抗转移疗法中AXL信号传导的抑制转让专利
申请号 : CN201610819620.7
文献号 : CN107082805A
文献日 : 2017-08-22
发明人 : 阿马托·J.·贾科西亚 , 艾瑞恩·布鲁诺·兰金 , 詹尼弗·R·科克伦 , 道格拉斯·琼斯 , 米哈利斯·卡里欧利斯 , 凯瑟琳·富 , 缪钰
申请人 : 小利兰·斯坦福大学托管委员会
摘要 :
权利要求 :
1.一种可溶性AXL变体多肽,其中所述多肽缺乏AXL跨膜域且相对于野生型AXL序列包含至少一个氨基酸修饰,且其中所述改变增加所述AXL多肽结合于GAS6的亲和力。
2.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中所述可溶性AXL变体多肽在所述野生型AXL序列(SEQ ID NO:1)的选自由以下组成的组的区域中包含至少一个氨基酸修饰:1)
15-50之间,2)60-120之间,和3)125-135之间。
3.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中所述可溶性AXL变体多肽包含在所述野生型AXL序列(SEQ ID NO:1)的19、23、26、27、32、33、38、44、61、65、72、74、78、79、86、
87、88、90、92、97、98、105、109、112、113、116、118或127位的至少一个氨基酸修饰或它们的组合。
4.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中所述可溶性AXL变体多肽包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸修饰:1)A19T,2)T23M,3)E26G,4)E27G或E27K,5)G32S,
6)N33S,7)T38I,8)T44A,9)H61Y,10)D65N,11)A72V,12)S74N,13)Q78E,14)V79M,15)Q86R,
16)D87G,17)D88N,18)I90M或I90V,19)V92A、V92G或V92D,20)I97R,21)T98A或T98P,22)T105M,23)Q109R,24)V112A,25)F113L,26)H116R,27)T118A,28)G127R或G127E,和29)G129E,和它们的组合。
5.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中所述AXL变体包含相对于所述野生型AXL序列(SEQ ID NO:1)在以下位置的氨基酸改变:(a)甘氨酸32;(b)天冬氨酸87;(c)缬氨酸92;和(d)甘氨酸127。
6.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中甘氨酸32残基由丝氨酸残基置换,天冬氨酸87残基由甘氨酸残基置换,缬氨酸92残基由丙氨酸残基置换,或甘氨酸127残基由精氨酸残基置换,或它们的组合。
7.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中所述AXL变体包含相对于所述野生型AXL序列(SEQ ID NO:1)在以下位置的氨基酸改变:(a)谷氨酸26;(b)缬氨酸79;(c)缬氨酸92;和(d)甘氨酸127。
8.根据权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽,其中谷氨酸26残基由甘氨酸残基置换,缬氨酸79残基由蛋氨酸残基置换,缬氨酸92残基由丙氨酸残基置换,或甘氨酸127残基由精氨酸残基置换,或它们的组合。
9.一种药物组合物,其包含治疗有效量的一种或多种权利要求1所述的可溶性AXL变体多肽或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的药物组合物,其进一步包含至少一种细胞毒剂或药学上可接受的赋形剂或其组合。
说明书 :
抗转移疗法中AXL信号传导的抑制
请第61/336,478号的优先权,所述临时申请案的内容以引用的方式明确地并入本文。
技术领域
背景技术
损害受累组织的功能。然而,癌症中最显著的转折点是形成远端转移。此时,患者不再能单独地用局部疗法治愈。
实质中,并且增殖成次级群落。转移潜力受局部微环境、血管生成、基质-肿瘤相互作用、局部组织对细胞因子的加工以及肿瘤和宿主细胞的分子表型的影响。
质,其便进入淋巴系统和血管进行远端散布,同时释放基质片段和生长因子。在从开始转变成侵袭性癌期间,上皮基底膜的组织、分布和量发生整体和广泛的改变。
点。信号传导途径中调节侵袭和血管生成的激酶可为转移的重要调节因子。生物化学分子
靶的最大类别之一是受体酪氨酸激酶(RTK)家族。迄今最常见的受体酪氨酸激酶分子靶是
EGF和血管内皮生长因子(VEGF)受体。较新的激酶分子靶包括III型RTK家族的c-kit和abl。
这些分子的抑制剂已与经典化疗剂组合施用。
Oncology.2004;66(6):450-7;Gustafsson等,Clin Cancer Res.(2009)15(14):4742-9;
Wimmel等,Eur J Cancer.2001 37(17):2264-74;Koorstra等,Cancer Biol Ther.2009 8(7):618-26;Tai等,Oncogene.(2008)27(29):4044-55
SEQ ID NO:1提供,且关于氨基酸修饰可特定参考这一序列。GAS6/AXL的重要细胞功能包括细胞粘附、迁移、吞噬和抑制细胞凋亡。GAS6和AXL家族受体以组织和疾病特异性方式受到高度调节。
号传导。AXL家族RTK的独特之处在于其由GAS6激活,GAS6是维生素K依赖性蛋白家族的成
员,它类似于凝血因子而非典型生长因子。
发明内容
定肿瘤变得具有侵袭性和/或转移性的易发性或可能性的试剂和方法。
改变增加AXL多肽结合于GAS6的亲和力。在一些实施方案中,可溶性AXL变体多肽包含在野
生型AXL序列(SEQ ID NO:1)的选自由以下组成的组的区域中的至少一个氨基酸修饰:1)在
15-50之间,2)在60-120之间,和3)在125-135之间。在一些其它实施方案中,可溶性AXL变体多肽包含在野生型AXL序列(SEQ ID NO:1)的19、23、26、27、32、33、38、44、61、65、72、74、78、
