腊梅属植物抗伪狂犬病毒的用途

摘要

本发明公开了腊梅属植物抗伪狂犬病毒的用途，具体涉及腊梅属植物及其提取物在预防/治疗由伪狂犬病毒引起相关疾病的应用，所述的蜡梅属包括柳叶蜡梅、浙江蜡梅或山腊梅；所述的提取物包括水提、醇提、水蒸气蒸馏和超临界提取。

权利要求

1.一种腊梅属植物提取物在制备抗伪狂犬病毒的药物中的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤：原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得；

所述的腊梅属植物选自柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅；

所述的腊梅属植物药用部位选自腊梅属植物的叶；

所述的溶剂选自水、无水乙醇、乙醇水溶液。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的溶剂选自60％-80％的乙醇水溶液。

3.根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述的溶剂用量是原药材用量的2-

30倍。

4.根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述溶剂提取步骤的温度是室温到溶剂回流的温度。

5.根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取次数是1～5次。

6.根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述溶剂提取步骤的提取时间是每次0.5～5小时。

7.根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述滤液浓缩的温度是55～90℃。

8.根据权利要求1-2中任一项的应用，其特征在于，所述滤液浓缩后稠膏的相对密度为

1.1～1.5。

9.一种腊梅属植物提取物在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备包括如下步骤：原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油；

所述的腊梅属植物选自柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅；

所述的腊梅属植物药用部位选自腊梅属植物的叶。

10.一种腊梅属植物提取物在制备抗伪狂犬病毒药物中的应用，其特征在于，所述的腊梅属植物提取物的制备是原药材腊梅属植物经超临界二氧化碳提取并获得，提取的条件选自如下任意一种或多种：(1)不加夹带剂的提取物；

(2)加夹带剂的提取物；

(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物所述的腊梅属植物选自柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅；

所述的腊梅属植物药用部位选自腊梅属植物的叶。

11.根据权利要求10的应用，其特征在于，所述提取物进行超临界二氧化碳提取时的条件选自如下(1)-(4)中的任意一项或多项：(1)萃取温度为30-70℃；

(2)萃取压力为10-40Mpa；

(3)分离温度为25-70℃；

(4)分离压力为2-17Mpa。

12.根据权利要求11的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：(1)萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升；

(2)萃取时间为：30-400分钟。

13.根据权利要求11-12中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括使用夹带剂。

14.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇、乙酸乙酯、丙酮中至少一种。

15.根据权利要求14的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自75％-95％V/V的乙醇水溶液。

16.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述夹带剂的量以每公斤药材计为0.10-

2.5L/Kg。

17.根据权利要求14-15中任一项的应用，其特征在于，所述夹带剂的量以每公斤药材计为0.10-2.5L/Kg。

18.根据权利要求11-12中任一项的应用，其特征在于，分离釜I压力和温度：

分离釜I的温度为30-70℃，分离釜I的压力为4-17Mpa；

分离釜II压力和温度：

分离釜II的温度为25-50℃，分离釜II的压力为2-8Mpa。

19.根据权利要求11-12中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

1)是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，

2)萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，

3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，

4)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa；

5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，

6)从分离釜中得到提取物。

20.根据权利要求11-12中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

1)对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜；

2)萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa,加入夹带剂；

3)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，

4)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，

5)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；

6)从分离釜中得到提取物。

21.根据权利要求11-12中任一项的应用，其特征在于，所述超临界二氧化碳提取时的条件还包括如下：

1)是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，

2)原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，

3)分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，

4)分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；

5)二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；

6)放出分离釜中的提取物；

7)再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-125L/H·Kg，再萃取90-

300分钟；

8)从分离釜中再次得到提取物。

22.根据权利要求20-21中任一项的应用，其特征在于，所述的夹带剂选自0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇、乙酸乙酯、丙酮中至少一种。

