一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法

摘要

本发明公开了一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法。该方法采用组织苗的叶片作为愈伤诱导材料，采用MS培养基(2,4‑D 0.5mg/L)进行愈伤组织诱导，采用EM培养基(6‑BA 0.3mg/L)进行继代培养与促进不定芽的形成。采用本发明的配方和方法，白榆叶片愈伤形成率为100％；最终愈伤不定芽分化率为95％；最终愈伤不定芽分化率较前期研究结果提高20％至45％。

权利要求

1.一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，(1)外植体选择：耐盐碱速生白榆无性系愈伤组织诱导的外植体源于白榆工厂组培生根苗作为外植体；

(2)外植体处理：切取外植体第2-5片叶片；将叶片从叶柄处切下，保留叶柄，然后沿叶片边缘环割并保留叶柄至叶片中部2/5-3/5作为愈伤诱导材料，用于愈伤组织诱导；

(3)愈伤组织诱导：将切割完后获取的叶片材料及时接入MS培养基中培养，叶片横向平放于MS培养基表面；所述MS培养基还包括下述组分：2,4-D 0.5mg/L；

(4)愈伤组织继代培养与不定芽的形成：待叶片材料形成膨大的愈伤组织后，将愈伤组织转接入EM分化培养基中继代培养2-3周。

2.如权利要求1所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述MS培养基还包括辅料为：琼脂7g/L，蔗糖30g/L。

3.如权利要求1所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述EM培养基还包括下述组分：6-BA 0.3mg/L。

4.如权利要求3所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述EM培养基还包括辅料为：琼脂7g/L，蔗糖30g/L。

5.如权利要求1-4中任意一项所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述步骤1)的白榆工厂组培生根苗为：选取生长健壮、叶片舒展、组培苗株高＞2.5cm、生长一致的生根苗。

6.如权利要求1-4中任意一项所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述步骤2)保留叶柄至叶片中部1/2作为愈伤诱导材料。

7.如权利要求1-4中任意一项所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述步骤3)培养条件为：接种后置于白天26℃±2℃/夜间18℃±2℃、相对空气湿度90％±5％，黑暗环境培养3天；第4天起，每天光照12小时，光照强度2000-

3500勒克斯，温度：白天26℃±2℃/夜间18℃±2℃。

8.如权利要求7所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述步骤3)培养时间为1-2周。

9.如权利要求1-4中任意一项所述的一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，所述步骤4)继代培养条件为：培养温度为：白天或光照条件下26℃±2℃，夜间或黑暗条件下18℃±2℃，光照时间为每天12小时，环境湿度要求90％以上。

说明书

一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物愈伤诱导方法，特别涉及一种耐盐碱速生白榆无性系愈伤组织诱导及分化的方法。

背景技术

[0002] 白榆(Ulmus pumila L.)，为榆科(Ulmaceae)榆属(Ulmus)植物，变种较多。白榆作为我国主要的园林乡土观赏树种之一，对烟尘、二氧化硫和氟化氢等有毒气体抗性强，并且具有极高的环境适应性、抗污染、抗病虫、宜繁殖和较强的耐盐碱特性，使得白榆极有希望成为盐碱地区园林绿化骨干树种。

[0003] 木本植物在植物组织培养生产中的成功经验与案例相对草本植物较为罕见，适宜不同木本植物生长的基础培养基的匮乏导致木本植物难以大规模生产。前期对白榆无性外植体瓶内繁殖的研究取得了突破性成果，在一定程度上解决了工厂生产需要，但是由于白榆外植体取材要求严格，造成繁殖材料短缺，降低生产效率。因此，针对白榆的巨大开发价值，亟待发明一种利用白榆叶片或植株组织细胞进行大量繁殖的方法。

