具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制备方法和应用。所述牦牛骨蛋白肽为牦牛骨蛋白经过复合蛋白酶分步酶解的酶解物制得；所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。本发明所述的牦牛骨蛋白肽具有优异的ACE抑制功能，ACE抑制活性(IC50值)小于0.32mg/mL，可以作为ACE抑制剂应用于特需食品和营养食品中。本发明的牦牛骨蛋白肽制备方法简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。

权利要求

1.一种具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽，其特征在于，所述牦牛骨蛋白肽的采用以下方法制备：

1) 以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，将制得的牦牛骨蛋白液在

75-85℃下，经频率为80-100kH的超声波超声处理15-25分钟以改变牦牛骨蛋白的组织结构；

2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解且不添加酸和碱，所述复合蛋白酶分步酶解包括以下步骤：第一步酶解反应：向蛋白重量8-10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶；第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5wt％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶；

3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得；

其中，所述牦牛骨蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整；所述步骤

3)中除杂具体为：

在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

所述步骤3)中膜分离具体为：将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为5000道尔顿的膜和孔径为3000道尔顿的膜进行超滤；

所述步骤3)中凝胶分离和反相HPLC具体为：

将膜分离后的产物经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中16-18分钟的肽洗脱液；

其中所述的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的含量在50％以上多肽：Glu-Ile-Arg-Met-Leu，

Thr-Val-Ser-Leu-Pro-Arg，

和Ser-Pro-Ile-Leu-Gly-Tyr-Trp。

2.制备权利要求1所述的牦牛骨蛋白肽的方法，包括以下步骤：

1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，将制得的牦牛骨蛋白液在

75-85℃下，经频率为80-100kH的超声波超声处理15-25分钟以改变牦牛骨蛋白的组织结构；

2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解且不添加酸和碱，所述复合蛋白酶分步酶解包括以下步骤：第一步酶解反应：向蛋白重量8-10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶；第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5wt％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶；

3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得；

其中，所述牦牛骨蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整；所述步骤

3)中除杂具体为：

在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

所述步骤3)中膜分离具体为：将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为5000道尔顿的膜和孔径为3000道尔顿的膜进行超滤；

所述步骤3)中凝胶分离和反相HPLC具体为：

将膜分离后的产物经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中16-18分钟的肽洗脱液。

3.权利要求1所述的牦牛骨蛋白肽在制备预防或治疗受益于ACE抑制的疾病的药物或食品中的应用。

说明书

具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及动物食品加工领域，更具体地，涉及一种具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，潜伏期长。高血压的早期阶段，一般没有明显不适症，直至发生临床迹象心脏病发作、脑血管破裂而导致死亡。

[0003] 血管紧张素转化酶(Angiotensin I converting enzyme，ACE)为肾素-血管紧张素系统的关键酶。血管紧张素原在肾素的作用下转化为血管紧张素I，血管紧张素I在ACE的作用下转化为血管紧张素II，刺激血管收缩，造成血压上升。抑制ACE的活性对降低血压有着积极的作用，因而开发有效的ACE抑制剂引起人们的极大关注。虽然来源于食物的ACE抑制肽比人工合成的ACE抑制剂作用弱，但是它有其独特的优点，不会产生降压过度的问题，安全性高，无副作用，除降压功能外，往往同时具有免疫促进、易消化吸收等功能。由于药物疗法存在副作用，天然食物中的降血压功能因子的开发利用将成为今后高血压非药物治疗的重要部分。

