和浸没时间来控制水凝胶纤维的尺寸。可使用外部Ba2+溶液进一步交联水凝胶纤维。整个制造方法是简单和温和的，并且不涉及微制造装置或复杂化器具，诸如用于产生微囊的小滴产生器。改性纤维可预先制备，并且作为供研究和临床团体用的“成品”易使用平台来供给。

[0098] 尽管本文已详细描绘和描述优选实施方案，但将为相关领域技术人员显而易知的是可在不脱离本发明的精神下进行各种修改、添加、取代等，并且因此，这些修改、添加、取代等被视为在本发明的如在随后权利要求中限定的范围内。实施例

[0099] 提供以下实施例以说明本发明的实施方案，但它们决不意图限制它的范围。

[0100] 实施例1-胰岛囊封用丝线强化海藻酸盐纤维材料和方法

[0101] 化学品。氯化钙(CaCl2)、氯化钡(BaCl2)、氯化钠(NaCl)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)。葡萄糖从购买Mallinckrodt Pharmaceuticals(Dublin，Ireland)。海藻酸钠购自FMC BioPolymer Co.(Philadelphia，PA)。所有化学品都不经进一步纯化即使用。用Millipore纯化系统将水去离子成18.2MΩ-cm。

[0102] 动物。用于植入实验的C57BL/6小鼠从The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)获得。用于分离胰岛细胞的Sprague-Dawley大鼠从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)获得。用于植入的Beagle狗从Marshall Bioresources(Clyde，NY)获得。
所有动物程序都由康奈尔机构动物护理和使用委员会(Cornell Institutional Animal Care and Use Committee)核准。

[0103] 表征。通过不同分析技术来表征样品。通过使用场致发射扫描电子显微分析仪(LEO 1550)来进行扫描电子显微术(SEM)和能量色散谱仪(EDS)元素测绘。通过数字倒置显微镜(EVOS fl)观察光学和荧光显微图像。使用动态机械分析(DMA Q800)进行常规宏观拉伸测量。所有样品都以约1.5cm的距离安放在夹持器之间。在室温(23℃)下在0.5N/min的速率下进行拉伸测试。应力(MPa)和应变(％)由软件自动计算。通过使用激光扫描共焦显微镜(LSM 710)获取共焦图像。

[0104] 制造改性缝合线。通常，对于条束上有珠粒(beads-on-a-strand)设计，首先将缝合线(Ethilon尼龙缝合线，3-0，单丝，Ethicon，Inc.)紧密固定在夹持器上。将缝合线浸没至含有2.5％(w/v)CaCl2的7％(w/v)PMMA/DMF溶液中3秒。接着从聚合物溶液取出缝合线，并且在空气中干燥。对于螺旋缝合线设计，使用无菌5-0单丝尼龙缝合线(Ethilon尼龙缝合线，Ethicon，Inc.)。在完成改性之后，所有缝合线在使用之前都通过γ-辐射来灭菌。

[0105] 大鼠胰岛分离和纯化。称重约300g的来自Charles River Laboratories的Sprague-Dawley大鼠用于收集胰岛。所有大鼠都使用含3％异氟烷的氧气麻醉，并且在整个程序中都维持在相同比率下。如由Lacy和Kostianovsky，“A Method for the Isolation of Intact Islets of Langerhans from the Rat Pancreas，”Diabetes 16：35(1967)所述进行分离手术，所述文献据此以引用的方式整体并入本文。简要来说，将导管插入胆管，并且通过体内注射含0.15％释放酶(研究级，Roche)的RPMI 1640培养基溶液来扩张胰腺。
在37℃水浴中消化胰腺30分钟。通过添加10-15mL具有10％热失活胎牛血清的冷M199培养基以及略微振荡来终止消化。在M199培养基中洗涤消化的胰腺两次，经450mm筛过滤，接着混悬于Histopaque 1077(Sigma)/M199培养基梯度中，并且在4℃下在1700RCF下离心。重复这个梯度离心步骤以获得较高纯度胰岛。最后，从梯度收集胰岛，并且通过其中在沉降4分钟之后丢弃各上清液的一系列重力沉积来进一步分离。在光学显微镜下等分手动计数纯化的胰岛，接着在无菌PBS中洗涤三次。接着在具有10％热失活胎牛血清和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中洗涤胰岛一次，并且在这个培养基中培养过夜以供进一步使用。

[0106] 细胞囊封。通常，预先计算所需细胞密度。将细胞分散在预定体积的2％(w/v)海藻酸钠溶液(SLG100)中。接着，将改性缝合线浸没至细胞装载的海藻酸盐溶液中4分钟。在从海藻酸盐溶液移除之后，通过含有100mM CaCl2和5mM BaCl2的交联缓冲液来进一步交联附着的水凝胶层。接着，用9％(w/v)盐水洗涤装置三次，并且放置至相应细胞培养基中。对于胰岛囊封，在囊封之前即刻，在1400rpm下离心培养的胰岛1分钟，并且用无Ca克雷布斯-亨泽莱特(Kerbs-Henseleit，KH)缓冲液(4.7mM KCl、25mM HEPES、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4×7H2O、135mM NaCl，pH≈7.4，渗透压≈290mOsm)洗涤。在洗涤之后，再次离心胰岛，并且抽吸所有上清液。接着，遵循以上提及的方案囊封收集的胰岛。因为胰岛具有可变尺寸(50-400μm)，所以基于先前发表的方法(Ricordi等，“Islet Isolation Assessment in Man and Large Animals，”Acta Diabetol.Lat.27：185-195(1990)，其据此以引用的方式整体并入本文)将囊封胰岛的总数换算成胰岛当量(IE，相对于150μm尺寸加以标准化)。