[0004] 目前白榆可以用的愈伤诱导培养方法有王静华(MS+TDZ0.005mg/L+IAA0.005mg/L)，孙震(MS+KT0.5mg/L+NAA0.1mg/L)，李雯(愈伤诱导培养基MS+TDZ0.1mg/L+IBA0.2mg/L；分化培养基TDZ0.2mg/L+IBA0.05mg/L)等的诱导培养方法。上述培养基的愈伤组织诱导率较高(89％-100％)，但总体愈伤组织不定芽分化率较低(50％-76％)，造成白榆工厂化生产的高成本及资源浪费。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于为耐盐碱速生白榆提供一个适宜工厂化生产的愈伤诱导及分化方法。该方法采用组培苗的叶片作为愈伤诱导材料，采用MS培养基(2,4-D 0.5mg/L)进行愈伤组织诱导，采用EM培养基(6-BA 0.3mg/L)进行继代培养与促进不定芽的形成，使愈伤组织出愈率达100％，不定芽再生率达95％。采用该愈伤诱导方法提高了白榆工厂化生产的效率，且白榆长势旺盛，降低生产成本，提高经济效益。

[0006] 本发明的技术方案是：一种耐盐碱速生白榆无性系叶片愈伤组织诱导及分化方法，其特征是，

[0007] (1)外植体选择：耐盐碱速生白榆无性系愈伤组织诱导的外植体源于白榆工厂组培生根苗，即选取生长健壮、叶片舒展、组培苗株高＞2.5cm、生长一致的生根苗作为外植体；

[0008] (2)外植体处理：切取外植体第2-5片(由上到下)叶片；将叶片从叶柄处切下(保留叶柄)，然后沿叶片边缘环割并保留叶柄至叶片中部2/5-3/5(优选1/2)叶片(图1右)作为愈伤诱导材料，用于愈伤组织诱导；

[0009] (3)愈伤组织诱导：将切割完后获取的叶片及时接入MS培养基中，叶片横向平放于MS培养基表面；接种后置于白天26℃(±2℃)/夜间18℃(±2℃)、相对空气湿度90％(±5％)黑暗环境培养3天；第4天起，每天光照12小时，光照强度2000—3500勒克斯，温度白天
26℃(±2℃)/夜间18℃(±2℃)。

[0010] (4)愈伤组织继代培养与不定芽的形成：叶片材料形成膨大的愈伤组织后(1-2周)，将愈伤组织转接入EM分化培养基(每两周转接一次)；继代培养一周后，部分愈伤组织开始分化成不定芽；继代培养2-3周后，愈伤组织分化率可达95％。

[0011] 继代培养条件为：培养温度为白天(或光照条件下)26℃±2℃，夜间(或黑暗条件下)18℃±2℃，光照时间为每天12小时，湿度90％以上。

[0012] 进一步地，MS培养基还包括下述组分：2,4-D(氯苯氧乙酸)0.5mg/L。

[0013] 进一步地，MS培养基还包括辅料为：琼脂7g/L，蔗糖30g/L。

[0014] 进一步地，EM培养基还包括下述组分：6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.3mg/L。

[0015] 进一步地，EM培养基还包括辅料为：琼脂7g/L，蔗糖30g/L。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] 1)与现有方法相比，本发明采用了MS培养基和EM培养基两种培养基，二者相互配合使用，协同作用促进不定芽再生(见表3)。本发明采用MS培养基(2,4-D 0.5mg/L)处理，白榆愈伤组织诱导率达100％；然后再采用EM培养基(6-BA 0.3mg/L)处理，不定芽再生率达95％。相比采用单个MS培养基，不定芽分化率提高20-45％左右，愈伤组织诱导率也有提高。

[0018] 2)从表2可以看出：在添加不同激素的MS培养基下，采用叶片作为愈伤诱导材料，其诱导分化率明显低于茎段(茎段更容易形成愈伤)。而本发明采用MS培养基(2,4-D 0.5mg/L)培养叶片材料后不仅诱导率达到了100％，且相比采用茎段作为材料，不定芽再生率提高10％。本发明采用叶片作为愈伤诱导材料，扩大了愈伤诱导材料的选取范围，且材料的获取简单易得，更适合工厂化生产。