说明书

腊梅属植物抗伪狂犬病毒的用途

技术领域

[0001] 本发明具体涉及腊梅属植物及其提取物在制备针对伪狂犬病毒的药物的应用，所述的腊梅属植物包括柳叶腊梅、浙江腊梅和山腊梅，属于制药技术领域。

背景技术

[0002] 1.腊梅柳叶腊梅、山腊梅和浙江腊梅同属蜡梅科腊梅属植物，我国特产，主要分布于我国亚热带季风湿润气候区域的鄂、湘、川、渝、贵、豫、浙、赣、皖等省。

[0003] 蜡梅属柳叶蜡梅(Chimonanthussalicifolius S.Y.Hu)、浙江蜡梅(Chimonanthus zhejiangensis M.C.Liu)或山腊梅(Chimonanthus nitens Oliv.)等为畲族民间习用药,从北宋年间起其干燥叶就作为服用的食凉茶，近千年来用于治疗和预防感冒。现代研究又有进展，其中，山腊梅提取物制备的颗粒制剂，有良好治疗/预防感冒功效，已在市场销售；柳叶蜡梅和浙江腊梅已载入2005和2015年的《浙江省中药炮制规范》，主要成分为挥发油，含有1.8-桉叶素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、榄香醇等40多种成分。传统用途：性味微苦，辛，凉，归肺、脾、胃经，用于治疗感受风寒而引起肚胀、肚痛腹泻，因饮食不当引起的消化不良、腹部胀痛和小儿疳积等症状。

[0004] 浙江腊梅为腊梅科腊梅属常绿灌木，产于浙江。群体遗传学研究发现浙江腊梅和山腊梅相对近缘，山腊梅在湖南、福建、广西贵州等地均有分布，而浙江腊梅未见分布，浙江腊梅仅分布于浙江龙泉，因此，结合形态、分子及地理分布特征，我们认为浙江蜡梅是山蜡梅分布区的最东边界的一个群体，可能只是山蜡梅的一种生态型(ecotype)，而不是独立的分类单位。

[0005] 山腊梅(Chimonanthus nitens)为常绿灌木，又称之为毛山茶、岩马桑(《新华本草纲要》)、亮叶腊梅(《经济植物手册》)、香风茶(《安徽中草药》)、野腊梅(《云南中药资源名录》)。产于安徽、浙江、江苏、江西、福建、湖北、湖南、广西、云南、贵州和陕西等省区。民间使用历史悠久，具有防治感冒、痰喘、咳嗽、慢性支气管炎、细菌感染、发热疼痛、炎症、蚊虫叮咬及高血压、高血脂等作用，亦有抗肿瘤、防治心脑血管疾病、改善微循环和抗衰老、抗氧化等作用，另外还具有调节人体机能、增强体质、提高机体免疫力、减少体脂、减肥等保健功能。该植物主产于江西德兴大茅山区、婺源怀玉山区、安徽徽州齐云山一带，在浙江、福建、陕西等省亦有分布，资源较丰富。山腊梅挥发油中主要成分是烯烃、醇类和烷酸类物质，分别为脱氢香橙烯、△-杜松烯、E-环氧金合欢烯、石竹烯、(-)-氧化石竹烯、α-杜松醇(7.08％)、(+)-匙叶桉油烯醇、杉木醇、十六烷酸。榄香烯等倍半萜类合物具有较好的抗肿瘤活性，黄酮类成分具有防治心脑血管疾病、改善微循环和抗衰老等多种功效。山腊梅药片的温热蒸发物可抑制病毒，山腊梅挥发油可抑制和杀灭病毒。

[0006] 1982年，《江西省药品标准》就记载了“山腊梅片”和“山腊梅冲剂”，作为防治感冒和流行性感冒制剂在临床上应用，市售良好。与山腊梅同属的柳叶蜡梅和浙江腊梅虽在民间使用普遍，但在市场上还未有适合的制剂。

[0007] 药理研究中柳叶蜡梅未见抗伪狂犬病毒的研究文献报道。CO2超临界萃取技术具有低温、快速、效率高、无污染、提取物纯度高、易分离等优点，适用于挥发油的提取。贺建云采用超临界CO2萃取小试设备，不加夹带剂提取柳叶蜡梅中物质，总收率为3.68％，但未见超临界二氧化碳萃取柳叶蜡梅物质的应用报道。

[0008] 本发明在已有研究的基础上，采用新的未见报道的提取方案，优化已有制备柳叶腊梅提取物的工艺条件、参数以及研究柳叶腊梅新提取物的新用途；研究适合柳叶蜡梅提取物的软胶囊、滴丸等制剂；为柳叶蜡梅提取物用于感染伪狂犬病毒的杀灭、治疗和预防，提供有益支持。

[0009] 2.伪狂犬病

[0010] 伪狂犬病(Porcine Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病。发热、奇痒、脑脊髓炎是主要的发病症状。成年猪主要表现为隐形感染，妊娠母猪感染后主要表现为流产、死胎和呼吸系统疾病症状，无奇痒。新生猪仔感染后除了出现神经症状外还可侵害消化系统。本病呈世界性分布。猪是该病毒的主要宿主、长期储存者和排毒者，也是重要的病毒传播者。猪伪狂犬病毒给猪养殖业造成的损害仅次于猪瘟，每年会有数十亿美元的经济损失。