[0107] 植入/移植手术。将具有免疫能力的雄性C57BL/6小鼠用于移植。为产生胰岛素依赖性糖尿病小鼠，连续5天用新鲜制备的链脲霉素(STZ)(Sigma-Aldrich)溶液(7.5mg/mL，于柠檬酸钠缓冲溶液中)处理(50mg/kg小鼠)健康C57BL/6小鼠。在移植之前再测试所有小鼠的血糖水平。仅有非空腹血糖水平高于300mg/dL的小鼠被视为患有糖尿病，并且经受移植。非糖尿病小鼠或STZ诱发糖尿病小鼠用含3％异氟烷的氧气麻醉。将各小鼠的腹部剃毛，并且使用必妥碘(betadine)和70％乙醇灭菌。在手术前，所有小鼠都皮下接受0.3mL 0.9％盐水以防止脱水。沿腹部的中线产生约1mm切口，并且使用钝器解剖来暴露腹膜衬里。接着用镊子抓紧腹膜壁，并且沿白线产生约1mm切口。接着将装置通过切口插入腹膜腔中。使用5-0锥形尖端聚二噁烷酮(PDS II)可吸收缝合线闭合切口。接着使用创伤夹在切口上方闭合皮肤。

[0108] 狗腹腔镜检查程序。预先用吡咯糖(glycopyrrolate)和布托啡诺(butorphanol)对狗给药，用丙泊酚(propofol)诱导，并且用异氟烷麻醉。钳夹腹部，并且为无菌手术做准备。使用哈森(Hasson)技术将10mm腹腔镜检查端口在肚脐尾侧1cm处在中线上插入腹部中。用CO2吹入腹部以达到12mm HR压力。将5mm腹腔镜检查端口在肚脐外侧3cm以及肚脐颅侧
2cm的位点处经皮插入左侧腹部中。将第二5mm腹腔镜检查端口在肚脐外侧3cm以及肚脐颅侧2cm的位点处放置在腹部的右侧中。通过10mm端口引入10mm刚性内窥镜以使得能够观察腹部。通过左侧腹腔镜检查端口将TRAFFIC系统插入腹部中。通过右侧5mm端口引入腹腔镜检查探头，并且用于操纵TRAFFIC系统以使它被放置在肝与横隔膜之间，或分配在颅侧腹部中。在其中装置分配在整个颅侧腹部中的情况下，使用通过TRAFFIC系统的头部和左侧5mm端口部位的边缘放置的3-0聚二噁烷酮缝合材料将装置的顶部固定于腹壁。接着移除其余端口，并且用3-0聚二噁烷酮缝合材料闭合端口部位。

[0109] 血糖监测(小鼠)。在小鼠中进行移植手术之后，一周三次监测血糖水平。使用刺血针从尾部静脉收集1小滴血液，并且使用商业血糖仪(Clarity One，Clarity Diagnostic Test Group，Boca Raton，FL)加以测试。非空腹血糖水平低于200mg/dL的小鼠被视为血糖正常。

[0110] 取回材料(小鼠)。在植入或移植(用囊封细胞)后的所需时间点，使用含3％异氟烷的氧气使小鼠麻醉，并且在整个程序中都维持在相同比率下。在手术前，所有小鼠都皮下接受0.3mL 0.9％盐水以防止脱水。在转移至手术区域之前，将小鼠的腹部剃毛以及或者用必妥碘和70％乙醇擦洗以产生无菌区域。沿腹部的中线产生约5mm切口，并且使用钝器解剖来暴露腹膜。在腹膜上产生约5mm切口，并且通过使用钝化镊子来抓紧和拉出装置。用5-0锥形尖端聚二噁烷酮(PDS II)可吸收缝合线闭合切口，并且使用创伤夹在切口上方闭合皮肤。

[0111] 取回材料(狗)。预先用吡咯糖和布托啡诺对狗给药，用丙泊酚诱导，并且用异氟烷麻醉。钳夹腹部，并且为无菌手术做准备。使用哈森技术将10mm腹腔镜检查端口在肚脐尾侧1cm处在中线上插入腹部中。用CO2吹入腹部以达到12mm Hg压力。将5mm腹腔镜检查端口在肚脐外侧3cm以及肚脐颅侧4cm的位点处经皮插入左侧腹部中。将第二5mm腹腔镜检查端口在肚脐外侧3cm以及肚脐颅侧4cm的位点处放置在腹部的右侧中。通过10mm端口引入10mm刚性内窥镜以使得能够观察腹部。将先前插入的TRAFFIC系统定位并拍照。用腹腔镜检查Kelly镊抓紧TRAFFIC系统，并且必要时从附着的网膜进行解剖。接着通过左侧5mm端口部位从腹部移除TRAFFIC系统。在其中先前将装置固定于腹壁的那些情况下，切除在中心处进行缝合固定的一圈1cm完全厚度的全厚体壁。移除其余端口，并且以人道方式使狗安乐死。

[0112] 组织学分析。将取回的装置固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并且由康奈尔组织学核心研究室(Comell Histology Core Facility)来切片。用苏木精/伊红(hematoxylin/eosin)染色10微米厚度的石蜡切片。对于用免疫荧光染色胰岛素，通过依序在二甲苯、100％、95％、75％乙醇以及水中洗涤来再水合石蜡包埋的切片。接着，在1mM EDTA中煮沸载片以进行抗原暴露。在阻断之后，施加初级豚鼠抗大鼠胰岛素抗体(Linco，1∶
200)，并且在4℃下孵育过夜，继之以洗涤以及与FITC缀合的驴抗豚鼠IgG(Jackson 
Immunoresearch，1∶200)一起孵育。用水洗涤载片两次，施加以抗淬灭剂/DAPI，并且用盖片覆盖。在康奈尔生物技术资源中心成像研究室(Cornell Biotechnology Resource Center Imaging Facility)，在ZeissLSM710共焦显微镜下捕集荧光图像。

[0113] 结果

[0114] 为制造具有图2A中所示的结构的TRAFFIC系统，首先制备具有一系列断续亲水性多孔Ca2+释放性珠粒的条束(图2B中的步骤1-2)，接着将改性条束浸没在海藻酸盐溶液中以形成纤维(图2B中的步骤3)。使用较早出版物(Zheng等，“Directional Water Collection on Wetted Spider Silk，”Nature 463：640-643(2010)，其据此以引用的方式整体并入本文)中所述的方法的改进形式制造珠粒装饰条束。简要来说，用溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并且含有2.5％CaCl2的粘稠7％(重量/体积)聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)溶液水平浸涂70μm尼龙条束。涂布溶液在尼龙条束上形成薄膜，并且由于瑞利不稳定性驱动的表面张力而在条束上自发地分散成一系列规则小滴(Quere等，“Wetting of Fibers-Theory and Experiments，”Rev.Phys.Appl.23：1023-1030(1988)，其据此以引用的方式整体并入本文)。在干燥之后，形成“条束上有珠粒”结构(图2C-D)。珠粒具有椭圆形，沿条束轴略微伸长，具有横向直径约150μm。引起关注的是，珠粒具有高度多孔性，如由图2E中的海绵样结构所示。据信在珠粒上形成孔是归因于干燥过程，并且改进珠粒与随后形成的水凝胶纤维之间的粘着。