[0019] 3)经实验证明，采用该高效愈伤诱导方法解决了白榆工厂化生产需要，且再生芽长势旺盛，大幅提高生产效率，增加经济效益。

附图说明

[0020] 图1为白榆愈伤诱导材料示意图，框内区域分别为茎段(左)，叶片(右)愈伤诱导材料。

[0021] 图2为叶片材料愈伤组织生长状况示意图；图2-A为叶片材料接种一周后生长情况，边缘形成膨大透明组织；图2-B为致密的愈伤组织(经继代培养可形成不定芽)；图2-C为海绵状愈伤组织(经继代培养较难形成不定芽)。

[0022] 图3为茎段材料愈伤组织生长状况示意图；图3-A为茎段材料接种一周后生长情况，边缘形成膨大透明组织；图3-B为致密的愈伤组织(经继代培养可形成不定芽)；图3-C为疏松的愈伤组织(经继代培养较难形成不定芽)。

[0023] 图4为叶片、茎段材料愈伤组织继代培养与不定芽的再生示意图；图4-A为叶片材料形成的愈伤组织；图4-B为茎段材料形成的愈伤组织；图4-C为叶片材料经继代培养一周后，愈伤组织开始形成不定芽；图4-D为叶片材料经继代培养三周后，大部分(95％)愈伤组织分化形成不定芽。具体实施方案

[0024] 为了充分表现本项发明的创新性、实用性、高效性等特点，下面进一步详细阐述本发明。

[0025] 实施例1

[0026] (1)外植体选择：耐盐碱速生白榆无性系愈伤组织诱导外植体源于白榆工厂组培生根苗，即选取生长健壮、叶片舒展、组培苗株高＞2.5cm、生长一致的生根苗叶片(含叶柄)或茎段作为愈伤诱导材料。

[0027] (2)外植体处理：按照图1(左)所示区域切割，切取组培苗由上到下第2片叶片与第5片叶片之间的生长健壮的茎段。切割时去掉带有腋芽节的部位，只取节间部位作为试验材料，切割长度约0.3-0.4cm。切取后及时将茎段接入培养基中，茎段横向平放于培养基表面，每瓶(直径6.5cm；高9.5cm)培养基(20-30ml)接种5个茎段材料，重复4次。切取组培苗第2片叶片与第5片(由上到下)叶片之间的叶片。将叶片从叶柄处切下(保留叶柄)，然后沿叶片边缘环割并保留叶柄至叶片中部的1/2叶片(图1右)，切割完后获取的叶片及时接入MS培养基中，叶片横向平放于培养基表面，每瓶培养基接种5个叶片材料，重复4次。

[0028] 生长环境为：白天26℃(±2℃)/夜间18℃(±2℃)，相对空气湿度90％黑暗环境培养3天。第4天起，每天光照12小时，光照强度2000—3500勒克斯，温度白天26℃(±2℃)/夜间18℃(±2℃)。

[0029] 培养基：

[0030] MS培养基，包括以下含量的各种组分：CaCl2·2H2O 440mg/L，KH2PO4 170mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，CuSO4·5H2O 0.025mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·H2O 22.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L，ZnSO4·
7H2O 8.6mg/L，KI 0.83mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2EDTA·2H2O 37.3mg/L，myo-Inositol(肌醇)100mg/L，Glycine(甘氨酸)2mg/L，Nicotinic acid(烟酸)0.5mg/L，Pyridoxine HCl V6(盐酸吡哆醇)0.5mg/L，Thiamine HCl V1(盐酸硫铵素)0.1mg/L。

[0031] EM培养基，包括以下含量的各种组分：CaCl2·2H2O 441mg/L，NH4NO3 1600mg/L，KNO32022mg/L，MgSO4 3361mg/L，NaH2PO4·2H2O 312mg/L，K2SO4 350mg/L，Na2SO4 300mg/L，CaCl2 230mg/L，CoCl2·6H2O 0.24mg/L，CuSO4·5H2O 0.375mg/L，H3BO3 9.3mg/L，MnSO4·H2O16.9mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，ZnSO4·7H2O 11.5mg/L，KI 0.83mg/L，FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2EDTA·2H2O 37.25mg/L，myo-Inositol(肌醇)108mg/L，Glycine(甘氨酸)
3.75mg/L，Nicotinic acid(烟酸)5mg/L，Pyridoxine HCl V6(盐酸吡哆醇)1.2mg/L，Thiamine HCl V1(盐酸硫铵素)13.5mg/L，Biotin(生物素)0.2mg/L，Folic acid(叶酸)
0.88mg/L，Ascorbic acid(维生素C)1.76mg/L，Lactoflavin(核黄素)1.9mg/L。