[0011] 1960年以后该病已遍及全世界50多个国家。我国目前有20多个省市发现了该病，并且呈现不断蔓延扩大的趋势。目前针对该病没有特效药，只能用疫苗进行预防，一旦该病在集约化猪场开始流行将会对猪养殖业造成重大经济损害。另外，伪狂犬病毒也会感染鸡、猫、狗、牛等动物，而现有疫苗只对猪感染有预防作用，所以，开发针对该病的有效药迫切而急需。

[0012] 本发明中的腊梅提取物，不仅可以直接体外杀灭伪狂犬病毒，也可阻断该病毒侵染细胞和抑制病毒在细胞中复制扩增，其中杀灭率可达99％以上，阻断率和抑制率接近50％，具有潜在的开发为伪狂犬病毒消毒剂和体内用药制剂的价值。

发明内容

[0013] 发明概述

[0014] 本发明要解决的技术问题是提供一种新的抗伪狂犬病毒的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备抗伪狂犬病毒的药物中的应用。

[0015] 所述的腊梅科腊梅属植物包括：柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅。

[0016] 在本发明的具体实施方案中，所述的提取物为以下一种或多种：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳萃取。

[0017] 本发明第二方面提供了上述腊梅属植物提取物的制备方法。

[0018] 本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的口服制剂。

[0019] 本发明第四方面公开了浙江腊梅提取物用于(1)治疗家畜、家禽和伴侣动物、野生动物、鸟类的细菌与病毒等微生物感染的疾病；(2)畜牧饲料与添加剂；(3)消杀剂。

[0020] 发明详述

[0021] 本发明第一方面提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备抗伪狂犬病毒的药物中的应用。

[0022] 本发明中所述的药材或原药材是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。本发明中所述的生药也是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。

[0023] 本发明的腊梅属植物包括腊梅属植物的鲜品或干品；腊梅属植物的药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合；优选的药用部位选自腊梅属植物的地上部分、茎、茎皮、叶或任意组合；更优选的药用部位选自腊梅属植物的茎或叶；最优选的药用部位选自腊梅属植物的叶。

[0024] 本发明的第二方面提供了腊梅属植物提取物的制备方法。

[0025] 在本发明的具体实施方案中，所述的腊梅属植物提取物为以下用水提、醇提、水蒸气蒸馏及超临界二氧化碳提取一种或多种：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳提取物。

[0026] 为了加快提取速度，提高提取收率，可以对腊梅属原药材进行粉碎，粉碎后的平均粒径优选10-80目，更优先是20-65目，最优选是30-50目。

[0027] 本发明提供的提取物的第一种制备方法：

[0028] 所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。

[0029] 所述的溶剂：本领域常用的溶剂均可以用于本发明。优选溶剂水和C1-C5的醇类。C1-C5的醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。选自水、

[0030] 无水乙醇、乙醇水溶液；更优选溶剂选自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶剂相比，具有低毒，防腐，污染小，价格低等优点，更适合于本发明应用于医药产品工业化大生产。

[0031] 乙醇水溶液的浓度(乙醇水溶液中含有的乙醇的体积百分比)：优选30％-100％的乙醇水溶液，更优选50％-95％的乙醇水溶液，进一步优选优选60％-80％的乙醇水溶液，最优选75％的乙醇水溶液。

[0032] 溶剂的量是指提取每公斤原药材所用的溶剂量，即提取每公斤药材计使用溶剂的重量(单位Kg)或体积(单位L)。溶剂用量是原药材用量的2-30倍；更优选5-16倍；进一步优选6-15倍；最优选8-10倍。

[0033] 提取的温度：优选是室温到溶剂回流的温度；更优选是40℃-溶剂回流的温度；进一步优选是50℃-溶剂回流的温度；最优选是溶剂回流的温度。

[0034] 提取的次数：可以是1～5次；优选是2～3次。

[0035] 提取的时间：每次0.5～5小时；优选每次0.5～3小时；更优选每次1～3小时。

[0036] 浓缩的温度：可以是55～90℃；优选62～80℃；更优选65～75℃。

[0037] 浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5，优选1.2～1.4。

[0038] 在本发明的一个具体实施方案中，所述的提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经水提取并获得。

[0039] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的水提取并获得。

[0040] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-16倍的水提取并获得。

[0041] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-16倍的水提取并获得。

[0042] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经乙醇提取并获得。

[0043] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。

[0044] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。

[0045] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取并获得。

[0046] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。

[0047] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。

[0048] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。

[0049] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。

[0050] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。

[0051] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。

[0052] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并浓缩滤液，干燥获得。

[0053] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，经浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。