79、86、87、88、90、92、97、98、105、109、112、113、116、118、127或129位的至少一个氨基酸修饰或其组合。在一些其它实施方案中,可溶性AXL变体多肽包含选自由以下组成的组的至少一个氨基酸修饰:1)A19T,2)T23M,3)E26G,4)E27G或E27K,5)G32S,6)N33S,7)T38I,8)T44A,
9)H61Y,10)D65N,11)A72V,12)S74N,13)Q78E,14)V79M,15)Q86R,16)D87G,17)D88N,18)I90M或I90V,19)V92A、V92G或V92D,20)I97R,21)T98A或T98P,22)T105M,23)Q109R,24)V112A,25)F113L,26)H116R,27)T118A,28)G127R或G127E,和29)E129K,以及它们的组合和保守等效物。
127。在一些其它实施方案中,可溶性AXL变体多肽包含由丝氨酸残基置换的甘氨酸32残基、由甘氨酸残基置换的天冬氨酸87残基、由丙氨酸残基置换的缬氨酸92残基、或由精氨酸残
基置换的甘氨酸127残基或其组合或保守等效物。在一些其它实施方案中,可溶性AXL变体
多肽包含相对于野生型AXL序列(SEQ ID NO:1)在以下位置的氨基酸改变:(a)谷氨酸26;
(b)缬氨酸79;(c)缬氨酸92;和(d)甘氨酸127。在一些其它实施方案中,可溶性AXL变体多肽包含由甘氨酸残基置换的谷氨酸26残基、由蛋氨酸残基置换的缬氨酸79残基、由丙氨酸残
基置换的缬氨酸92残基、或由谷氨酸残基置换的甘氨酸127残基或它们的组合或保守等效
物。
多肽对GAS6的亲和力为至少约1×10 M。在另一实施方案中,可溶性AXL变体多肽对GAS6的
亲和力为至少约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12M。在本文所述的各种实施方案中,可溶性AXL变体多肽展现的对GAS6的亲和力为野生型AXL多肽的亲和力的至少约2倍。在一
些实施方案中,可溶性AXL变 体多肽展现的对GAS6的亲和力比野生型AXL多肽的亲和力强
为至少约3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍或30倍。
R389-N396、D398-A406、E413-H429和W450-M468组成的组。在一些其它实施方案中,分离的抗体或其片段结合选自由以下组成的组的氨基酸区域中所包含的表位:
RMFSGTPVIRLRFKRLQPT(SEQ ID NO:3)、VGRVTSSGP(SEQ ID NO:4)、RNLVIKVN(SEQ ID NO:
5)、DAVMKIAVA(SEQ ID NO:6)、ERGLYHLNLTVGGIPFH(SEQ ID NO:7)和WLNGEDTTIQETVKVNTRM(SEQ ID NO:8)。
制剂:(a)AXL活性抑制剂,(b)GAS6活性抑制剂,和(c)AXL-GAS6相互作用抑制剂。在本文所述的各种实施方案中,所述抑制剂是多肽、多核苷酸、小分子、抗体、抗体片段或抗体药物缀合物。
附图说明
AXL染色呈阴性(*)。
表示每组5只小鼠。图形描绘注射shSCRM或shAXL MDA-231细胞的小鼠的全肺中人GASPDH和
AXL表达的实时PCR分析(n=5)。B.注射shscramble(shSCRM)和shAXL(shAXL)SKOV3ip.1细
胞后28天对小鼠拍摄的照片。注意,注射shSCRM的小鼠在整个腹腔中形成大量转移(圆圈)。
对于shAXL组,显示具有最大肿瘤负荷的小鼠。右边的图形描绘每只小鼠>5mm尺寸的腹膜转移的平均数目和最大肿瘤的平均重量。照片表示每组5只小鼠。C.注射shSCRM和shAXL
OVCAR-8细胞后34天对小鼠拍摄的照片。注意,注射shSCRM的小鼠在整个腹腔中形成大量转移(圆圈)。右边的图形描绘每只小鼠腹膜转移的平均总数和平均总肿瘤重量。照片表示每
组8只小鼠。
OVCAR-8细胞的细胞生长曲线。一式三份进行测量且误差条线表示S.E.M。B.48天时程内生
长的常位MDA-231(n=每组8只小鼠)和皮下SKOV3ip.1肿瘤(n=每组4只小鼠)的平均肿瘤
体积。误差条线表示S.E.M。
SKOV3ip.1细胞中MMP-2表达的实时PCR分析。表达值归一化为18S;n=3。误差条线表示
S.E.M。星号指示与shSCRM相比表达显著增加或降低,如由斯氏t检验(student’s t-test)(**,P<0.001)所测定。C.shSCRM或shAXL SKOV3ip.1细胞的MMP-2报告基因测定(n=6)。
D.从血清饥饿SKOV3ip.1细胞收集的条件培养基中MMP2酶原和活性MMP2活性的明胶酶谱法
测定。E.表达靶向scramble对照(shSCRM)或AXL(shAXL)的shRNA序列的SKOV3ip.1细胞和用
GAS6或PI3K抑制剂Ly294002(Ly)和GAS6处理的饥饿SKOV3ip.1细胞(strve)中Ser473处的
磷酸化AKT(P-AKT)、总AKT(AKT)和AXL表达的蛋白质印迹分析。F.用GAS6或GAS6和PI3K抑制剂Ly294002(Ly+GAS6)处理的饥饿SKOV3ip.1细胞(strve)的MMP-2报告基因测定。
scramble对照(shSCRM)或AXL(shAXL)的shRNA序列的MDA231、SKOV3ip.1和OVCAR-8细胞和
用GAS6或PI3K抑制剂Ly294002(Ly)和GAS6处理的饥饿SKOV3ip.1细胞(strve)中Ser473处
的磷酸化AKT(P-AKT)、总AKT(AKT)和AXL表达的蛋白质印迹分析。C.用含有可溶性AXL受体
(sAXL)的条件培养基或对照培养基(-)处理的细胞中磷酸化AKT Ser473表达的蛋白质印迹
分析。使所有细胞饥饿48小时且用GAS6(+)或媒介物(-)处理。D.用含有对照载体或sAXL的
条件培养基处理的MDA-231细胞中的胶原蛋白侵袭测定。
植后5天,在小鼠中检验到肉眼可见的病变的存在(显示注射后第5天具有腹膜转移的小鼠
的代表性照片,转移性病变由圆圈表示)。在第7天,向小鼠注射表达IgG2a-Fc对照(Ad-Fc)或可溶性AXL受体(Ad-sAXL)的腺病毒。腺病毒注射后,每3-4天通过蛋白质印迹分析评估血清sAXL表达水平。肿瘤细胞移植后第28天,在所有小鼠中评估肿瘤负荷。B.在肿瘤细胞注射后28天,用表达Ad-sAXL或Ad-Fc的腺病毒治疗的小鼠的代表性照片。转移性病变由圆圈表
示。图形显示每组7只小鼠的平均总肿瘤数目和重量。误差条线表示S.E.M.。注意,肿瘤数目和重量的统计差(p=0.01,斯氏t检验)在Ad-Fc和Ad-sAXL治疗的小鼠之间观察到(*)。C.