[0032] 配制条件：试验用1mol/L的NaOH及HCl调节培养基pH值至5.9(灭菌前)，并在1212
℃、1.1Kg/cm(0.11MPa)灭菌14min。

[0033] 为了对比现有白榆愈伤诱导方法以及不同辅料、激素以及营养元素处理和本发明的差别，本发明采用不同含量蔗糖(S)、激素(NAA萘乙酸，2,4-D氯苯氧乙酸，BA6-苄氨基腺嘌呤)以及MS大量元素三大因素，共组合设计22组愈伤诱导培养基(详见表1)进行比较分析试验。每个配方重复8瓶，茎段和叶片每个配方各接种四瓶，每瓶接种5个试验材料。从外植体(叶片或茎段)接入愈伤诱导培养基起，至愈伤组织形成转入分化(EM具体成分见上)培养基，进行不定芽的诱导。

[0034] 表1白榆愈伤诱导培养基配方表

[0035]

[0036]

[0037] 实验处理结果：

[0038] 第一周期，愈伤组织诱导：从外植体(叶片或茎段)放入培养基起(一周后生长情况如图2-A或图3-A所示)，至愈伤组织形成转入分化培养基，根据白榆愈伤组织的生长状况，将愈伤形成状态分为四类：①优——茎段整体膨大形成愈伤，叶片和叶柄均出愈伤，愈伤形态佳，为a(图2-B；图3-B)；②良——相同时间处理后茎段刚刚开始膨大或形成愈伤相对较小以及叶片中只有叶柄出愈伤，为b；③中——茎段仅两端膨大，叶片中脉膨大，为c；④差——茎段、叶片未有明显愈伤，以及叶片、茎段愈伤颜色暗褐色且膨大海绵状(图2-C)或较小松散(图3-C)，为d。不同部位材料愈伤形成率及愈伤形态状况详见(表2)。

[0039] 表2白榆愈伤组织形成率及生长状况评价

[0040]

[0041]

[0042] 注：空白表示没有愈伤组织的形成

[0043] 由表2可以看出，叶片组织在S35、S36培养基处理条件下愈伤分化率达100％，且愈伤组织生长较好；茎段组织在S25、S26、S28至S36培养基处理条件下分化率达100％，且愈伤组织生长较好。

[0044] 第二周期，愈伤组织继代培养及不定芽分化(即有效愈伤组织的诱导，图4)：将第一阶段诱导形成的愈伤组织转接至分化培养基(EM+0.3BA+3％S)进行愈伤组织的继代培养。有效的愈伤组织经过2-3周继代培养，进而分化形成不定芽。不同激素处理条件下叶片、茎段组织有效愈伤分化率详见(表3)。

[0045] 表3叶片、茎段愈伤组织不定芽分化率

[0046]

[0047]

[0048] 注：最终不定芽分化率＝不定芽分化率×愈伤诱导率

[0049] 由表3可以看出，S35培养基诱导的获得的叶片愈伤组织具有较高的再生能力，不定芽再生率达95％；S36培养基处理条件下叶片、茎段愈伤组织再生能力次之，不定芽分化率均为90％。从不定芽再生率及减少2,4-D的添加量角度，采用S35更适合工业化生产。

[0050] 通过上述两个实验结果的分析与处理，可以明显看出，耐盐碱速生白榆无性系叶片在MS+2,4-D0.5+3％S培养基处理条件下愈伤组织诱导形成率达100％；且不定芽分化率(有效愈伤)高达95％。不定芽分化率相比之前方法提高20％至45％左右。在生产过程中，此方法在提高生产白榆生产数量的前提下降低了生产成本，在规模化生产中，带来了更高的经济效益。

[0051] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。