[0115] 接着将改性条束浸渍于2％海藻酸盐溶液中4分钟，并且围绕条束原位形成直径约700μm的水凝胶纤维。通过将条束强化水凝胶纤维转移至20mM BaCl2溶液中来再进一步交联其5分钟。图2F显示最终水凝胶纤维的代表性图像。不同于先前使用微流体技术报道的水凝胶纤维，其中海藻酸盐从外部来源加以交联，此处所述的水凝胶纤维通过从条束释放的钙进行内部交联而形成。多孔珠粒提供增加的钙释放表面积。这个方法确保海藻酸盐水凝胶围绕条束的厚度相对均一。共焦荧光图像(图2F，插图)确认复合纤维的同心结构，其中锚定珠粒用若丹明(Rhodamine)(红色)荧光染料标记，并且海藻酸盐与Alexa Fluor(绿色)染料化学缀合。

[0116] 接着，得以证明的是，水凝胶纤维的直径可通过调整不同参数而易于控制在300μm至1.5mm之间(图2G-J)。举例来说，假设浸渍时间相同，涂布溶液中的Ca2+含量较高导致水凝胶纤维直径较大。通过重复浸涂制备的较大直径珠粒也使纤维尺寸增加。假设珠粒化绳带相同，纤维尺寸也可通过调整浸渍时间来控制。引起关注的是，当涂布溶液中的Ca2+含量太低(＜0.5％)时，无论浸渍时间如何都不形成水凝胶纤维。这可能因为释放的Ca2+量不足以交联海藻酸盐。也引起关注的是水凝胶纤维尺寸随时间在1.5mm下饱和。

[0117] 能够控制条束尺寸使得有可能工程改造水凝胶纤维以满足不同特定要求。较小直径纤维具有较高传质表面积，而较大直径纤维具有较高胰岛囊封容量。纤维的直径也可影响生物相容性(下文讨论)。此外，极其简单的是通过将细胞在预定细胞密度下分散在海藻酸盐溶液中来将治疗性细胞并入TRAFFIC系统中。如图2K中所示，大鼠胰岛被分离并成功囊封至TRAFFIC系统中。在囊封后过夜培养之后，对胰岛的活体/死体染色显示细胞具有卓越活力(图2L)。此外，得以进一步证明的是这个平台也可应用于其它类型的细胞，诸如模型细胞MDA-MB-231乳腺癌细胞(图22A)、人胚胎干细胞(hESC)源性胰腺祖细胞(PP)(图22B)和人肝细胞-基质细胞聚集物(图22C)。下文测试和讨论这些细胞的活力和功能性。

[0118] 通过使用扫描电子显微镜进行EDS元素测绘以检查钙在这个TRAFFIC系统中的分布。如图8A中所示，氯化钙沿整个珠粒化绳带结构均一分布。EDX光谱显示钙和氯的峰相同(图8B)，从而表明氯化钙存在于整个表面上。

[0119] 先前研究已证明植入生物医学装置的几何结构可调节外来体应答和纤维化(Kusaka等，“Effect of Silica Particle Size on Macrophage Inflammatory 
Responses，”PLoS ONE 9：e92634(2014)；Zandstra等，“Microsphere Size Influences the Foreign Body Reaction，”Eur.Cells Mater.28：335-347(2014)；Matlaga等，“Tissue Response to Implanted  Polymers：The  Significance of Sample  Shape，”
J.Biomed.Mater.Res.10：391-397(1976)；以及Salthouse，“Some Aspects of Macrophage Behavior at the Implant Interface.”J.Biomed.Mater.Res.18：395-401(1984)，其据此以引用的方式整体并入本文)。圆形杆相比于五边形或三角形杆产生程度较小的纤维化(Matlaga等，“Tissue Response to Implanted Polymers：The Significance of Sample Shape，”J.Biomed.Mater.Res.10：391-397(1976)，其据此以引用的方式整体并入本文)。此外，新近研究显示球形海藻酸盐水凝胶珠粒的尺寸在诱导/防止纤维化方面起重要作用(Veiseh等，“Size-and Shape-Dependent Foreign Body Immune Response to Materials Implanted in Rodents and Non-Human Primates，”Nature Mat.14：643-651(2015)，其据此以引用的方式整体并入本文)。改变TRAFFIC系统中的海藻酸盐层的厚度，并且通过将装置植入C57BL/6小鼠的腹膜内(IP)间隙中来测试外来体应答。已知C57BL/6小鼠品系相比于诸如Balb/c小鼠或Lewis大鼠的其它品系产生更重度纤维化(King等，“The Effect of Host Factors and Capsule Composition on the Cellular Overgrowth on Implanted Alginate Capsules，”J.Biomed.Mater.Res.57：374-383(2001)，其据此以引用的方式整体并入本文)。