用Ad-Fc或Ad-AXL治疗的小鼠的肿瘤中MMP-2表达的实时PCR分析。
sAXL治疗的小鼠收集的肝脏和肾组织的H&E染色。
源性GAS6-AXL信号传导事件。
(shSCRM)或AXL(shAXL)的shRNA靶向序列稳定转染的转移性乳癌细胞系(MDA-231)、卵巢癌
细胞系(SKOV3ip.1和OVCAR-8)中AXL表达的蛋白质印迹分析。注意,shAXL细胞系在AXL表达方面显著降低。
SKOV3ip.1(B)细胞的细胞迁移百分比。C-D.MDA-231(A)、SKOV3ip.1(B)细胞粘附于胞外基
质蛋白的情形的分析。缩写:牛血清白蛋白(BSA),纤连蛋白(FN),I型胶原蛋白(Col I),IV型胶原蛋白(Col IV),层粘连蛋白(LN),纤维蛋白原(FBN)。误差条线表示平均值的标准误差。E-F.撤血清后AXL野生型和AXL缺陷型MDA-231肿瘤细胞(E)和SKOV3ip.1肿瘤细胞(F)的
存活分析,如XTT测定所测定。
的代表性照片,转移性病变由圆圈表示)。在第14天,向小鼠注射表达IgG2α-Fc对照(Ad-Fc)或可溶性AXL受体(Ad-sAXL)的腺病毒。通过蛋白质印迹分析评估血清sAXL表达水平。肿瘤
细胞移植后第34天,在所有小鼠中评估肿瘤负荷。B.在肿瘤细胞注射后28天,用表达Ad-
sAXL或Ad-Fc的腺病毒治疗的小鼠的代表性照片。转移性病变由圆圈表示。C.图形显示每组
8只小鼠的平均总肿瘤数目和重量。误差条线表示S.E.M.。注意,肿瘤数目和重量的统计差(p<0.01,斯氏t检验)在Ad-Fc和Ad-sAXL治疗的小鼠之间观察到(*)。
实例2中所述的解离速率测试后的结合。结合于2nM Gas6的水平显示于左侧柱形图中,4小
时无结合步骤后结合于Gas6的水平显示于中间柱形图中,且6小时无结合步骤后结合于
Gas6的水平显示于右侧柱形图中。图12B表示其细胞表面上特定蛋白的表达呈阳性的细胞
(各流式细胞术点图的右上象限)结合于Gas6的水平(y轴)的量化。汇集的第5轮分选产物显
示与野生型AXL相比显著提高的Gas6结合。
显著较高水平结合于较低浓度的Gas6,表明与野生型AXL相比这些突变体具有较强的结合
亲和力。右图显示野生型或工程改造过的Gas6-AXL相互作用的解离动力学。野生型Gas6-
AXL相互作用(“野生型”)随时间快速解离,而Gas6与S6-1(“S6-1”)或S6-2(“S6-2”)之间工程改造过的相互作用显示显著增加的结合保持性。
S6-1-Fc)的小鼠的尸检的2个代表性图像。黑色圆圈指示图像中可见的转移性病变,但不一定指示所有转移位点。野生型AXL-Fc显示出对转移的中度抑制作 用(相比阴性对照AXL
E59R/T77R),而AXL S6-1显示出对转移的几乎完全抑制作用。
个图形也显示同一数据集,这个数据集概述了从每个治疗组中的小鼠切除的所有转移的总
重量。与阴性对照E59R/T77R-Fc相比,野生型AXL-Fc抑制转移的扩散,如病变数目(上图)以及总重量(下图)的减少所指示。AXL S6-1-Fc显示与野生型AXL-Fc和AXL E59R/T77R-Fc相
比肿瘤负荷显著减少,如通过病变数目(上图)以及总重量(下图)所评估。这些数据表明增
强的AXL S6-1亲和力提供与野生型相比改进的治疗功效,且AXL S6-1-Fc是用于管理转移
的可行性治疗。
具体实施方式
氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构,但以类似于天然存在氨基酸
的方式起作用的化合物。本发明中用于表示氨基酸的所有单字母都是根据本领域中常规使
用的公认氨基酸符号来使用,例如A意指丙氨酸,C意指半胱氨酸等。由相关位置之前和之后的单字母表示的氨基酸反映原始氨基酸(所述位置之前)改变为改变后的氨基酸(位置之
后)。例如,A19T意指19位的氨基酸丙氨酸改变为苏氨酸。
的器官的器官或身体部分中存在不可检测的量的癌细胞。转移也可定义为进程的若干步
骤,诸如癌细胞从原始肿瘤位点偏离,和癌细胞迁移到和/或侵袭身体其它部分。因此,本发明预期一种确定未直接连接于原始癌性肿瘤的器官的器官或身体部分中一个或多个癌性
肿瘤的进一步生长风险的方法,和/或导致这种生长的进程中的任何步骤。
试剂处理、经过洗涤或富集某些细胞群体(诸如癌细胞)的样品。该定义还包括已富集特定
分子类型(例如核酸、多肽等)的样品。术语“生物样品”涵盖临床样品,并且还包括通过手术切除术获得的组织、通过活检获得的组织、培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样品”包括从患者的癌细胞获得的样品,例如从患者的癌细胞获得的包含多核苷酸和/或多肽的样品(例如细胞裂解液或包含多核苷酸和/或
多肽的其它细胞提取物);和来自患者的包含癌细胞的样品。来自患者的包含癌细胞的生物样品也可包括非癌细胞。
就实现疾病和/或疾病症状的部分或完全治愈来说可以是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖哺乳动物(特别是人)体内任何转移性肿瘤的任何治疗,并且包括:(a)预防疾病或疾病症状在可倾向于患有所述疾病但尚未诊断出患有所述疾病(例如包括可与原发性疾病有关或
由原发性疾病引起的疾病)的受试者中发生;(b)抑制疾病,即使其发展停滞;和(c)减轻疾病,即使疾病消退。在肿瘤(例如癌症)治疗中,治疗剂可直接减少肿瘤细胞的转移。
或病况(例如肿瘤或癌症)的发展。术语“治疗作用”是指减轻、消除或预防受试者的疾病、疾病症状或疾病副作用。
(carboplatin)、卡氮芥(carmustine)、克拉屈滨(cladribine)、西沙必利(cisapride)、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷(cytarabine)、氮烯咪胺(dacarbazine,DTIC)、放线菌素D
(dactinomycin)、多西他赛(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、屈大麻酚(dronabinol)、倍癌霉素(duocarmycin)、阿法依泊汀(epoetin alpha)、依托泊苷(etoposide)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、格拉司琼
(granisetron)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素α
(interferon alpha)、伊立替康(irinotecan)、兰索拉唑(lansoprazole)、左旋咪唑
(levamisole)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、甲地孕酮(megestrol)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦
(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥美拉唑(omeprazole)、恩丹西酮(ondansetron)、紫杉醇(paclitaxel,TaxolTM)、毛果芸香碱(pilocarpine)、普鲁氯嗪
(prochloroperazine)、利妥昔单抗(rituximab)、肥皂草素(saproin)、他莫西芬
(tamoxifen)、紫衫酚(taxol)、盐酸拓扑替康(topotecan hydrochloride)、曲妥珠单抗
(trastuzumab)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和酒石酸长春瑞滨