[0004] 现有技术中有利用鱼类资源或蛤类制备ACE抑制肽的方法，如中国专利CN106399435A公开了一种利用鱼鳞制备ACE抑制肽的方法，该方法包括将鱼鳞水洗去杂质后，用NaCl溶液浸泡1-2天，脱除杂蛋白和鱼银粉，将鱼鳞捞出后再用HCl溶液、料液比1:10-1:20，浸泡1-2h，以脱除钙盐等无机盐；将鱼鳞用蒸馏水浸泡溶胀，接着用碱性蛋白酶酶解，然后离心，上清液为酶解液，将酶解液冷冻干燥得到ACE抑制肽；所得到的产品ACE抑制率较高，与化学合成的ACE抑制肽相比，制备的ACE抑制肽安全无毒、易于消化；如中国专利CN104593466A公开了一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法，该方法利用蓝蛤体内的内源性蛋白酶进行酶解，通过自溶获得天然ACE抑制肽，制备过程中不加入任何外源蛋白酶，整个制备过程包括新鲜蓝蛤预处理、匀浆、内源酶激活、酶争、灭酶、脱腥、离心、冷冻干燥；也有报道采用罗非鱼鱼皮及植物蛋白为原料生产ACE抑制肽，如中国专利CN101240312A公开了一种源于鱼皮的ACE抑制肽的制备方法，该方法实现罗非鱼废弃物的综合利用，具体以罗非鱼鱼皮为原料，水提罗非鱼鱼皮中的鱼皮蛋白，采用蛋白酶进行水解，经灭酶、脱苦、脱色、脱味、过滤、离子交换和浓缩等工序得到鱼皮蛋白酶解液(TSP-1)，将TSP-1超滤处理后，再经凝胶层收集高活性组分，冷冻干燥制得高活性的ACE抑制肽产品；
中国专利CN104131055A公开了一种藻红蛋白ACE抑制肽的制备方法，该方法包括藻红蛋白的提取步骤，加入胃蛋白酶酶解再加入胰蛋白酶酶解；将酶解后的冻干粉溶于纯水，上样于SephadexG-15凝胶柱，收集活性最高峰为藻红蛋白ACE抑制组分。将所述组分继续上样于高效液相色谱ZORBAX300SB-C18柱进行分离，以检测该组分中藻红蛋白ACE抑制肽制备，该发明的方法可以避免活性肽经人体摄入后被胃肠道消化液降解而失活，同时缩减了成本。

[0005] 但这些制备方法中通常采用通过添加酸、碱调节pH,影响产品的品质，同时对蛋白肽的主要组成不明确。我国牦牛骨资源丰富，目前国内外专利中未见利用牦牛骨蛋白资源制备血管紧张素转化酶抑制肽的专利文献报道。

发明内容

[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽及其制备方法和应用。

[0007] 为了实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽，该牦牛骨蛋白肽为牦牛骨蛋白经过复合蛋白酶分步酶解的酶解物制得；其中，复合蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。

[0008] 使用本发明特定的复合蛋白酶对牦牛骨蛋白分布酶解，得到的肽具有ACE抑制活性，合理地且有效地利用了牦牛骨蛋白。

[0009] 为了得到较纯的牦牛骨蛋白肽，使用上述复合蛋白酶的分布酶解优选包括以下步骤：

[0010] 调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为8-10wt％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0wt％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解。

[0011] 为了提高得到的牦牛蛋白肽的抑制活性，在本发明一个优选实施方式中，使用上述复合蛋白酶分布酶解具体包括以下步骤：

[0012] 第一步酶解反应：向蛋白重量8-10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶；

[0013] 第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5wt％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。

[0014] 在本发明一个优选实施方式中，第一复合蛋白酶中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1～2:1。

[0015] 在本发明一个优选实施方式中，第二复合蛋白酶中胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1:1～2。

[0016] 为了进一步提高得到的牦牛蛋白肽的抑制活性，在本发明一个优选实施方式中，牦牛骨蛋白肽的制备方法包括如下步骤：

[0017] 1)牦牛骨蛋白液的制备；

[0018] 2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解；

[0019] 3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得。

[0020] 该制备方法中不添加任何酸和碱。

[0021] 在本发明一个优选实施方式中，步骤1)中还包括将制得的牦牛骨蛋白液在75-85℃下，经频率为80-100kH的超声波超声处理15-25分钟。在该条件下，可以有效地改变牦牛骨胶原蛋白的组织结构，利用在该温度下特定的频率超声波技术处理的牦牛骨蛋白液，可以明显改善牦牛骨蛋白对酶的敏感性，有效地降低酶的使用量。

[0022] 在步骤3)中，可以使用本领域中通用的除杂方法，为了得到抑制活性更好的多肽，在本发明一个优选实施方式中，步骤3)中的除杂具体为：

[0023] 在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液。

[0024] 在该优选实施方式中，通过使用活性炭除杂，使得蛋白肽具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品、药物以及营养食品中。

[0025] 为了使得到的牦牛骨蛋白液的抑制效果更好，步骤3)中膜分离可以具体为：步骤3)中膜分离具体可以为：

[0026] 将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为5000道尔顿的膜和孔径为3000道尔顿的膜进行超滤。

[0027] 进一步优选地，膜分离的步骤为：

[0028] 将得到的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

[0029] 在本发明一个优选实施方式中，步骤3)中凝胶分离和反相HPLC可以为：

[0030] 将膜分离后的产物经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中16-18分中的肽洗脱液。

[0031] 将所得到的肽洗脱液浓缩，冷冻干燥，即可得到本发明最优选的牦牛骨蛋白肽。

[0032] 本发明的牦牛骨蛋白肽的ACE抑制活性(IC50值)小于0.32g/mL，当蛋白肽的浓度为1.0mg/mL时，ACE抑制率可达80％以上，优选90％以上。