[0054] 在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，60～90℃(包括65～75℃)浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。

[0055] 本发明提供的提取物的第二种制备方法：所述提取物是原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。

[0056] 本发明提供的提取物的第三种制备方法：所述提取物是原药材经超临界二氧化碳提取并获得。

[0057] 本发明的超临界提取物，其特征在于，所述提取物是原药材腊梅属植物经二氧化碳超临界提取，在分离釜中获得提取物，提取的条件可以是一种或多种，例如：

[0058] (1)不加夹带剂的提取物；

[0059] (2)加夹带剂的提取物；

[0060] (3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。

[0061] 超临界二氧化碳提取的条件如下：

[0062] 萃取釜:

[0063] 萃取温度为30-70℃；优选为35-60℃；更优选为40-50℃；最优选43-47℃。萃取温度可以选自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。

[0064] 萃取压力为10-40Mpa；优选为13-35Mpa；优选为16-24Mpa；更优选为18-22Mpa。萃取压力可以选自15Mpa，20Mpa，20.6Mpa，29.6Mpa，30Mpa。

[0065] 萃取釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个萃取釜的，可以是并联或串联。为了尽量节约原药材的加料和卸料时间，提高生产效率，优选是多个萃取釜并联。在一部分萃取釜加料或卸料的时候，另外的萃取釜同事进行萃取。

[0066] 萃取剂流速：

[0067] 萃取剂二氧化碳的流速会对本发明的生产效率产生重大的影响。如果二氧化碳的流速过快，二氧化碳和萃取溶质不能充分接触，会降低每体积二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速过慢，会降低单位时间的生产效率。因此，萃取剂二氧化碳的流速需要一个合适的流速。

[0068] 萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升(以每公斤药材每小时计，单位为L/H·Kg生药)，即20-150L/H·Kg；优选的萃取剂二氧化碳的流速为23-125L/H·Kg；更优选为33-80L/H·Kg；进一步优选为50-70L/H·Kg；最优选为55-65L/H·Kg。

[0069] 萃取剂二氧化碳的流速可以选自23.1L/H·Kg；23.8L/H·Kg；28.5L/H·Kg；32.3L/H·Kg；32.8L/H·Kg；36.2L/H·Kg；38.3L/H·Kg；35.3L/H·Kg；44.8L/H·Kg；
50.7L/H·Kg；55.4L/H·Kg；75.6L/H·Kg；82.2L/H·Kg。

[0070] 萃取时间分钟(min)：30-400min，优选120-160min，更优选120-160min，最优选120-160min。萃取时间可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，
140-150min，155-165min。例如萃取时间可以是62min，70min，83min，100min，120min，
132min，145min，160min。

[0071] 夹带剂:

[0072] 本发明的超临界提取方案中，可以选择性的使用夹带剂或不使用夹带剂；优先是使用夹带剂。

[0073] 本领域常用的溶剂均可以作为本发明的夹带剂。例如本发明的夹带剂可以选自：0％-100％V/V的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。本文中
100％V/V的乙醇水溶液表示无水乙醇；本文中0％V/V的乙醇水溶液表示没有醇的水。例如本发明的夹带剂可以选自：水、无水乙醇、30％-100％V/V的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。优选的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％V/V的乙醇水溶液。更优选的夹带剂选自75％-
95％V/V的乙醇水溶液。最优选的夹带剂选自95％V/V的乙醇水溶液。

[0074] 夹带剂的量(以每公斤药材计为L/Kg，Kg/Kg；或以每克药材计为ml/g，g/g)：

[0075] 夹带剂的量为0.10-2.5L/Kg；；优选0.20-1.5L/Kg；，更优选0.30-0.80L/Kg；最优选0.40-0.60L/Kg；

[0076] 分离釜：

[0077] 分离釜的温度为25-70℃，优选为30-60℃；更优选为35-55℃，最优选为40-50℃，。

[0078] 分离釜的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。

[0079] 分离釜的压力为2-17Mpa；优选为3-15Mpa；更优选为4-12Mpa；最优选为4.5-10Mpa。

[0080] 分离釜的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，5.5Mpa，5.6Mpa，5.7Mpa，5.8Mpa，6Mpa，7Mpa，8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。

[0081] 分离釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个分离釜的，可以是并联或串联，为了尽量提高提取物的回收率，优选是多个分离釜串联。

[0082] 分离釜I压力和温度：

[0083] 分离釜I的温度为30-70℃，优选为50-60℃；更优选为53-57℃；最优选为55℃。分离釜I的温度可以选自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。