[0120] 首先进行2周研究，因为据报道明显纤维化出现在用其它植入物在IP间隙中植入的2周内(Veiseh等，“Size-and Shape-Dependent Foreign Body Immune Response to Materials Implanted in Rodents and Non-Human Primates，”Nature Mat.14：643-651(2015)，其据此以引用的方式整体并入本文)。在这个研究中，测试两种不同尺寸植入物。在“大”组(n＝5)中，小鼠用具有约1.5mm直径的TRAFFIC系统植入，而在“小”组(n＝5)中，小鼠用约400μm直径的TRAFFIC系统植入。将单一2.5cm长度的“大”或“小”装置植入各小鼠的IP间隙中。图3A和3E是“大”(图3A)和“小”(图3E)装置在植入时的显微图像。在2周之后，将装置取回并表征。光学显微术用于评估装置上的细胞过度生长。发现相比于1.5mm直径装置(图3B-D)，有更加许多细胞附着于400μm(图3F-H)直径装置。H&E染色显示几乎无细胞附着于1.5mm TRAFFIC系统(图3C)，而较小直径装置被多层纤维化组织包裹(图3G)。利用DAPI(核标志物)、F-肌动蛋白(细胞骨架标志物)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，肌纤维母细胞标志物)，使用Z堆叠共焦成像来进一步考查细胞沉积。这些数据全都显示较大直径装置具有显著降低的纤维化沉积(比较图3D和3H)。接着进行长期研究(90天)以夯实所述结果，并且评估不同纤维化应答归因于细胞覆盖较大直径装置的时间不足的可能性。取回装置的暗视野相差图像显示相较于较小直径装置(图3N)，较大直径装置上的细胞沉积显著降低(图3J)。组织学和免疫组织化学分析也确认这个倾向(比较图3K-L与图3O-P)。为进一步证明在较大动物模型中TRAFFIC系统的稳定性和植入/取回按比例扩大的TRAFFIC系统的可能性，通过使用最小侵袭性腹腔镜检查程序来将装置植入狗中。如图4A-I中所示，使用腹腔镜检查将长度约20cm的TRAFFIC系统腹膜内植入4只狗中。将装置放置在肝与横隔膜之间(图
4A)。在2周之后，再进行腹腔镜检查程序以取回装置。如图4D中所示，TRAFFIC系统保持在肝与横隔膜之间，并且基于显微检查(图4E)和组织学分析(图4F)(相较于在第0天对植入物的显微检查(图4B)和组织学分析(图4C))，无可观察的组织粘着或纤维化产生。不存在细胞附着于装置(图4B-C)。这个结果表明TRAFFIC系统在大动物模型中具有最小反应性，并且可为理想转化细胞囊封装置。

[0121] 尽管植入1只狗中的TRAFFIC系统不导致外来体应答，但在这个实验中鉴定了植入物强度的问题。如图4G-I中所示，在3只狗中在水凝胶层上存在断裂。这个水凝胶层损害可已由狗的运动或在植入期间引起。这暗示机械强度，尤其是水凝胶层与强化层之间的附着需要改进。因此，通过进行EDS元素测绘来分析钙元素沿缝合线的分布。如图8A-B中所示，钙和氯元素沿纤维断续分布，与锚定珠粒共同定位。这指示相比于裸露缝合线部分，海藻酸盐水凝胶围绕锚定珠粒更坚固交联，并且这个均一性不足可已导致集中微弱水凝胶附着。

[0122] 因此，为改进TRAFFIC系统的机械稳定性，开发基于“扭曲缝合线”设计的系统(图5A)。为制造这个新TRAFFIC系统，如图5B中所示，首先将两个缝合线扭曲在一起，接着通过从双螺旋结构的中间进行自扭曲来释放扭力以形成具有四个扭曲在一起的条束的稳定螺旋结构。接着将扭曲缝合线浸泡在PMMA：CaCl2/DMF溶液中以用一层聚合物涂料改性。将改性扭曲缝合线浸泡在海藻酸盐溶液中以原位交联一层均一海藻酸盐水凝胶。相较于具有光滑表面的单一缝合线条束，扭曲缝合线具有许多连续纵向沟槽。这些结构促进可湿润性，以使聚合物溶液可易于湿润整个结构而不形成珠粒。下文讨论详细理论解释。通过数字成像(图5C-E)和荧光成像(图5I-K)来追踪表面改性过程。扫描电子显微术(SEM)用于考查装置的微米-纳米结构。图5F是显示具有四个条束的典型螺旋扭曲缝合线结构的SEM图像。图5G-H是聚合物改性扭曲缝合线的SEM图像，其指示聚合物层的均一涂布和聚合物层的多孔表面。荧光显微镜图像(图5I-K)也确认聚合物层(图5J)与海藻酸盐水凝胶层(图5K)两者的均一涂布。此外，通过再次使用扫描电子显微镜进行EDS元素测绘以检查钙在这个新TRAFFIC系统设计中的分布。如图5L-N中所示，氯化钙沿整个扭曲缝合线结构均一分布。EDX光谱显示钙和氯的峰相同(图5O)，从而表明氯化钙存在于整个表面上。通过将hESC源性胰腺祖细胞聚集物(PP)囊封在这个新TRAFFIC系统中来在体外证明细胞囊封应用能力(图5P-Q)。在培养基中培养含有PP的TRAFFIC系统3天，并且用活体/死体染色测定加以染色。如图5R中所示，大多数囊封细胞仍然活着，从而指示新TRAFFIC系统具有生物相容性。

[0123] 图9A-9D是显示绳带结构对聚合物涂层几何结构的影响的图像。图9A-9B显示单一直条束(图9A)以及聚合物珠粒在所述单一直条束上的形成(图9B)。相比之下，图9C中的扭曲条束在用聚合物涂料涂布时(图9D)不形成珠粒化几何结构。

[0124] 为探究TRAFFIC系统的治疗潜力，将囊封大鼠胰岛移植至化学诱发C57BL/6糖尿病小鼠中(图6A)。选择C57BL/6小鼠，因为已知这个品系针对海藻酸盐囊体产生的强烈纤维化应答比诸如Balb/c小鼠或Lewis大鼠的其它小鼠品系更高。首先，根据先前报道的方案(Facy和Kostianovsky，“Method for the Isolation of Intact Islets of Fangerhans from the Rat Pancreas，”Diabetes 16：35(1967)，其据此以引用的方式整体并入本文)分离大鼠胰岛(图6B)。接着将分离的大鼠胰岛在每毫米长度的TRAFFIC系统约20胰岛当量(IE)的密度下囊封至TRAFFIC系统中(图6C)。各STZ诱发糖尿病小鼠通过腹膜内植入来接受含有约1英寸或约500IE的大鼠胰岛的TRAFFIC系统的移植。图6G显示移植后随时间的血糖浓度(“BG”)。在植入之后2天，糖尿病被逆转，并且保持治愈(即BG＜200mg/dL)至少4周，此时实验结束。在移植之后第28天，进行腹膜内葡萄糖耐受性测试(IPGTT)。如图6H中所示，在腹膜内注射葡萄糖之后，在健康小鼠与糖尿病小鼠两者中，BG均上升而超过400mg/dL。接着在90分钟之后，BG逐渐降低回到正常范围，从而指示移植的胰岛仍然具有功能性。将装置取回，并且所有小鼠都返回糖尿病状态，从而确认含有大鼠胰岛的TRAFFIC系统有效调控血糖水平和控制糖尿病。取回的装置不具有可见组织粘着或广泛纤维化(图6D)。组织学研究(图6E-F)揭示仅有一层极薄(约1-2层细胞)细胞过度生长物。囊封胰岛似乎是正常的，此与BG和IPGTT数据一致。将这些胰岛囊封和糖尿病模型实验重复3次。