(vinorelbine tartrate)。对于卵巢癌治疗,可与AXL或GAS6信号传导抑制剂组合的优选化学治疗剂是紫杉醇(TaxolTM)。
于本发明化合物的施用并行(即同时)、预先或随后施用所述药物。本领域技术人员将不难
确定施用特定药物和本发明组合物的适当时间选择、顺序和剂量。
作用。关于剂量单位形式的规格可取决于(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗
作用,和(b)本领域中混配所述活性化合物所固有的限制。
在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基形成的酯,例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时,药学上可接受的盐或酯可为单酸-单盐或酯,或二盐或酯;且类似地,当存在两个以上酸性基团时,此类基团中的一些或全部可盐化或酯化。本发明中所命名的化合物可以未盐化或未酯化形
式存在,或以盐化和/或酯化形式存在,且此类化合物的命名意图包括原始(未盐化和未酯
化)化合物和其药学上可接受的盐和酯。另外,本发明中所命名的某些化合物可以一种以上立体异构形式存在,且所述化合物的命名意图包括所有单一立体异构体和此类立体异构体
的所有混合物(外消旋或其它形式)。
AXL变体多肽用作治疗剂。
体磷酸化且充当胞内信号传导分子的停泊位点。用以释放可溶形式的多肽的天然裂解位点
位于残基437-451处。
基19-437,但其可包含从约残基19、25、30、35、40、45、50到约残基132、450、440、430、420、
410、400、375、350到321(例如残基19-132)的截短型式或主要由所述截短型式组成。在一些实施方案中,可溶形式的AXL缺乏跨膜域且任选地缺乏胞内域。
方案中,氨基酸修饰包括任何天然存在的突变,例如取代、缺失、添加、插入等。在一些其它实施方案中,氨基酸修饰包括用另一氨基酸(例如,现有氨基酸的保守等效物)置换现有氨
基酸。在一些其它实施方案中,氨基酸修饰包括用非天然氨基酸置换一个或多个现有氨基
酸,或插入一个或多个非天然氨基酸。在一些其它实施方案中,氨基酸修饰包括至少1、2、3、
4、5或6或10个氨基酸突变或改变。
Gene 37:111-23(1985);Colicelli等,Mol Gen Genet 199:537-9(1985);和Prentki等,
Gene29:303-13(1984)。用于位点特异性诱变的方法可见于Sambrook等,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,CSH Press 1989,第15.3-15.108页;Weiner等,Gene 126:
35-41(1993);Sayers等,Biotechniques 13:592-6(1992);Jones和Winistorfer,
Biotechniques 12:528-30(1992);Barton等,Nucleic Acids Res 18:7349-55(1990);
Marotti和Tomich,Gene Anal Tech 6:67-70(1989);和Zhu Anal Biochem 177:120-4
(1989)。
104到110、残基111到120、残基125到130、残基19到437、残 基130到437、残基19到132、残基
21到132、残基21到121、残基26到132或残基26到121的一个或多个区域中的一个或多个氨
基酸修饰。在一些其它实施方案中,本发明的sAXL变体包括一个或多个在野生型AXL(SEQ
ID NO:1)的残基20到130、残基37到124或残基141到212中的一个或多个区域中的氨基酸修
饰。在一些其它实施方案中,本发明的sAXL变体包括在野生型AXL(SEQ ID NO:1)的19、23、
26、27、32、33、38、44、61、65、72、74、78、79、86、87、88、90、92、97、98、105、109、112、113、116、
118、127或129位的一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
10)D65N,11)A72V,12)S74N,13)Q78E,14)V79M,15)Q86R,16)D87G,17)D88N,18)I90M或I90V,19)V92A、V92G或V92D,20)I97R,21)T98A或T98P,22)T105M,23)Q109R,24)V112A,25)F113L,26)H116R,27)T118A,28)G127R或G127E和29)E129K及其组合。
如,通过采用适当编码序列,可提供法尼基化或异戊烯化。在一些实施方案中,本发明的
sAXL变体可聚乙二醇化,其中聚氧乙烯基使得血流中的使用期增加。本发明的sAXL变体也
可与其它蛋白(诸如IgG同型的Fc,其可与补体结合)、与毒素(诸如篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素等)或与允许靶向靶细胞上的特异性部分的特异性结合剂组合。
一个已报道的实例描述了由人CD4-多肽的前两个域和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链的
恒定区的多个域组成的嵌合蛋白。EP A 394,827;Traunecker等,Nature,331:84-86,1988。
与单独单体形式的分泌蛋白或蛋白片段相比,具有二硫键连接的二聚结构的融合蛋白(由
于IgG)也可更高效结合和中和其它分子。Fountoulakis等,J.Biochem.270:3958-3964,
1995。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989中所述,例如,六组氨酸便利于纯化融合蛋白。
另一适用于纯化的肽标签(“HA”标签)对应于来源于流感血凝素蛋白的表位。Wilson等,
Cell 37:767,1984。
中以有助于纯化,且随后去除,接着最终制备多肽。有助于处理多肽的肽部分的添加是本领域中所熟悉的常规技术。
AXL的结合活性或亲和力大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。在一些其它实施方案中,本发明的sAXL变体与GAS6的结合活性或亲和力为至少约1×10-6、1×10-7、1×10-8或1×10-9M。在一些其它实施方案中,本发明的sAXL变体能够抑制、抑制或竞争野生型AXL与GAS6在体内、体外或体内和体外的结合。在一些其它实施方案中,本发明的sAXL变体抑制或竞争如本申
请案实例2中所提供的AXL S6-1、AXL S6-2和/或AXL S6-5的结合。在一些其它实施方案中,本发明的sAXL变体抑制或竞争本申请案实例2中所提供的任何sAXL变体的结合。
NTA树脂珠粒。试剂可添加于适当缓冲液中且珠粒在既定温度下孵育一段时间。在洗涤去除未结合的材料后,结合的蛋白可用例如SDS、具有高pH值的缓 冲液等释放且加以分析。
15℃或20℃。
此类修饰也可包括糖基化修饰,例如通过在多肽的合成和加工期间或在其它加工步骤中修
饰多肽的糖基化模式所产生的修饰;例如,通过将多肽暴露于影响糖基化的酶(诸如哺乳动物糖基化或去糖基化酶)所产生的修饰。在一些实施方案中,本发明的sAXL变体包括具有磷酸化氨基酸残基的sAXL变体,例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
明的sAXL变体进一步包括含有不同于天然存在L-氨基酸的残基(例如D-氨基酸或非天然存
在的合成氨基酸)的sAXL变体类似物。D-氨基酸可取代一些或所有氨基酸残基。
的聚集。
再折叠。
合成器等。通过使用所述合成器,天然存在的氨基酸可被非天然氨基酸取代。特定序列和制备方法将根据便利性、经济学、所需纯度等确定。