[0084] 分离釜I的压力为4-17Mpa；优选为5-15Mpa；更优选为6-12Mpa；最优选为8-10Mpa。分离釜I的压力可以选自8Mpa，8.5Mpa，9Mpa，9.5Mpa，10Mpa。

[0085] 分离釜II压力和温度：

[0086] 分离釜II的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜II的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。

[0087] 分离釜II的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜II的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，
5.5Mpa。

[0088] 分离釜III压力和温度：

[0089] 分离釜III的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜III的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。

[0090] 分离釜III的压力为2-8Mpa；优选为3-7Mpa；更优选为4-6Mpa；最优选为4.5-5.5Mpa。分离釜III的压力可以选自4.65Mpa，4.9Mpa，5.1Mpa，5.2Mpa，5.3Mpa，5.4Mpa，
5.5Mpa。

[0091] 分离釜中的得到的提取物，就是本发明的腊梅属植物提取物。

[0092] 在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa，分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。

[0093] 在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa,加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。

[0094] 所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。

[0095] 在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15Mpa-40Mpa，分离釜I的温度为50℃-60℃，压力为7.5Mpa-9Mpa，分离釜II的温度为35℃-45℃，压力为4.8Mpa-6Mpa；二氧化碳气体通过萃取釜的流量为23-125L/H·Kg生药，萃取时间为90-300分钟；放出分离釜中的提取物；再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为23-
125L/H·Kg生药，再萃取90-300分钟；分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。

[0096] 所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。

[0097] 本领域常用的干燥均可以用于本发明，例如：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、热风干燥、远红外线干燥或微波干燥。或联合使用上述一种或多种干燥方式。

[0098] 本发明提供的提取物的第四种制备方法：所述提取物是原药材经二氧化碳超临界提取后，其剩余的药材再加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。具体的提取方法可以第一种方式相同。

[0099] 在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸渍，或者超临界状态下的提取，或者在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。

[0100] 如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明任何目的的任何纯度的提取物，提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。

[0101] 本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的口服制剂。

[0102] 本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂为柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅的提取物制剂。

[0103] 本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂的组合物还包含一种或多种无毒生理学可接受的载体。所述的可接受的载体包括本领域公知的任何辅料及起控释作用的辅料。常用的辅料包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、致孔剂、增塑剂、填充剂、增溶剂和乳化剂。稀释剂可以是但不限于淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是但不限于水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是但不限于滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇；增溶剂和乳化剂可以是但不限于乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。起缓控释作用的辅料可以选自亲水性凝胶材料、蜡脂类材料和不溶性材料的一种或多种。所述的亲水性凝胶材料可以选自羟丙基甲基纤维素、卡波普、羧甲基纤维素钠和海藻酸盐，所述的蜡脂类材料可以选自十六醇、十八醇、蜂蜡、山嵛酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕榈蜡，所述的不溶性材料可以选自乙基纤维素、丙烯酸树脂、聚氧乙烯和聚乙烯。

[0104] 此外，如需要，可向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

[0105] 本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂包含柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅的提取物和药学上可接受的载体制成的制剂。可通过将组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。该制剂可根据本领域公知的方法制备。

[0106] 本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂优选喷雾剂、口服制剂、畜牧用药。

[0107] 本发明第四方面公开了浙江腊梅提取物用于(1)治疗家畜、家禽和伴侣动物、野生动物、鸟类的细菌与病毒等微生物感染的疾病；(2)畜牧饲料与添加剂；(3)消杀剂。

[0108] 有益技术效果

[0109] 目前，伪狂犬病遍及全世界50多个国家，在我国有20多个省市发现该病，且仍在不断蔓延扩大，更为严重的是伪狂犬病尚无有效药。本发明提供了制备直接杀灭伪狂犬病毒的药物和制备预防和/或治疗伪狂犬病毒感染的药物的提取物，为伪狂犬病毒的杀灭和伪狂犬病的预防和治疗药物的开发提供了潜在的可能性。

[0110] 在本发明的研究过程中发现三个品种腊梅柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅的水提、醇提、挥发油和超临界样品对伪狂犬病毒均有不同程度的杀灭、阻断和抑制作用。其中，对病毒的直接杀灭作用尤为显著，杀灭率均大于50％，对病毒的抑制效果也较佳，抑制率接近50％，对病毒亦有明显阻断作用。

具体实施方式

[0111] 提取物制备实施例

[0112] 实施例1-4

[0113] 取粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加水回流提取。第一次加10-16倍水，提取1小时后过滤，第二次加水8-12倍，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩或水浴锅上浓缩，水浴75℃、转速80rpm,浓缩至比重为1.18－1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。柳叶蜡梅的水提物编号LYS，浙江腊梅的水提物编号ZYS，山腊梅的水提物编号SYS。