[0125] 如上所提及，通过变为“扭曲条束”设计，TRAFFIC系统的机械稳定性得以极大改进(图10A-10C)。因此，进行另一实验以确认在狗模型中植入/取回的可行性，并且测试新形式的TRAFFIC系统的稳定性(图7A)。制造具有约30cm长度和1.5mm直径的基于“扭曲条束”设计的TRAFFIC系统。将装置装载至1mL吸移器中，并且通过5mm腹腔镜检查套管针插入腹膜内间隙中(图7B)。以腹腔镜检查方式操纵TRAFFIC系统，并且如图7E中所示，将TRAFFIC系统插入在肝与横隔膜之间以避免触及网膜。在1个月之后，再进行腹腔镜检查手术以取回装置。如图7G中所示，TRAFFIC系统仍然处于肝颅侧位置，并且完全不存在组织粘着。更引起关注的是，TRAFFIC系统在肝上产生压痕。组织学研究(图23A-D)显示深达压痕的肝实质是完全正常的，从而表明TRAFFIC具有生物惰性。TRAFFIC系统易于以腹腔镜检查方式取回(图7J)，接着加以显微检查。如图7H中所示，TRAFFIC系统表面是完整的，未见细胞附着。相较于植入前，在装置的形状方面不存在明显变化(比较图7H和7F)，从而表明螺旋TRAFFIC系统构型相较于原始设计具有改进的耐久性。图7I中所示的组织学分析进一步证明在装置上不存在细胞附着。

[0126] 讨论

[0127] 细胞囊封的治疗潜力在接近40年以前被证明，并且从那时起已进行大量研究。然而，当今最通常使用的囊封材料的几何形式已基本上保持相同(Raof等，“One-Dimensional Self-Assembly of Mouse Embryonic Stem Cells Using an Array of Hydrogel Microstrands，”Biomaterials 32：4498-4505(2011))：圆柱形(诸如中空纤维)、平面(诸如水凝胶片)或球形(微囊)。尽管已在各个种类中(尤其是对于用于T1D治疗的胰岛囊封而言)取得极大进展，但仍然存在关键挑战。TRAFFIC系统设计彻底不同，并且可根本上转变整个细胞囊封领域。

[0128] 相较于当前管状或平面宏观装置，TRAFFIC系统具有生物可相容的水凝胶外部和大传质表面积。它具有机械坚固性，并且不具有密封或泄漏问题(Writing Team for the Diabetes Complications Trial/Epidemiology of Diabetes&Complications Research，“Sustained Effect of Intensive Treatment of Type 1 Diabetes Mellitus on Development and Progression of Diabetic Nephropathy：The Epidemiology of 
Diabetes Interventions and Complications(EDIC)Study，”JAMA 290：2159-2167
(2003))。相较于当前水凝胶微囊，纤细柔性“扭曲缝合线”允许较易于处理和操纵。它使得细胞囊封更容易和更可使用。不需要微制造或小滴产生器。“扭曲缝合线”可用作供研究者和临床医师用的成品易使用平台。此外，有可能通过调整绳带和围绕它的水凝胶纤维的直径来控制以与表面的何种接近程度定位植入细胞(扩散距离)。短扩散距离不仅有益于细胞存活，而且也有益于快速葡萄糖应答(Weir等，“Scientific and Political Impediments to Successful Islet Transplantation，”Diabetes 46：1247-1256(1997)；Dufrane等，“Macro-or Microencapsulation of Pig Islets to Cure Type 1 Diabetes，”World J.Gastroenterol.18：6885-6893(2012)，其据此以引用的方式整体并入本文)。聚合物涂层可由含有用以缓和外来体应答的消炎药物(例如地塞米松)的可缓慢生物降解聚合物(例如聚己内酯)制得。

[0129] 最重要的是，TRAFFIC系统设计使得能够便利取回和替换。用以使用腹膜灌洗来取回微囊的传统方法具有侵袭性且耗时，并且鉴于腹膜腔中不同器官的复杂结构，几乎不可能取回所有微囊。即使在重复侵袭性腹膜灌洗的情况下，小鼠中多达40％微囊也可能不会被取回(Lee等，“Synthesis of Cell-Laden Alginate Hollow Fibers Using Micro fluidic Chips and Micro vascularized Tissue-Engineering Applications，”Small 5：1264-1268(2009))。在通常将多1,000倍的微囊移植于其中的人中，保留百分比可为类似的，或甚至更高的。用最小侵袭性腹腔镜检查手术，TRAFFIC系统可易于和完全被取回。对于任何移植，在疗法完成或移植失败之后直接了当移除将解决患者对外来材料和细胞永久植入他们的身体内的担忧。这也将使得研究者和医师能够通过检查取回的整体植入物来研究任何植入失败的机理。因为源于干细胞或成体细胞的治疗性细胞成为初级细胞的潜在替代物，所以装置的可取回性和机械坚固性为缓和对畸胎瘤形成的担忧所更高度需要。最后，也可使用不同水凝胶形成材料，包括在使用小滴产生器的情况下不易于形成球形囊体的那些。这个平台技术将决定性地转变囊封和递送治疗性细胞的方式。

[0130] 实施例2-条束上有珠粒设计与扭曲条束设计之间的纤维-水凝胶摩擦比较

[0131] 机械坚固性是可植入/可取回生物医学装置的一种最重要性质。在开发条束上有珠粒(“BOS”)设计装置(上文所述)期间，发现海藻酸盐水凝胶层有时将从内部强化物脱离，尤其是沿纤维的长轴。也发现内部条束可相当容易地从水凝胶壳体拉出。然而，当变为扭曲条束设计时，发现拉出强化条束要困难得多。为进一步探究这个关系，分析水凝胶层与强化条束之间的摩擦力。