所需产物,更通常将包含至少约75重量%的所需产物、优选至少约95重量%的所需产物,并且为了治疗目的,通常将包含至少约99.5重量%的所需产物。通常,这些百分比将基于总蛋白。
和合成方法来提供任何本发明多肽的适合编码序列。直接化学合成方法包括例如磷酸三酯
方法,Narang等,(1979)Meth.Enzymol.68:90-99;磷酸二酯方法,Brown等,(1979)
Meth.Enzymol.68:109-151;二乙基亚磷酰胺方法,Beaucage等,(1981)Tetra.Lett.,22:
1859-1862;和固体支撑方法,美国专利第4,458,066号。化学合成产生单链寡核苷酸。它可通过与互补序列杂交,或通过使用单链作为模板与DNA聚合酶聚合而转化为双链DNA。虽然
DNA化学合成通常限于约100个碱基的序列,但较长序列可通过较短序列的接合而获得。或
者,可克隆子序列且可使用适当限制酶裂解适当子序列。
提供。核酸的表达可自主调节或由本领域中已知的其它调节序列调节。可使用本领域中可
用的多种技术,诸如转铁蛋白聚阳离子介导的DNA转移、用裸核酸或封装的核酸转染、脂质体介导的DNA转移、DNA涂布的乳胶珠粒的胞内转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、基因枪、磷酸钙介导的转染等将本发明的核酸引入适合的宿主细胞中。
案中,本发明提供包含一种或多种用于表达本发明的sAXL变体的表达载体(组成性或在一
个或多个调节元件的控制下)的细胞群体。
S具有高结构同源性,共享相同模块组成且具有40%序列同一性。GAS6由于与TAM家族受体
酪氨酸激酶(Tyro3、AXL和MerTK)相互作用而具有生长因子样性质。人GAS6是由介导结合于磷脂膜的富含γ-羧基谷氨酸(Gla)的域、四个表皮生长因子样域 和两个层粘连蛋白G样
(LG)域组成的678个氨基酸的蛋白。人GAS6的转录变体的序列可分别以NM_001143946.1、
NM_001143945.1和NM_000820.2在Genbank登录。
在一些实施方案中,本发明的分离的抗体的片段包括可变轻链、可变重链、重链或轻链的一个或多个CDR或其组合,例如Fab、Fv等。在一些实施方案中,本发明的分离的抗体的片段包括含有单链抗体(例如ScFv)的多肽。在另一些实施方案中,本发明的分离的抗体的片段包
括单独可变区或可变区与Fc区的部分(例如CH1区)的组合。在另一些实施方案中,本发明的分离的抗体的片段包括微抗体(例如VL-VH-CH3)或双功能抗体。
的一个或多个氨基酸区域(例如GAS6的L295-T317、E356-P372、R389-N396、D398-A406、
E413-H429和W450-M468)所包含或提供的表位。
(SEQ ID NO:5)、DAVMKIAVA(SEQ ID NO:6)、ERGLYHLNLTVGIPFH(SEQ ID NO:7)和
WLNGEDTTIQETVVNRM(SEQ ID NO:8)的区域中的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸所包含或提供的表位。
的治疗实体与另一细胞毒剂(例如另一抗肿瘤剂)的组合。在一些其它实施方案中,本发明
的药物组合物包括一个或多个本发明的治疗实体与另一药学上可接受的赋形剂的组合。
施用模式和治疗应用。根据所需制剂,所述组合物也可包括药学上可接受的无毒载体或稀
释剂,这些载体或稀释剂是定义为通常用于配制供动物或人类施用的药物组合物的媒介
物。所选稀释剂不应影响组合的生物活性。所述稀释剂的实例是蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank's solution)。另外,所述药物组合物或制剂也可包括其它载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
体抑制。
制剂。在一些实施方案中,本文所述的例如用于治疗转移性癌症的本发明治疗实体的有效
剂量视多种不同因素而变,这些因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态(无论患者为人或动物)、施用的其它药物,以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常,患者是人,但也可治疗包括转基因哺乳动物的非人类哺乳动物。治疗剂量需要用滴定法测量以优化安全性和
功效。
kg的范围内。一示例性治疗方案需要每两周施用一次或一个月施用一次或每3到6个月施用
一次。本发明的治疗实体通常在多种时机施用。单一剂量之间的时间间隔可为每周、每月或每年。时间间隔也可为无规律的,如通过测量患者体内治疗实体的血液水平所指示。或者,本发明的治疗实体可以持续释放制剂形式施用,在所述情形下需要不太频繁的施用。剂量
和频率视患者体内多肽的半衰期而变。
对较高剂量,直到疾病进展减慢或终止,且优选直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。
因此,可对患者施用预防性方案。
重性或延迟疾病(包括疾病的生物化学、组织和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间
呈现的中间病理表型)的开始。
为,包括其并发症和在疾病发展中呈现的中间病理表型)。适于实现治疗或预防性治疗的量是定义为治疗或预防有效剂量。在预防性和治疗性方案中,药剂通常以若干种剂量施用直
到已实现充分反应。通常,反应经过监测,并且如果存在癌症复发,则给予重复剂量。
续释放活性成分的方式进行配制。示例性组合物包含5mg/mL单克隆抗体,其在由50mM L-组氨酸、150mM NaCl组成的水性缓冲液(用HCl调节到pH 6.0)中配制。
(诸如聚丙交酯、聚乙交酯或用于增强的佐剂效应的共聚物)中,如上文所论述。Langer,
Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119,1997。本
发明药剂可以贮存注射液或植入制剂的形式施用,所述贮存注射液或植入制剂可以允许持
续或脉动释放活性成分的方式配制。
70%的活性成分。
Practice,GMP)规章。
用于人类时无毒的剂量范围。本文所述蛋白质的剂量优选位于循环浓度范围内,这些浓度
包括有效剂量而极少具有或不具有毒性。所述剂量可在这一范围内视所用剂型和所用施用
途径而变。确切制剂、施用途径和剂量可由个别医师根据患者的病况加以选择。(参见例如Fingl等,1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章)。
容物的预期用途的标签。术语标签包括提供于试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何书面或
记录材料,或其以其它方式随附于试剂盒。
施方案中,AXL活性或GAS6活性的水平是由mRNA表达水平、蛋白质表达水平、蛋白质激活水平或对应于AXL或GAS6活性的任何适合指标直接或间接测量。在一些实施方案中,生物样品中AXL活性或GAS6活性的水平进一步与预定水平,例如通过基于来自未产生肿瘤侵袭或肿
瘤转移的肿瘤或来自正常组织的样品群体建立AXL活性或GAS6活性的正常水平或范围所获
得的标准水平相比较。例如,AXL活性或GAS6活性相较于预定水平或标准水平的增加指示肿瘤发生肿瘤侵袭或肿瘤转移的倾向。
开和描述这些出版物所引用的相关方法和/或材料。对任何出版物的引用均是针对其在申
请日前的揭示内容且不应解释为承认本发明无权先于根据先前发明的所述公布。此外,所
提供的公布日期可不同于可需要独立确认的实际公布日期。