[0114]序号 方法 品名 药材重(g) 一次 二次 浸膏(g) 收率(％) 样品编号
实施例1 水提 柳叶蜡梅 600 13倍水 10倍水 140 23 LYS(140601)
实施例2 水提 柳叶蜡梅 1000 16倍水 16倍水 206 20 LYS(140607)
实施例3 水提 山腊梅 330 10倍水 8倍水 89.6 27.15 SYS(161217)
实施例4 水提 浙江腊梅 370 10倍水 8倍水 117 31.6 ZYS(161218)

[0115] 实施例5-7

[0116] 醇提：取柳叶腊梅干燥老叶粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加乙醇回流提取。第一次加10倍乙醇，提取1小时后过滤，第二次加乙醇8倍，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩，水浴65℃、转速80rpm，浓缩至比重为1.18－1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。

[0117]序号 方法 品名 药材重(g) 一次 二次 浸膏(g) 收率(％) 样品编号
实施例5 醇提 柳叶蜡梅 600 13倍70％醇提 10倍70％醇提 148 25 LYC(140602)
实施例6 醇提 山腊梅 250 10倍70％乙醇 8倍70％乙醇 71.8 28.7 SYC(161225)
实施例7 醇提 浙江腊梅 300 10倍70％乙醇 8倍70％乙醇 92 30.6 ZYC(16112)

[0118] 实施例8-11

[0119] 称取适量已粉碎的药材，装入5-20倍水提时，装好挥发油提取器，待油产生后收集。

[0120]序号 方法 品名 药材重/g 加水量 挥发油 收率/％ 样品编号
实施例8 水蒸馏 柳叶蜡梅 600 10倍水 40ml 3.6 LYY
实施例9 水蒸馏 柳叶蜡梅 1000 8倍水 26.8g 2.68 LYY
实施例10 水蒸馏 浙江腊梅 1130 8倍水 26.6g 2.33 ZYY(161030)
实施例11 水蒸馏 山腊梅 1000 8倍水 13g 1.3 SYY(161030)

[0121] 实施例12

[0122] 开启电热控制系统和制冷系统。称取6.4kg柳叶蜡梅叶子，置于24L萃取釜中。称取3.2kg95％乙醇，放置于副泵的储箱中，开启副泵(R＝9.1r/min),60min内加夹带剂结束。萃取釜II、分离釜I、分离釜II、分离釜III的压力分别为20.7MPa、8.5MPa、5MPa、5MPa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速R＝30.5r/min，二氧化碳流速为220-240L/h。

[0123] 从分离釜I和分离釜II出料口收集产物，基本无产物时停止实验，用时135min。后处理：分离I得到固体1.3g，编号LYLJ-1(2-6)；抽滤分离II收集产品，抽滤得膏状物13g，编号LYLJ-2-B(2-6)；滤液70℃旋转蒸发得187.4g黑色油状物，编号LYLJ-2-Y(2-6)，总收率3.15％。

附图说明

[0124] 图1PRV对Vero细胞的毒力测定形态学观察结果A：正常细胞；B：PRV感染细胞[0125] 图1显示正常Vero细胞呈梭形和扁平不规则形状，细胞间紧密相连，层次感强。不同稀释度的PRV病毒液液接种于Vero细胞后，低稀释度的病毒孔细胞第二天出现病变，之后逐渐明显，表现为细胞变圆突起、膨胀、体积变大、折光性增强、开始皱缩并逐渐脱落。

[0126] 图2 8种中药提取物对Vero细胞增殖的影响

[0127] 图2显示，LYC、LYS、ZYS、ZYY、SYS、SYY、LYY、LYLJ-2-Y(2-6)对Vero细胞的最大无毒浓度分别是0.625ug/ml、1.25ug/ml、25ug/ml、100ug/ml、1.25ug/ml、2.5ug/ml、200ug/ml、a b c5ug/ml。(P<0.01,P<0.01and  P<0.01vs 0μg/ml)

[0128] 图3LYY和LYLJ对PRV吸附细胞阻断作用的形态学观察结果

[0129] 图3显示，显微镜形态学观察发现，与正常细胞对照组相比，LYY浓度12.5－200μg/ml和LYLJ浓度0.3125－5μg/ml范围内，细胞有病变，且部分已脱落，但病变程度较病毒对照组轻，且随着药物浓度的提高病变程度逐渐减轻。图4LYY和LYLJ对PRV增殖抑制作用的形态学观察结果