[0132] 当比较两种强化条束的SEM图像时，注意到在BOS设计中，在珠粒之间存在裸露缝合线区域(图11A)。然而，在扭曲条束设计中，聚合物覆盖整个条束(图11B)。当在高放大倍数下评估聚合物层时，发现聚合物具有高度多孔性。这个多孔性极大促进摩擦力，因为[0133] Fr＝μN

[0134] 其中Fr是摩擦阻力，μ是两个表面的与表面粗糙度相关的摩擦系数，并且N是将两个物体推压在一起的法向力。因此，由于高度多孔性聚合物层的更多覆盖，所以水凝胶与扭曲条束之间的摩擦应高于BOS设计。

[0135] 促成摩擦力差异的另一因素是两种设计的几何结构。基于两种设计来构建3-D模型。将扭曲条束设计模型简化成2个扭曲条束而非4个。接着，检查沿条束轴的截面。如图12A-B中所示，对于BOS设计，珠粒沿直条束边缘提供光滑节状间断。这个节状结构可增加沿条束表面至某一点的阻力，并且可进一步增加水凝胶与强化条束之间的摩擦。相比较来说，在扭曲条束设计中，如可在图12C-D中所见，截面图像显示沿轴的许多“毛刺”结构。由于这些“毛刺”结构，水凝胶与强化条束之间的机械相互作用不仅基于摩擦，而且也基于独特结构相互作用。据信这些结构障碍进一步促进整个装置的机械坚固性。

[0136] 实施例3-对单一条束和扭曲条束的理论可湿润性分析

[0137] 液体倾向于借助表面张力来使它们的表面积最小，此可导致液体不稳定性，诸如流体分散。球体是具有最小表面积与体积比率的几何形状，因此少量液体倾向于形成球体样小滴。在固体条束处于均一液体薄膜内的情况下，毛细管压力将迫使液体脱离薄膜，并且引入液体不稳定性。这个不稳定性导致液体薄膜起伏，并且最终分散成一串小滴。

[0138] 已报道当波长

[0139]

[0140] 小于涂布纤维的液体圆柱的周界

[0141] (l＝2π(R+t))

[0142] 时，液体薄膜可稳定存在于纤维上(Quere，“Fluid Coating on a Fiber，”Annu.Rev.FluidMech.31：347-384(1999)，其据此以引用的方式整体并入本文)。此处，t是薄膜厚度，并且R是纤维半径。因此，薄膜厚度的上限是tmax，即

[0143]

[0144] 液体薄膜的原始厚度tG对于液体不稳定性或流体分散是重要的。基于质量守恒，当忽略归因于蒸发的液体损失时，数值可通过小滴的最终体积和形状来逆向确定。在图13中，在1波长内的小滴体积Vf由下式给出：

[0145]

[0146] 其中β是小滴的一半长度，并且u(x)是在x方向上的小滴厚度。

[0147] 原始薄膜厚度t0易于通过解析以下等式来获得

[0148] πλ[(t0+R)2-R2]＝Vf。

[0149] 明显的是原始薄膜极薄，并且t0＜tmax是液体薄膜不稳定的原因。

[0150] 平行或扭曲条束由于条束之间的楔形部分而降低液体不稳定性和流体分散(参见图14)。相较于平行条束，扭曲条束由于条束之间的更好接触和相互作用而具有更高机械强度。另外，深楔形部分确保沿扭曲条束存在连续液体薄膜。

[0151] 已显示当

[0152] α+θ＜π/2

[0153] 时，以二面角2α附着于固体边缘的液体是稳定的(Langbein，“The Shape and Stability of Liquid Menisci at Solid Edges，”J.Fluid Mech.213：251-265(1990)，其据此以引用的方式整体并入本文)。此处，θ是接触角，并且α等于∠FGC(参见图15)。

[0154] 考虑圆形条束的凸表面，弧长 大于线长 因此，当

[0155] ∠FGC+∠OC1P＜π/2

[0156] 或液体-蒸汽界面 是凹面(其近似地在PPT中观察到)时，平行或扭曲条束之间的较深楔形部分导致液体薄膜更稳定。

[0157] 接着，考虑重力对液体稳定性的影响。如果液柱的重力比毛细管力小得多，那么液体稳定性将仅取决于毛细管效应，并且重力将可忽略。基于吉布斯(Gibbs)自由能最小化方法，在界面CD处的毛细管压力由下式给出：

[0158]

[0159] 并且将归因于液体薄膜的重力的最大压力计算为

[0160]

[0161] 预期

[0162] pg＜＜Δp。

[0163] 用于模型中的等式如下。

[0164]

[0165] dU＝γSLdSSL+γSydSSV+γLVdSLV+ΔpSdh

[0166]

[0167]

[0168] γLV＝γ

[0169]

[0170]

[0171] ∠CAE＝α

[0172] ∠GCD＝∠CAE

[0173]

[0174]

[0175]

[0176]

[0177]

[0178]

[0179]

[0180]

[0181] ∠OC1P＝θ

[0182]

[0183]

[0184]

[0185]

[0186] SABCD＝R2(2-cosa)sina

[0187]

[0188]

[0189] 实施例4-用于细胞囊封、培养和递送的隔间化纳米纤维/水凝胶混合微装置

[0190] 材料和方法

[0191] 化学品和表征。聚己内酰胺(尼龙6)购自Scientific Polymer Products，Inc.(Ontario，NY)。甲酸、CaCl2和BaCl2购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)。海藻酸钠购自FMC BioPolymer Co.(Philadelphia，PA)。所有试剂都购买且不经进一步纯化来按原样使用。通过不同分析技术来表征样品。通过使用场致发射扫描电子显微分析仪(LEO 1550)来进行扫描电子显微术(SEM)。通过数字倒置显微镜(EVOS fl)观察光学和荧光显微图像。使用动态机械热分析(DMA Q800)进行常规宏观拉伸测量。所有样品都以约1.5cm的距离安放在夹持器之间。在室温(23℃)下在0.5N/min的速率下进行拉伸测试。应力(MPa)和应变(％)由软件自动计算。