[0033] 本发明从牦牛骨蛋白中提取得到的牦牛骨蛋白肽中分子量低于1000的肽的比例为90％以上。

[0034] 在本发明一个优选实施方式中，使用上述方法制备得到的牦牛骨多肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

[0035] Glu-Ile-Arg-Met-Leu(GIAML，如SEQ ID NO.1所示)。

[0036] 在本发明一个优选实施方式中，使用上述方法制备得到的牦牛骨多肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

[0037] Thr-Val-Ser-Leu-Pro-Arg(TVSLPA，如SEQ ID NO.2所示)

[0038] 在本发明一个优选实施方式中，使用上述方法制备得到的牦牛骨多肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：Ser-Pro-Ile-Leu-Gly-Tyr-Trp(SPILGTT，如SEQ ID NO.3所示)。

[0039] 含有上述3种多肽中任一种的牦牛骨蛋白肽均具有较好的ACE抑制功能，ACE抑制活性(IC50值)小于0.32g/mL。

[0040] 在本发明一个优选实施方式中，牦牛骨蛋白肽中活性成分包括上述3种多肽，进一步优选地，活性成分为上述3种多肽的组合，进一步优选地，上述3种肽的组合的含量在50％以上。

[0041] 本发明的牦牛骨蛋白肽可以为粉末状。

[0042] 为了使整个加工过程更加简单且不用添加酸或碱进行pH的调整，步骤1)中的牦牛骨蛋白液是以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到的。

[0043] 即本发明还提供了上述牦牛骨蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

[0044] 1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液；

[0045] 2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解；

[0046] 3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得。

[0047] 其中，步骤2)和步骤3)的进一步优选方案参照上述内容。

[0048] 在本发明一个优选实施方式中，步骤1)中牦牛骨蛋白液的制备具体可以为：

[0049] 选用冷冻鲜牦牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量1.0～3.0倍的水在125-135℃条件下处理2-5小时，然后通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨高温蒸煮液，冷却到15-30℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

[0050] 为了保持较好的功能特性，较易实现产业化生产，在本发明一个优选实施方式中，牦牛骨蛋白肽的制备方法具体可以为：

[0051] 1)选用冷冻鲜牦牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量1.0～3.0倍的水在125-135℃条件下处理2-5小时，然后通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨高温蒸煮液，冷却到15-30℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液；

[0052] 将1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到75-85℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80-100kH)处理15-25分钟，改变牦牛骨胶原蛋白的组织结构。

[0053] 2)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为8-10wt％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0wt％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解：

[0054] 第一步利用0.2～0.5wt％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)组成，它们之间的质量比为1～2：1)，在50～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h；

[0055] 然后进行第二步利用0.2～0.5％复合蛋白酶二(胰蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1～2)，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h；

[0056] 3)除杂：在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

[0057] 膜分离：将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

[0058] 凝胶分离以及反相HPLC分离：取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中16-18分中的肽洗脱液；

[0059] 将得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粉。

[0060] 由上述制备方法得到牦牛骨蛋白肽分子量低于1000的肽的比例为90％以上。

[0061] 本发明还提供了上述牦牛骨蛋白肽以及上述制备牛骨蛋白肽的方法在制备预防或治疗受益于ACE抑制的疾病的药物或食品中的应用。

[0062] 本发明的牦牛蛋白肽可以作为药物，或是膳食补充剂，或作为食品基料加入到普通食品如饮料、乳制品等中，本发明的药物或食品可用于治疗高血压等能够用ACE抑制剂治疗的其他疾病。本领域技术人员可以根据较高或较低的IC50值结合治疗对象的实际情况，来合理调整使用的剂量。

[0063] 本发明从牦牛骨蛋白中提取的牦牛骨蛋白肽具有优异的ACE抑制功能，ACE抑制活性(IC50值)小于0.32mg/mL；本发明开发的牦牛骨蛋白肽制备方法简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产；本发明开发的产品安全，本发明采用多种食品级特定的复合蛋白酶(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量的肽组成的牦牛骨蛋白肽，不加任何添加剂，为100％牦牛骨蛋白肽。

具体实施方式

[0064] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0065] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

[0066] 实施例1具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽的制备方法

[0067] (1)选用冷冻鲜牦牛骨100克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎机将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量2倍的水在125℃条件下处理4小时，通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷却到20℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

[0068] (2)将(1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到80℃，利用超声波发生器经超声波(频率为85kH)处理15分钟。

[0069] (3)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为8％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.4％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1：1)，在55℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.4％复合蛋白酶二(胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1：2)，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

[0070] (4)将步骤(3)所得的分离液利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

[0071] (5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到经过凝胶分离的牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取16-18分收集的肽溶液；