[0130] 图4显示LYY和LYLJ对PRV在Vero细胞上增殖的抑制作用。光学显微镜观察发现，与正常对照组比较，LYY浓度12.5－200μg/ml以及LYLJ浓度1.25－5μg/ml时，细胞有病变，且部分已脱落，但病变程度较病毒对照组轻，且随着药物浓度的提高病变程度逐渐减轻。

[0131] 图5LYY和LYLJ对PRV直接杀灭作用的形态学观察结果

[0132] 图5显示LYY和LYLJ对PRV的杀灭作用。显微镜观察发现，与病毒对照组相比，LYY高浓度尤其100和200μg/ml病变细胞甚少。LYY浓度12.5、25和50μg/ml以及LYLJ浓度在1.25－5μg/ml时，细胞有病变，但病变程度相对较轻，且随着药物浓度的增加病变程度逐渐减轻。

[0133] 药理实验

[0134] 实施例1：腊梅样品抗猪伪狂犬病毒活性检测实验

[0135] 1.材料

[0136] 1.1实验病毒株：猪伪狂犬病病毒(PRV，Bartha K61株)：硕腾公司美国查理斯堡公司。

[0137] 细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)，浙江大学动物科学学院天然药物实验室传代保存。

[0138] 1.2样品：实施例1、3、4、5、8、10、11、12所得产物。

[0139] 1.3主要仪器：CO2细胞培养箱：MCO-15AC型，日本三洋(SANYO)公司；电子天平：Sartorius 1700型，德国W-Germany；超净工作台：SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司；离心机：LD5-2A型，北京医用离心机厂；酸度计：ORION STAR A211，Thermo公司；酶标仪：
BIO-RAD680型，美国伯乐BIO-RAD公司；生物倒置显微镜：XDS-1B型，重庆光学仪器厂；电热恒温水浴锅：DK-S26型，上海精宏实验设备有限公司；微量振荡仪：MH-1型，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；漩涡混合器：WH-861型，江苏太仓华利达实验设备有限公司。

[0140] 1.4试剂：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMEM培养基购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；0.25％胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；完全培养液(含10％胎牛血清以及双抗的DMEM培养液)；细胞维持液(含2％胎牛血清的DMEM培养液)；磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)，本实验室自制。

[0141] 1.5主要试剂的配制

[0142] 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液：称取MTT粉末，加入PBS，溶解，制成2mg/ml的MTT溶液。

[0143] 2.实验方法

[0144] 2.1Vero细胞复苏和培养

[0145] 从液氮灌中取出冻存的Vero细胞，于37℃水浴快速融化，用75％乙醇擦拭冻存管口，将冻存管中液体转移至预先加有预冷PBS的离心管中，1200r/min离心5min，弃上清。细胞沉淀以含10％胎牛血清的DMEM完全培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置37℃、5％CO2细胞培养箱培养，倒置显微镜观察细胞生长情况。

[0146] 2.2PRV的TCID50测定

[0147] Vero细胞以0.75×105/ml浓度接种96孔细胞培养板，贴壁培养24h。将PRV液按10倍作倍比稀释，加入到铺满Vero细胞的96孔培养板中，每个稀释度重复8孔，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，期间每隔30分钟摇晃一次。2h后弃去上清，加入维持液继续培养。分别于接毒后12、24、48、72h置倒置显微镜下观察。比较不同稀释度的细胞病变情况(CPE)，有细胞病变的判为阳性，无细胞病变的为阴性，采用Reed-Muench法计算PRV在Vero细胞中的TCID50。

[0148] 2.3试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定

[0149] Vero细胞以0.75×105/ml的浓度接种96孔细胞培养板，贴壁培养24h。LYY初始浓度(400μg/ml)采用DMEM培养液作2倍倍比稀释至25μg/ml，LYLJ初始浓度(40μg/ml)向下2倍倍比稀释至0.625μg/ml，依次加到长成单层Vero细胞的96孔细胞板上，100μL/well，每个稀释度重复8孔，另设细胞对照孔，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养。孵育2h后，弃培养上清，加入维持液继续培养，每天观察细胞状态，以48h时，8孔均未出现细胞病变的浓度作为最大安全浓度。同时，另一批细胞于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD492)。