征分离或与其组合,而不偏离本发明的范围和精神。任何所陈述的方法均可以所陈述事 件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。在下文中,将描述实例以说明本发明的各部
分。
溶性AXL胞外域抑制肿瘤细胞中的AXL信号传导级联足以抑制转移性肿瘤进展。
在转移性乳癌和卵巢癌的起始和进展中的作用。
细胞显示针对AXL的扩散细胞质和细胞核染色,假定AXL是膜结合受体,所述染色被认为是
背景染色(n=27,图1A)。然而,在原发性乳房肿瘤中,肿瘤上皮中的膜AXL染色在25%(1/4)的1级、76%(10/13)的2级和100%(18/18)的3级标本中存在(图1A和表1)。另外,AXL在88%(8/9)的淋巴结转移中表达。
5)的标本中表达(图1B)。相比之下,在原发性肿瘤上皮中的膜AXL染色存在于66%(6/9)的
II期和83%(53/64)的III期患者样品中(图1B和I)。另外,来自诸如网膜和腹膜等常见转移性位点的肿瘤样品显示分别在75%(24/32)和90%(27/30)标本中的高AXL表达(图1B和表
I)。这些发现表明原发性肿瘤中的AXL表达与晚期疾病和转移性肿瘤中所显示的转移相关。
此外,这些数据显示源自人类乳癌和卵巢癌的转移表达高水平的AXL。
癌细胞系进行AXL蛋白表达以便识别具有高AXL表达水平的转移性细胞系。类似于临床发
现,AXL在大多数转移性乳房(NCI-ADR-RES、MDA-231、HS 578T、BT-549)和卵巢(SKOV3、
OVCAR-8、ES-2、MESOV、HEYA8)细胞系中高度表达,而AXL在具有低转移潜力的细胞系(MCF7、MDA-MB435、T47D、IGROV1、OVCAR-3;图9)中以不可检测的量或低含量表达。AXL缺陷型转移性乳房(MDA-231)和卵巢(SKOV3ip.1和OVCAR-8)细胞系是使用先前所述的AXL shRNA靶向
序列产生的。蛋白质印迹分析确认与表达scramble对照shRNA靶向序列(shSCRM,图9B)的细胞相比,表达shAXL靶向序列的细胞表达少于5%的AXL蛋白。
肺的显微镜评价显示,5只注射shRNA scramble(shSCRM)MDA-231细胞的小鼠中的5只小鼠
均产生转移性病灶,这些病灶针对AXL染色呈阳性(图2A)。相比之下,5只注射shRNA AXL
(shAXL)的小鼠中没有一只小鼠在组织评价时产生肺转移(图2A)。为了量化这些小鼠的肺
中的肿瘤负荷,我们针对人类GAPDH进行实时PCR分析。图2A表明,注射shSCRM MDA-231细胞的小鼠的肺表达高水平的人类GAPDH,表明存在源自MDA-231细胞的转移性病变。此外,注射shSCRM的小鼠在肺中表达人类AXL,表明存在AXL阳性肿瘤细胞(图2A)。相比之下,注射
shAXL肿瘤细胞的小鼠不在肺中表达人类GAPDH或AXL。这些发现表明,AXL的遗传失活足以
完全抑制这一模型中肺转移的形成。
人类卵巢转移的腹膜散布,其中小鼠在腹膜注射SKOV3ip.1细胞后快速产生进行性疾病,这一疾病由腹水和多于100个附着于肠系膜、隔膜、肝和其它腹膜表面的小的转移性病变组成(图3B)。SKOV3ip.1腹膜转移中AXL表达的免疫组织化学分析显示,类似于人类卵巢转移,
AXL在SKOV3ip.1转移性病变中高度表达,表明这是用以研究AXL在卵巢转移中的作用(数据
未显示)的相关模型系统。在腹膜注射shSCRM和shAXL细胞后28天,shSCRM小鼠呈现严重腹
水和发病的征兆,使得我们有必要处死小鼠且研究注射shSCRM和shAXL的小鼠之间肿瘤负
荷的改变。虽然注射shSCRM细胞的小鼠发展腹水和超过100个腹膜转移,但注射shAXL细胞
的小鼠产生极少转移(图2B)。尺寸大于5mm的腹膜转移的平均数目从注射shSCRM的小鼠中
的13.4+/-4.3显著降到注射shAXL的小鼠中的0.8+/-0.5(图2B)。同样,这些肿瘤的平均重
量从注射shSCRM的小鼠中的236+/-74mg显著降到注射shAXL的小鼠中的39.2+/-18mg(图
2B)。给予这些发现以支持的是,OVCAR-8细胞中AXL表达的敲低显著抑制总的卵巢腹膜肿瘤质量和肿瘤数目(图2C)。总之,这些发现表明AXL是针对乳房和卵巢肿瘤转移的关键因子。
胞之间对总细胞数计数。我们发现在shSCRM与shAXL MDA-231、SKOV3ip.1或OVCAR-8细胞之间细胞生长曲线无显著差异(图3)。同样,观察到在shSCRM与shAXL细胞之间常位MDA-231或皮下SKOV3ip.1肿瘤生长无显著差异(图3)。这些发现表明,AXL不为体内肿瘤细胞增殖或皮下生长所需。总之,我们的发现表明AXL特异性调节乳房和卵巢肿瘤中的肿瘤转移。
活)中的作用。我们发现shAXL MDA-231、SKOV3ip.1和OVCAR-8细胞在通过I型胶原蛋白侵袭的能力方面严重受损(图4A)。我们还观察到shAXL细胞中细胞迁移的适度减少,但未能发现撤血清后粘附于ECM蛋白或存活方面的差异,表明AXL主要影响转移级联中的侵袭。
减少(图4B)。MMP-2荧光素酶报告基因测定显示,与shSCRM细胞相比shAXL细胞中的MMP-2启动子活性显著降低,表明AXL在转录水平下调节MMP-2(图4C)。明胶酶谱法测定显示,与
shSCRM SKOV3ip.1细胞相比shAXL细胞中分泌MMP-2的蛋白的水平显著降低(图4D)。总之,
这些发现表明AXL在人类卵巢癌细胞中作为MMP-2表达和活性的上游调节子的作用。
SKOV3ip.1细胞中Ser473处的磷酸化AKT(P-AKT)进行蛋白质印迹分析。我们发现与shSCRM
SKOV3ip.1细胞相比,显著抑制shAXL细胞中的P-AKT表达(图4E)。另外,饥饿SKOV3ip.1细胞的GAS6刺激引起PI3K依赖性诱导P-AKT,因为用PI3K抑制剂Ly294002治疗会完全消除GAS6
诱导的P-AKT表达(图4E)。为了确定PI3K途径是否牵涉于AXL介导的MMP-2表达,我们在GAS6和Ly294002存在下进行MMP-2荧光素酶报告基因测定。GAS6刺激后MMP-2启动子活性的诱导
完全由Ly294002治疗性阻断,表明GAS6/AXL信号传导通过PI3K信号传导 事件调节MMP-2表
达(图4F)。
们首先检查用可溶性AXL胞外域治疗是否足以抑制转移性肿瘤细胞中的AXL信号传导和侵
袭。PI3K/AKT信号传导在多种细胞类型中由AXL调节。发现PI3K/AKT信号传导在SKOV3ip.1
细胞中由GAS6/AXL信号传导调节且用可溶性AXL胞外域(sAXL)治疗能够减少GAS6治疗的
SKOV3ip.1细胞中的PI3K/AKT激活(图5B和C)。同样,用sAXL治疗胶原蛋白中的MDA-231细胞足以急剧减少细胞侵袭,表明sAXL治疗影响体外AXL信号传导和侵袭(图5D)。
在第7天开始用sAXL治疗。sAXL疗法是使用腺病毒系统递送,在所述系统中,在注射后长达
28天内肝释放全身产生的sAXL蛋白到小鼠血清中(图6A)。在第28天对肿瘤负荷进行肉眼观
察分析,显示与用Fc对照疗法治疗的小鼠相比,接受sAXL疗法的小鼠的肿瘤负荷显著(p<
0.01)减少。在SKOV3ip.1肿瘤模型中,与Fc治疗的小鼠相比,用sAXL治疗的小鼠中的总肿瘤重量和肿瘤数目减少63%(图6B)。同样,在OVCAR-8模型中,总肿瘤重量和肿瘤数目分别显著减少47%和42%(图11)。通过实时PCR分析检查SKOV3ip.1肿瘤中的MMP2表达水平且发现
与用Fc对照治疗的小鼠相比,用sAXL治疗的小鼠的肿瘤中的MMP2水平显著降低(图6C)。这
些结果表明,单一药剂AXL疗法足以显著减少产生疾病的小鼠中的转移性肿瘤负荷。此外,这些发现表明AXL对转移性肿瘤生长的治疗作用可涉及至少部分通过调节MMP活性来抑制
侵袭。
的裸小鼠中,我们未观察到行为、肉眼可见的或用显微镜可见的异常(图7)。