[0192] 制造纳米纤维强化水凝胶微装置。在一典型合成程序中，制备20％(w/v)尼龙6和5％(w/v)CaCl2与甲酸混合的前体溶液。接着，进行典型电纺过程。将Ca2+释放性尼龙6纳米纤维电纺于旋转收集器上。之后，将所制备的纳米纤维装置浸没在2％海藻酸盐溶液中，并且放置在真空室中脱气15分钟以确定海藻酸盐溶液完全渗透至纳米纤维装置中。将装置放置在BaCl2/甘露糖醇/HEPES溶液中以增强海藻酸盐水凝胶的交联。

[0193] 胰岛囊封和移植。通过遵循先前报道的方案来从Sprague-Dawley大鼠分离胰岛。胰岛当量用于确定胰岛的数目。对于囊封，通常，收集500胰岛当量，并且分散在20μL MATRIGELTM中。通过使用预冷却注射器来将混悬于MATRIGELTM溶液中的胰岛注射至纳米纤维强化水凝胶微装置(nanofiber-reinforced，hydrogel microdevice，“NHM”)装置中。在密封开口端之后，用HEPES缓冲液洗涤装置，并且放置在RPMI培养基中，准备用于移植。为将NHM装置移植至小鼠中，使小鼠麻醉，并且沿腹部的中线产生1mm切口。将具有预定胰岛当量数目的NHM装置通过切口移植至腹膜腔中。通过缝合线和创伤夹来闭合切口。

[0194] 结果和讨论

[0195] 设计并构建用于细胞囊封、培养和递送的隔间化NHM。这个设计利用两种相互作用性材料：Ca2+释放性电纺聚合物纳米纤维和Ca2+可交联性海藻酸盐水凝胶。电纺纳米纤维膜是一类多用途材料，其具有作为生物材料使用的各种有吸引力的性质，诸如小纤维尺寸(约10nm-10μm)、高孔隙率(＞90％)和表面积(约10m2/g)、互连孔结构(约1μm)，以及更重要地，可调谐材料性质，包括机械强度、生物可降解性和可湿润性。在另一方面，在生理条件下，海藻酸盐水凝胶可易于通过二价阳离子来交联；它的生物相容性已被文献充分记载。在NHM设计中，组合这两种类型的材料以工程改造原位交联海藻酸盐以形成坚固混合细胞囊封微装置的Ca2+释放性纳米纤维微包装/微容器。

[0196] NHM设计的基本原理如下。首先，作为微装置壁的骨架的纳米纤维膜提供必要机械强度，并且防止任何潜在断裂或细胞泄漏，同时仍然允许达成足够传质。其次，作为由纳米纤维通过机械联锁加以强化的微装置外部的海藻酸盐水凝胶提供必要生物相容性和免疫保护。第三，可预先制备NHM，并且可以定制设计方式装载细胞，例如通过将细胞分散在它们的优选细胞外基质蛋白质中。因此，与身体相互作用的NHM外部水凝胶和内部隔间中与细胞相互作用的水凝胶可被断开联系并独立设计。最后，多个隔间可被工程改造成单一NHM，其可接着用于复杂细胞囊封、共培养和递送。

[0197] 如这个实施例中所述，制造具有不同隔间化的NHM，并且确认坚固机械性质。使用模型细胞与产胰岛素胰岛两者，证明在控制细胞分散基质的情况下达成流畅传质和在单一或多个隔间中灵活装载细胞。最后，通过囊封大鼠胰岛以及将其递送至化学诱发糖尿病小鼠模型中来评估NHM的生物相容性、功能性和可取回性。就在取回植入物之前的实验期间(8周)，糖尿病得以医治。根据组织学研究，取回的装置显示最小程度纤维化，并且如所预期，在装置内观察到活体和功能性胰岛，从而确认NHM作为用于细胞囊封疗法的新平台的极大潜力。

[0198] 为制造NHM，如图16A中所示，首先将纳米纤维直接电纺于铝旋转杆上以形成纳米纤维微管。可将不同聚合物(图20A-J)纺丝，并且尼龙由于它的卓越机械性质和广泛用作临床核准缝合材料而被选择。不同于常规电纺纤维，此处产生的尼龙纤维可释放通过将CaCl2溶解于尼龙前体溶液中来预先并入纤维中的Ca2+离子。释放的Ca2+接着自动交联海藻酸盐分子以围绕微管原位形成均一水凝胶薄层(图16B)。纳米纤维膜的互连多孔结构允许海藻酸盐水凝胶的注入，并且极大增强它的机械强度。为更清楚观察这个混合结构，将若丹明(红色)荧光染料并入尼龙纳米纤维中，并且海藻酸盐用Alexa Fluor(绿色)染料共价标记，如图16C-E中所示。更引起关注的是，可通过额外纳米纤维沉积将若干微管包封在一起来制造具有更复杂多隔间结构的NHM(图16F)。具有多个微隔间的NHM将具有供共同囊封、培养和递送不同类型的细胞的许多应用。

[0199] 如图17A中所示，制造具有在300μm至3mm(内部直径)的范围内的不同尺寸的纳米纤维尼龙微管和具有2至4个微隔间的纳米纤维装置。图17B显示微管和纳米纤维膜的扫描电子显微术(SEM)图像。个别尼龙纤维的平均直径是约200nm。尽管这个纳米纤维非纺织物的精确孔结构难以定量，但它们足够紧密以致细胞不可逃离，而氧、营养物、代谢废物和治疗产物能够自由扩散进出。为确认海藻酸盐水凝胶实际上渗透纳米纤维膜，并且它们通过纳米纤维结构来机械联锁，首先冷冻干燥NHM，接着在SEM下观察。如图17C中所示，脱水海藻酸盐附着于纤维，并且均一分布在间隙空间内。插入数字照片和共焦图像进一步分别揭示NHM在水合状态下的水样外观和薄(绿色)海藻酸盐水凝胶外部。这个紧密浸渍的结构使纳米纤维与水凝胶两者优势集合于NHM。在一方面，纳米纤维用更具生物相容性的海藻酸盐水凝胶涂布；在另一方面，软质水凝胶由坚韧尼龙纳米纤维强化，从而使得较易于处理，并且断裂或泄漏的可能性较小。

[0200] 接着，通过在纳米纤维膜、纳米纤维强化海藻酸盐水凝胶片和由单独海藻酸盐水凝胶制得的薄片之间比较弹性模量来定量机械增强。图17D中的应力-应变曲线明确显示海藻酸盐水凝胶的机械性质因尼龙纳米纤维强化而得以极大改进。这由混合物的通则而预期：