[0072] (6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有ACE抑制功能的骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对骨胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Glu-Ile-Arg-Met-Leu，Thr-Val-Ser-Leu-Pro-Arg，Ser-Pro-Ile-Leu-Gly-Tyr-Trp的肽的含量为50.9％。

[0073] 实施例2具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽的制备方法

[0074] (1)选用冷冻鲜牦牛骨500克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎机将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量1.5倍的水在130℃条件下处理3小时，通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷却到25℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

[0075] (2)将(1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到82℃，利用超声波发生器经超声波(频率为90kH)处理20分钟。

[0076] (3)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.4％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.6％复合蛋白酶二(胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.4％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

[0077] (4)将步骤(3)所得的分离液利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

[0078] (5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到经过凝胶分离的牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取16-18分收集的肽溶液；

[0079] (6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有ACE抑制功能的骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对骨胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Glu-Ile-Arg-Met-Leu，Thr-Val-Ser-Leu-Pro-Arg，Ser-Pro-Ile-Leu-Gly-Tyr-Trp的肽的含量为51.8％。

[0080] 实施例3具有ACE抑制功能的牦牛骨蛋白肽的制备方法

[0081] (1)选用冷冻鲜牦牛骨1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎机将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量3.0倍的水在132℃条件下处理3小时，然后通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨高温蒸煮液，冷却到25℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

[0082] (2)将(1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到85℃，利用超声波发生器经超声波(频率为90kH)处理25分钟。

[0083] (3)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.3％复合蛋白酶一(碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)，在60℃条件下进行酶解反应1.0h；然后进行第二步利用0.3％复合蛋白酶二(胰蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；在90℃下保温20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；

[0084] (4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为3000道尔顿的膜将分子量小于3000道尔顿的蛋白肽分离出来。

[0085] (5)取分子量为小于3000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到经过凝胶分离的牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取16-18分收集的肽溶液；

[0086] (6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有ACE抑制功能的骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对骨胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Glu-Ile-Arg-Met-Leu，Thr-Val-Ser-Leu-Pro-Arg，Ser-Pro-Ile-Leu-Gly-Tyr-Trp的肽的含量为52.6％。

[0087] 实施例4牦牛骨蛋白肽血管紧张素转化酶(ACE)抑制能力的测定试验[0088] 试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨蛋白肽及样品4为实施例1的牦牛骨蛋白液经过冷冻干燥达到的牦牛骨蛋白粉。ACE抑制能力按照如下方法进行：

[0089] ACE抑制率的方法。用高效液相色谱可以在228nm下定量检测释放出的Hip量，从而计算出多肽的ACE抑制率。

[0090] 1、试剂的配置

[0091] pH8.3的磷酸盐缓冲溶液：用超纯水配制，其中含磷酸盐50mmol/L，NaCl 300mmol/L，调整pH到8.3；

[0092] ACE酶液：将2mL的磷酸盐缓冲液加入1U的ACE中，使其浓度变为0.5U/mL。

[0093] HHL溶液：使用磷酸缓冲液溶解HHL，使其终浓度为5mmol/L。

[0094] 样品溶液：称取适量样品，用磷酸盐缓冲液所需浓度的溶液。

[0095] 2、ACE抑制率测定的色谱条件

[0096] 检测波长：228nm；流速:1mL/min；流动相A:超纯水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；进样量:10μL，手动进样；

[0097] 3、测定ACE抑制活性的方法

[0098] 取120μL HHL底物溶液，加入20μL的样品混合均匀，在37℃恒温水浴中保温10min。然后加入10μL ACE酶液在37℃恒温水浴中反应30min，再加入150μL 1mol/L的HCl终止反应，得到反应液。该反应液利用HPLC进行分析，同时设置空白对照组。ACE抑制活性计算公式如下：

[0099] ACE抑制活性％＝(M-N)/M×100,

[0100] 式中，M为对照组中马尿酸的峰面积，N为添加的样品组中马尿酸的峰面积。

[0101] 4、半抑制浓度的测定

[0102] 按照ACE抑制肽体外检测方法测定其抑制活性，以浓度为横坐标，ACE抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算出IC50值。结果见表1。

[0103] 5、牦牛骨蛋白肽中分子量分布的测定：参照GB/T22729-2008方法测定。

[0104] 由表1可知，本发明制备的牦牛骨蛋白肽具有很好的ACE抑制活性，其IC50值小于0.32mg/mL，牦牛骨蛋白肽中分子量小于1000的达到90％以上。

[0105] 表1牦牛骨蛋白肽的ACE抑制活性实验结果

[0106]

[0107] 最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。