份报告中,显示受体酪氨酸激酶AXL是管理肿瘤细胞侵袭和转移的关键因子。最重要的是,显示使用可溶性AXL受体治疗性阻断AXL信号传导足以显著抑制患有预先存在的转移性疾
病的小鼠体内的转移性肿瘤进展。在机理方面,我们的研究表明可溶性AXL疗法至少部分通过抑制MMP活性和侵袭而抑制肿瘤转移。最后,我们证实AXL在来自人类卵巢癌和乳癌患者
的转移和晚期原发性肿瘤中高度表达,这凸显了我们的研究在临 床上的重要性。
内的转移性肿瘤进展。我们的发现表明,抑制肿瘤细胞中的AXL信号传导级联可阻断转移性疾病的起始和进展。我们的数据暗示AXL为晚期和转移性乳癌和卵巢癌的治疗靶且提示抗
AXL疗法可控制转移性疾病的起始和进展。
据证明,MMP-2表达在人类卵巢癌细胞中由AXL在转录水平下调节。虽然AXL调节MMP-2表达
的确切机理还未确定,但我们证实药理学抑制PI3K途径会在GAS6刺激的细胞中诱导MMP-2
启动子活性,这表明对PI3K途径的作用(图8)。重要的是,我们的结果表明AXL的治疗性阻断可为抑制肿瘤中的MMP活性的有效且无毒策略。广谱MMP抑制剂在癌症试验中未成功,这部
分是由于高水平的正常组织毒性。我们的发现表明,预计的抗AXL疗法的副作用很小。在小鼠中未观察到与可溶性AXL胞外域疗法的腺病毒介导的递送有关的任何正常组织毒性。此
外,种系AXL和GAS6基因敲除小鼠可存活且为表型正常的成体,这表明AXL或GAS6不为发展
或正常组织功能所需。
标准疗法包括疾病的最佳减灭手术,继而是细胞毒性铂-紫杉烷组合疗法。即使有这些努
力,仍有80%的诊断患有卵巢癌的患者发展复发性疾病且这些患者中仅有30%在诊断后存
活5年。
发现AXL疗法能够减少产生疾病的小鼠体内的转移性肿瘤负荷达63%。在疾病进展期间产
生的新的转移性病变显著减少。这一观察结果与我们的发现一致,显示AXL主要影响肿瘤细胞侵袭而非细胞增殖或生长。合起来,我们的结果表明AXL疗法主要用作抗 转移剂且可最
有效作为与当前细胞毒剂的组合疗法。
University)的赠品。MDA-231、OVCAR-3和MCF-7细胞是购自ATCC。IGROV-1和OVCAR-8细胞是购自NCI-Frederick DCTD肿瘤细胞系库。在37℃下,在5%CO2孵育器中,将细胞在补充有
10%热灭活胎牛血清和1%青霉素和链霉素的适当培养基中培养。来自乳癌和卵巢癌细胞
系的NCI60小组的细胞团由Dr.Giovani Melillo(NCI-Frederick)提供。
73个石蜡包埋的肿瘤样品是获自1995-2001年间斯坦福医院(Stanford Hospital)先前未
治疗的卵巢癌患者。这些原发性卵巢肿瘤样品组装到由每个患者两个样品组成的组织微阵
列中。来自腹膜的另外30个肿瘤样品也在此微阵列中进行评价。所有患者均具有浆液性卵
巢癌,且根据国际妇产科学联盟(International Federation of Gynecology and
Obstetrics)标准获得分期信息。所有标本和其相应的临床信息均根据由斯坦福大学伦理
审查委员会批准的协议收集。其它可购得的肿瘤微阵列用于检查来自网膜的32个转移性病
变(US Biomax)。
(Vector Laboratories)和针对过氧化物酶的DAB底物试剂盒(Vector Laboratories)根据
制造商协议来目测。载玻片用苏木精复染。根据对AXL表达呈阳性的细胞的百分比在显微镜下对肿瘤细胞膜上的AXL染色评分(0是不存在,1是针对不良品质样品,2是针对5-60%且3
是针对61-100%)。
测定且在Monolight 2010照度计(Analytical Luminescence Laboratory)中测量。将萤火
虫荧光素酶活性归一化为Renilla活性。一式三份进行测定且重复两次。
Lafayette,CO)进行。
AATTGTACTACACAAAAGTAC-3’。将这些寡核苷酸克隆到RNAi-Ready pSiren RetroQ(BD
Bioscience)载体中且SKOV3ip.1、MDA-231和OVCAR-8细胞通过这些载体进行逆转录病毒转
导。在嘌呤霉素(Sigma)中选择受感染细胞且通过蛋白质印迹分析测试多克隆群体的降低
的AXL表达水平。
(Invitrogen)根据制造商用对照载体或AXL 1-451进行瞬时DNA转染。转染后48-72小时收
集条件培养基。
板中且用50μg/μl胶原蛋白I型(BD Bioscience)预涂布。在37℃下孵育60分钟后,小心洗涤细胞5次。使用荧光分光光度计测量荧光活性(激发,494nm;发射,517nm)。
在37℃下孵育60分钟后,小心洗涤细胞5次。使用荧光分光光度计测量荧光活性(激发,
494nm;发射,517nm)。
色和量化粘附细胞。
对每个膜的5个区域进行计数。迁移%如下确定:(在shAXL细胞中迁移的细胞的平均数目/
在shSCRM细胞中迁移的细胞的平均数目)×100。一式三份进行实验且重复3 次。
件培养基的培养基中培养5-7天且拍摄照片。通过胶原蛋白侵袭是通过计算每20X区域呈现
分枝表型的肿瘤细胞的百分比来量化。对每个样品3个区域计数。一式三份进行实验且重复
2次。
下在10%酶谱凝胶(Invitrogen)上跑胶。电泳后,在2.5%(v/v)Triton X-100中洗涤凝胶
以去除SDS且在50mM Tris-HCl、5mM CaCl2和0.1%Triton X-100(pH 7.8)洗涤,并且在37
℃下孵育过夜。用溶解于40%甲醇和10%冰乙酸中的0.25%(w/v)库马斯亮蓝(Coomassie
Brilliant Blue)R250将酶谱染色30分钟。在40%甲醇和10%冰乙酸中使凝胶变色。一式两份进行实验且重复3次。
对AXL的抗体(RandD系统)、α微管蛋白(Fitzgerald抗体)、AKT(细胞信号传导)、磷酸化AKT(细胞信号传导)探测蛋白质印迹。
Usage Committee)根据机构和NIH准则批准。
中的sAXL或对照(1.9×108个腺病毒pfu)注射到小鼠的尾静脉中。处死后,量化腹水,对转
移性病变计数,将所有可见的病变切开并清除以称取总肿瘤重量。
108个腺病毒pfu)注射到小鼠的尾静脉中。第28天,处死小鼠。收集血液且由斯坦福大学的比较医学系(Department of Comparative Medicine)进行综合代谢小组和CBC分析。从包
括肝、肾、脑和脾在内的所有主要器官收集组织样品,固定于10%福马林中,包埋于石蜡中,切片且用苏木精和曙红复染。
学者确认对具有最少四个具有最大细胞核且对AXL表达呈阳性的人类细胞的肺病灶的正确
鉴定。小鼠肺中的肿瘤负荷通过从全肺分离的RNA中人类GAPDH和AXL表达的实时PCR分析来
量化。
中在将0.1ml PBS中的10 个细胞皮内注射到乳房脂肪垫中后作为皮下常位肿瘤生长。在38
天时程内用测径器测量肿瘤。使用下式计算体积:宽度2×长度×0.5。
计算体积:宽度2×长度×0.5。
Biosystems)对1μl cDNA进行PCR扩增。以下引物对用于扩增特异靶基 因:18S FWD:5-
GCCCGAAGCGTTTACTTTGA-3 REV:5-TCCATTATTCCTAGCTGCGGTATC-3;AXL FWD:5-
GTGGGCAACCCAGGGAATATC-3 REV:5-GTACTGTCCCGTGTCGGAAAG;GAPDH 5-
ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3 REV:5-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3;MMP-2 FWD:5-
GCCCCAGACAGGTGATCTTG-3 REV 5-GCTTGCGAGGGAAGAAGTTGT-3。在Prism 7900序列检测系统
(Applie d Biosystems)上进行PCR扩增。所用热循环分布是在50℃下变性2分钟且在95℃