[0201] E总＝α1E1+a2E2，

[0202] 其中E总、E1、E2分别是复合材料和两种不同组分的杨氏模量(Young’s modulus)；并且a1、a2是它们的相应横截面积分数。

[0203] 首先通过使用模型细胞系MDA-MB-231细胞来证明NHM应用于细胞囊封和培养。将细胞分散在为许多细胞类型所喜爱的可商购获得的细胞外基质MatrigelTM中，接着注射至NHM中。在用1滴电纺溶液在开口端密封之后，将NHM置于培养下，并且表征细胞。图18A-B显示就在囊封之后(图18A)以及在培养5天之后(图18B)的细胞活力。使用MTT测定获得生长曲线(图18C)，其中对照组是相同量的接种于陪替氏培养皿(petri dish)上的MDA-MB-231细胞。细胞活力与生长曲线两者均确认NHM无毒，并且具有足以支持细胞存活和增殖的传质。

[0204] 另一细胞系GATA6WT用作细胞囊封的另一实例，其中将细胞囊封在管状NHM装置与平面NHM装置两者中。类似地，观察到高细胞活力。接着，使用NHM囊封大鼠胰岛。在过夜培养之后对囊封胰岛的活力染色(图18D)与胰岛素免疫染色(图18E)两者均再次确认NHM支持细胞和细胞聚集物的生长。更重要地，葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)测定(图18F)指示在囊封胰岛与对照(在培养基中培养的胰岛)之间，在葡萄糖刺激后的胰岛素分泌水平近似相同，从而指出不仅营养物的传质流畅，而且分泌的胰岛素的传质也流畅。

[0205] NHM设计中的一个独特特征是隔间化(图16F)，其使得能够在个别化隔间中囊封不同类型的细胞而非简单杂乱混合物。细胞被物理分隔，但可溶性因子(趋化因子和细胞因子)由于膜具有高渗透性以及细胞在不同隔间中邻近定位而基本上可互换。这种系统可作为用于在体外环境与体内环境两者下研究细胞共培养、细胞迁移和旁分泌信号传导的新型可植入平台而具有许多应用。为提供概念验证，MDA-MB-231-EGFP(绿色)细胞和MDA-MB-231-dTomato(红色)细胞用作共同囊封的模型细胞。将两种类型的细胞接种至单一NHM内的两个隔间中，如由2D(图18G、18H)和3D(图18I)荧光图像所示。在原则上，更多种类型的细胞可易于全都在单一微装置中加以囊封、共培养乃至递送。

[0206] 受NHM的坚固机械和传质性质以及预期生物相容性和可取回性鼓舞，使用大鼠向小鼠异种移植模型进行体内研究。将从Sprague-Dawley大鼠分离的胰岛囊封在NHM中，并且移植至具有免疫能力的链脲霉素(STZ)诱发糖尿病小鼠中。将C57BL/6小鼠选作供体，因为它们是已知相比于诸如Balbc小鼠或Lewis大鼠的其它模型，针对海藻酸盐显现更大程度纤维化的挑战性品系。对于各小鼠，腹膜内植入具有500胰岛当量的1英寸NHM装置。图19A显示移植后随时间的血糖浓度(BG)。在植入之后2天，糖尿病被逆转，并且保持治愈(即BG<200mg/dL)至少8周，此时实验结束。接着将装置取回，并且所有小鼠都返回糖尿病状态，从而确认NHM有效调控血糖水平和控制糖尿病。图19B显示取回的装置的典型照片；在装置上不存在可见组织粘着或广泛纤维化。组织学研究(图19C-D)揭示仅有一层极薄(约1层细胞)细胞过度生长物，并且更引起关注的是，海藻酸盐水凝胶仍然坚固附着于纳米纤维膜，这与机械表征一致(图17D)。从取回的装置观察的胰岛(图19C)似乎具有扭曲形态，从而表明那些胰岛可能在这个非天然环境中已经受一定应力。然而，重要的是，胰岛在植入8周之后似乎仍然具有功能性，如通过阳性胰岛素染色所指示(图19E)。总之，从这个体内实验获得的数据强烈表明NHM具有机械坚固性、生物相容性，易于植入和取回，并且具有足以供潜在长期临床使用的传质。

[0207] 总之，这个研究显示一种可克服本领域中一些最艰巨挑战的新型细胞囊封微装置。电纺纤维的机械强度和独特微米/纳米结构被利用来开发隔间化Ca2+释放性纳米纤维微包装。这些微包装随后与独自不可能形成机械稳定微装置的更具生物相容性的海藻酸盐水凝胶原位混合。包括单一细胞和细胞聚集物两者的若干不同类型的细胞的囊封和培养得以证明。多隔间微装置是特别引起关注的，因为它们可提供用于细胞共培养、迁移和旁分泌信号传导测定的新型可植入平台，所述测定已通常目前在体外TRANS WELLTM系统中进行研究。也使用初级胰岛，通过1型糖尿病模型来证明NHM的治疗潜力。更重要的是，这个囊封设计可应用于其它类型的细胞，特别是其中装置的耐久性、坚固性和可取回性由于对潜在畸胎瘤形成的担忧而绝对合乎需要的那些干细胞源性细胞。细胞可在控制细胞外基质和间隙的情况下以定制设计方式装载的事实使得NHM极其适用于递送具有一定增殖潜力的细胞。最后，NHM设计不限于任何聚合物或水凝胶。实际上，纳米纤维可由可释放消炎药物以缓和纤维化的可缓慢生物降解聚合物制得，而水凝胶可由超级可相容的化学改性海藻酸盐、光可交联聚乙二醇(图21A-D)或外来体应答抗性两性离子聚合物制得。在后述情况下，纳米纤维结构将再次起重要作用，不仅通过毛细管作用将前体溶液保持在适当位置以促进交联，而且也增强最终装置的机械性质。

[0208] 尽管本文已详细描绘和描述优选实施方案，但将为相关领域技术人员显而易知的是可在不脱离本发明的精神下进行各种修改、添加、取代等，并且因此，这些修改、添加、取代等被视为在本发明的如在随后权利要求中限定的范围内。