[0150] 2.4对PRV吸附细胞的阻断作用

[0151] 以最大安全浓度作为初始浓度，用DMEM培养液作2倍倍比稀释后，分别加入到长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板上，每个浓度8个复孔，100μL/well，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养。孵育2h后弃去上清，每孔加入100TCID50的PRV病毒液100μL，于37℃、5％CO2细胞培养箱继续孵育2h，每隔30分钟摇晃一次。另设细胞对照和病毒对照。2h后弃去病毒液后，每孔加入100μL维持液，继续培养，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况。于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解后采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD492)，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算阻断率。

[0152] 阻断率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值－病毒对照平均值)]×100％。

[0153] 2.5对PRV增殖的抑制作用

[0154] 在长满单层的Vero细胞孔中按100μL/well加入100TCID50的PRV病毒液，于37℃、5％CO2细胞培养箱吸附2h，每隔30分钟摇晃一次。弃去病毒液，按100μL/well加入不同稀释度的药物稀释液，每个稀释度重复8孔，于37℃、5％CO2细胞培养箱孵育。。2h后弃去药液，每孔加入100μL维持液，继续培养，同时设细胞对照和病毒对照，每天于倒置显微镜下观察细胞病变情况。同时，于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算抑制率。

[0155] 抑制率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值－病毒对照平均值)]×100％。

[0156] 2.6对PRV的杀灭作用

[0157] 将不同稀释度的药物稀释液分别与等体积的200TCID50病毒液混合，于37℃、5％CO2细胞培养箱孵育2h，每隔30分钟摇晃一次。然后将混合液按100μL/well加入长成单层的Vero细胞中，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养，间隔30分钟摇晃一次。2h后弃去上清，每孔加入100μL维持液，继续培养，同时设细胞对照和病毒对照。每天于倒置显微镜下观察细胞病变。于药物作用44h后，每孔加入MTT溶液(2mg/ml)50μL，继续孵育4h，2000r/min离心5min，甩去上清，每孔加入150μL酸性DMSO溶液(192μL DMSO加8μL 1N HCl)，振荡仪振荡，俟结晶完全溶解，采用酶标仪于波长492nm处测定OD值(OD492)，作为细胞存活量的指标，按下列公式计算杀灭率。

[0158] 杀灭率(％)＝[(给药组平均值－病毒对照平均值)/(正常细胞对照组平均值－病毒对照平均值)]×100％。

[0159] 3试验结果

[0160] 3.1试验药物对Vero细胞的最大安全浓度的测定

[0161] 表1 8种中药提取物对Vero细胞无毒性的最大浓度

[0162]

[0163] 3.2样品对PRV的阻断作用

[0164] 表2.LYC和LYS对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果

[0165]

[0166] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，eP<0.01和fP<0.001fP<0.001。

[0167] 表3.ZYS和ZYY对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果

[0168]

[0169] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。

[0170] 表4.SYS和SYY对PRV吸附细胞的阻断作用MTT法检测结果

[0171]

[0172]

[0173] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，eP<0.01和fP<0.001。

[0174] 表5.LYY(2015)和LYLJ-2-Y(2-6)对PRV吸附细胞阻断作用的MTT法检测结果[0175]

[0176] 注：与病毒对照组比较，cP<0.001；与细胞对照组比较，eP<0.01,fP<0.001。

[0177] 3.3样品对PRV的增殖抑制作用

[0178] 表6.LYC和LYS对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果

[0179]

[0180] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，eP<0.01和fP<0.001。

[0181] 表7.ZYS和ZYY对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果

[0182]

[0183] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。

[0184] 表8.SYS和SYY对PRV增殖的抑制作用MTT法检测结果

[0185]

[0186] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，eP<0.01和fP<0.001。

[0187] 表9.LYY(2015)和LYLJ-2-Y(2-6)对PRV增殖抑制作用的MTT法检测结果

[0188]

[0189] 注：与病毒对照组比较，cP<0.001；与细胞对照组比较eP<0.01,fP<0.001。

[0190] 此处补表

[0191] 3.4样品对PRV直接杀灭作用

[0192] 表10.LYC和LYS对PRV杀灭作用MTT法检测结果

[0193]

[0194] 注：与正常细胞对照组比较，bP<0.01和cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。

[0195] 表11.ZYS和ZYY对PRV杀灭作用MTT法检测结果

[0196]

[0197]

[0198] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。

[0199] 表12.SYS和SYY对PRV杀灭作用MTT法检测结果

[0200]

[0201] 注：与正常细胞对照组比较，cP<0.001；与病毒对照组比较，fP<0.001。

[0202] 表13.LYY(2015)和LYLJ-2-Y(2-6)对PRV杀灭作用MTT法检测结果

[0203]

[0204] 注：与病毒对照组比较，bP<0.01,cP<0.001；与细胞对照组比较，fP<0.001。