下变性10分钟,随后是在95℃下变性15秒且在60℃下变性1分钟的循环。使用18S归一化
mRNA。相对mRNA表达水平是使用相对标准曲线方法根据制造商的说明(Applied Bio
systems)来确定。
所测量,这进一步凸显了在临床前小鼠模型中GAS6和AXL作为抑制转移进展的关键靶和有
效策略的重要性。
大大提高的对Gas6的亲和力。
受体的Ig1域进行易错PCR而产生的。该库使用酵母表面呈现来表达且通过荧光激活的细胞
分选(FACS)进行筛检以分离对可溶性GAS6展现出增强的结合亲和力的突变体。在我们的库
筛检方法中,突变体蛋白库经过多轮分选,其中连续各轮可减小库的大小,同时强化所需突变体蛋白性质,其在这种情形下对GAS6的结合亲和力较高。
存在下孵育2、4、6、12或24小时。过量竞争者用于螯合从酵母呈现的AXL解离的GAS6,使无结合步骤不可逆。使用FACS收集保持结合于GAS6的突变型AXL蛋白。0、4和6小时的解离速率步骤后通过汇集的第5轮分选产物分析与GAS6的结合,显示这些产物与野生型AXL相比在持久
结合于GAS6方面展现显著改进(参见图12)。条线图量化了来自点图的数据,表明库成员的
显著改进。这些产物的定序识别了Axl Ig1域内关于汇集的第5轮分选产物所观察到的赋予
增强的针对Gas6的亲和力的若干突变(图12和表2)。第6轮分选进一步强化来自第5轮分选
产物的3种特定克隆物。表2显示AXL序列内的独特氨基酸突变,这些突变含于第5轮和第6轮分选产物中。在这个表格中,顶行中的残基数目指示野生型AXL中的氨基酸残基。第二行指示在野生型AXL中的既定位置可见的残基。在随后各行中,指定既定突变体中存在的氨基酸突变。突变体内不存在针对特定残基的氨基酸(例如表2中的空白区或空白单元)表示这个
氨基酸残基不是从野生型残基突变而来。氨基酸残基的标准单字母名称的使用是本领域技
术 人员充分了解的。
Wt-AXL E G N S V D V G
Axl S6-1 S G A R
Axl S6-2 G M A E
Axl S6-5 S N G A
互作用的亲和力。将数据拟合为四点S形曲线且取中点作为平衡结合常数KD。突变体AXL
S6-1和AXL S6-2展现与野生型AXL相比在GAS6结合亲和力方面存在实质性改进(图13和表
4)。野生型AXL对Gas6的结合亲和力(KD)为2.4±1.2×10-9M;AXL S6-2对Gas6的结合亲和力
(KD)为1.89±0.37×10-10M;且AXL S6-1对Gas6的结合亲和力(KD)为1.12±0.23×10-10M。对
于AXL S6-1和AXL S6-2,这个GAS6结合亲和力分别是野生型AXL的22倍和12.8倍(表4)。
圆度且将数据拟合为标准两态展开曲线。熔融温度(Tm)是展开曲线的中点。野生型AXL展现
41.3±0.6℃的熔融温度;AXL S6-1展现54.0±0.9℃的熔融温度(热稳定性比野生型AXL高
大约13℃);Axl S6-2展现41.55±0.02℃的熔融温度(热稳定性与野生型AXL大致类似)(表
5)。
者预后之间观察到不同关联,但很多情况下未证实AXL为用于治疗转移的治疗靶。在实例1
中,我们证实AXL确实是人类乳癌和卵巢癌患者体内转移的标志物,原发性肿瘤上的AXL表
达水平与所述疾病的严重性相关。这些结果表明,拮抗GAS6-AXL信号传导途径可提供用于
治疗转移性疾病的治疗窗。如实例1中所概述,为了验证AXL为治疗靶的潜力,在人类卵巢癌的侵袭性小鼠模型中使用腺病毒递送来施用可溶形式的AXL野生型胞外域。我们证实与对
照相比,肿瘤转移在接受可溶性AXL治疗的小鼠中显著减少。这些数据表明,使用可溶性AXL拮抗肿瘤细胞中的GAS6-AXL信号传导可抑制所述疾病的转移性进展。基于这些结果,我们
证实工程改造过的对GAS6的亲和力较高的AXL突变体作为抗转移剂引起较大功效,且治疗
上更相关的递送可溶性AXL的模式仍产生显著结果。
AXL S6-1(工程改造过的高亲和力突变体)且均与一种AXL形式E59R/T77R比较,在E59R/
T77R中消除GAS6结合。我们的结果突出显示,增强的AXL S6-1亲和力引起较大的治疗功效,因为通过所有转移性病变的数目和总重量所评估的肿瘤负荷减少相比野生型AXL和AXL
E59R/T77R阴性对照均显著降低。这些发现进一步验证AXL和GAS6为用于抑制转移的治疗靶
且支持工程改造过的高亲和力AXL突变体S6-1为GAS6-AXL信号传导系统的有效拮抗剂。
T77R融合于小鼠IgG2a的片段可结晶区(Fc)以便改进药物动力学。这三种AXL融合(AXL-Fc)
变体之间的唯一差别是见于AXL Ig1域中的突变,这些突变概述于表6A中。编码AXL-Fc蛋白的DNA是使用EcoRI和SalI限制位点克隆到CMV驱动的pADD2腺病毒穿梭载体中。编码这三种
AXL突变体的pADD2质粒是使用来自Life Technologies的Freestyle表达试剂盒,如制造商
所述独立转染到HEK 293细胞中。使用蛋白A亲和色谱法,随后使用尺寸排阻色谱法从培养
物上清液纯化蛋白质。
病。此模型是人类卵巢癌的极准确的表示,因为大多数患者在诊断时患有明显转移性疾病。
小鼠注射SKOV3ip.1细胞且使肿瘤接种7天。在第7天,我们将小鼠随机分成3个研究组且开
始野生型AXL-Fc、S6-1-Fc或E59R/T77R-Fc的施用性治疗。一周两次将溶解于磷酸盐缓冲盐水中的纯化过的蛋白质以10mg/kg的剂量施用于小鼠,历时3周,总计6剂。在第28天,将所有小鼠处死且进行尸检以评估总体肿瘤负荷,如通过可见的转移性病变的数目以及所有病变
的总重量所测量。治疗组之间存在显著差别且代表性图像显示于图14中。接受E59R/T77R-
Fc阴性对照治疗的小鼠具有平均86.3±21.9个腹膜转移。对于接受野生型AXL-Fc的小鼠,
这一数字降到48.1±6.9,而对于工程改造过的AXL组中的小鼠(S6-1-Fc),平均仅观察到
8.3±1.6个转移性病变(图15(上图))。对每只小鼠切除所有可见的病变且合起来称重以评
估总体转移性肿瘤负荷。工程改造过的AXL治疗组(S6-1-Fc)又显示最显著的反应,因为
E59R/T77R-Fc、野生型Fc和S6-1-Fc治疗组各自展现567±92、430±36和188±55mg的肿瘤
负荷,图15(下图)。
融合体的蛋白质(AXL E59R/T77R-Fc)无法预防肿瘤转移;以中等亲和力结合于Gas6的包含
AXL-Fc融合体的蛋白质(野生型AXL-Fc)显示轻微抑制肿瘤转移;以极强亲和力结合于Gas6
的包含AXL-Fc融合体的蛋白质(AXL S6-1-Fc)显示显著抑制肿瘤转移。总之,这表明Gas6与AXL的相互作用的表位在肿瘤转移中至关重要且通过AXL S6-1-Fc蛋白有效抑制Gas6上的
这一表位可显著抑制肿瘤转移。因而,AXL S6-1-Fc蛋白或任何有效阻断Gas6-Axl相互作用的蛋白质均是有希望用于转移性疾病的治疗候选物。此外,也显示直接施用纯化过的可溶
性AXL蛋白是一种可行的治疗方法,在临床上验证了这种方法。
剂盒,如制造商所述实现人类胚胎肾(HEK)293细胞的瞬时DNA转染。5天后使用蛋白A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从培养物上清液纯化Fc-融合蛋白。纯化过的蛋白质放置于磷酸盐
缓冲盐水溶液中而无任何额外添加剂或载体。
106个SKOV3ip.1细胞。施用细胞后7天,将小鼠随机分成3个用S6-1-Fc、野生型AXL-Fc或
E59R/T77R-Fc治疗的组。纯化过的可溶性AXL-Fc蛋白经腹膜内注射以10mg/kg的剂量一周
施用2次。给药持续3周,之后处死小鼠。进行尸检,其中对转移性病变计数且接着切除以合起来称重。肿瘤负荷是通过每只小鼠的所有患病组织的总病变数目和总体重量来确定。
况下进行某些改变和修改。