一种细胞浓度均匀性控制方法与装置

摘要

本发明公开一种对细胞培养液与细胞混合液混合并对混合后液体中的细胞浓度均匀性进行控制的方法与装置，细胞液混合罐底部固定连接于水平布置的振动台底板中心上方，细胞混合罐底部和顶部之间连接循环软管，循环软管装有蠕动泵，蠕动泵和细胞液混合罐顶部之间的循环软管通过采样软管连接图像采集装置顶部，图像采集装置壳体内的转盘盘面靠近边缘处开有一个上下贯通的圆形镂空孔，转盘初始位置时，圆形镂空孔在采样软管出口的正下方，在转盘逆时针旋转一个步进角停止时，采样软管中的第一个采样液滴滴在转盘的上表面上，在第一个采样液滴的正下方装有图像传感器；本发明能使细胞与培养液混合更充分且能判断细胞混合液的均匀度。

权利要求

1.一种细胞浓度均匀性控制装置，具有一个细胞液混合罐（9），顶部连接输入软管（14），其特征是：细胞液混合罐（9）底部固定连接于水平布置的振动台底板（2）中心上方，在旋转电机（8）带动下振动台底板（2）能以一侧边缘上下转动；细胞混合罐（9）底部和顶部之间连接一根循环软管（13），循环软管（13）装有蠕动泵（11），在蠕动泵（11）和细胞液混合罐（9）顶部之间的循环软管（13）上装有第一电磁捏阀（12），在蠕动泵（11）和细胞液混合罐（9）顶部之间的循环软管（13）通过采样软管（15）连接图像采集装置（17）顶部，采样软管（15）上装有第二电磁捏阀（16）；图像采集装置（17）外部是一个密封的壳体（31），壳体（31）内腔中设有转盘（24）、步进电机（21）和图像传感器（26），透明的转盘（24）水平布置且由步进电机（21）带动旋转，转盘（24）的盘面靠近边缘处开有一个上下贯通的圆形镂空孔（28），转盘（24）初始位置时，圆形镂空孔（28）在采样软管（15）出口的正下方，圆形镂空孔（28）的正下方是余液罐（29），在转盘（24）逆时针旋转一个步进角停止时，采样软管（15）中的第一个采样液滴（32）滴在转盘（24）的上表面上，在第一个采样液滴（32）的正下方装有图像传感器（26）且正上方装有单色光源（27）；步进电机（21）、图像传感器（26）、单色光源（27）、旋转电机（8）、蠕动泵（11）以及第一电磁捏阀（12）、第二电磁捏阀（16）分别连接MCU控制系统；细胞液混合罐（9）内部装有多块水平固定在混合罐（9）内壁上的折流板（33），折流板（33）从上至下布置，上下相邻的两块折流板（33）相互交错且分别固定连接于混合罐（9）相对面的内壁上。

2.根据权利要求1所述的一种细胞浓度均匀性控制装置，其特征是：振动台底板（2）的一侧通过合页（3）固定连接于墙壁（1），振动台底板（2）另一侧的下方装有振动台铰接座（4），铰接座（4）上固定一根水平的铰接轴（5），连接片（6）上端空套在铰接轴（5）上，连接片（6）下端铰接曲柄（7）一端，曲柄（7）另一端与旋转电机（8）同轴相连。

3.一种如权利要求1所述的细胞浓度均匀性控制装置的均匀性控制方法，其特征是采用以下步骤：

步骤1：转盘（24）在初始位置，从输入软管（14）输入细胞混合液和细胞培养液至细胞液混合罐9内，

步骤2：MCU控制系统控制控制旋转电机（8）转动，振动台底板（2）带动细胞液混合罐（9）内的液体振动混合；MCU控制系统控制蠕动泵（11）转动，打开第一电磁捏阀（12），关闭第二电磁捏阀（16），液体经循环软管（13）循环混合；

步骤3：MCU控制系统控制第一电磁捏阀（12）关闭，第二电磁捏阀（16）打开，循环软管（13）中的液体流向取样软管（15），取样软管（15）中的余液经圆形镂空孔（28）进入余液罐（29）中，蠕动泵（11）停止转动；

步骤4：MCU控制系统控制步进电机（21）正转，转盘（24）逆时针转动一个步进角度α，转盘（24）停在第一次采样位置，第二电磁捏阀（16）关闭，第一个采样液滴（32）滴落在转盘（24）上；

步骤5：步进电机（21）再正转α角度，转盘（24）停在第一次图像采集位置，打开单色光源（27），第一个采样液滴（32）正下方的图像传感器（26）采集第一个采样液滴（32）的图像，将图像传给MCU控制系统；

步骤6：MCU控制系统控制步进电机（21）反转，使转盘（24）转回初始位置；

步骤7：MCU控制系统对图像进行处理，判断第一个采样液滴中细胞浓度均匀性，若均匀，则关闭蠕动泵（11）、第一电磁捏阀（12）、第二电磁捏阀（16）、旋转电机（8）和单色光源（27）；若未均匀，则重复进行多次采样、图像采集和均匀性判断，直至细胞浓度均匀为止；第i次采样时， ，N是总采样次数，转盘（24）先逆时针转过i*α角度到达第i次采样位置，再逆时针转到（i+1）*α角度位置进行图像采集，然后反转（i+1）*α度回到初始位置。

4.根据权利要求3所述的均匀性控制方法，其特征是：步骤7 中，MCU控制系统将采集到的图像进行二值化处理得到二值图像，从二值图像中提取一个大正方形，将大正方形分成多个小正方形，从大正方形左上侧第一个小正方形开始扫描直至右下侧最后一个小正方形，计算每个小正方形的黑色像素点数P，若Pmin≤P≤Pmax，则判断细胞浓度均匀，Pmin和Pmax分别是设定的黑色像素点数的下限值和上限值。

说明书

一种细胞浓度均匀性控制方法与装置

技术领域

[0001] 本发明涉及液体混合领域，具体是对细胞培养液与细胞混合液进行混合，对混合后液体中的细胞浓度均匀性进行控制，均匀性满足要求的混合后液体才能进一步流入微流控芯片中进行检测。

背景技术

[0002] 微流控芯片将传统实验室的功能集中到一块小型的芯片中，实现生物和化学领域所涉及的反应、分离、检验等基本操作。微流控芯片的管道尺寸在μm量级，与细胞的大小可比，微流控芯片样品体积只需非常微小的几微升，因此流入微流控芯片的细胞混合液必须高效混合，才能使微流控芯片内的细胞均匀分布，以便实验与观察。而如何实现细胞培养液在微观尺度下的高效混合是微流控细胞检测领域中的难题，目前很少有针对细胞溶液的混合器，大部分还都是人工手动混合，或者使用液体混合器。但液体混合器并不适用于细胞溶液混合，因为细胞膜容易破裂，不能使用搅拌设备且外力不能过大，其次不能有过多空气混入，会污染细胞混合液，而且对于溶液是否充分混合，现有的混合器还无法检测。

发明内容

[0003] 为了克服上述缺点，本发明提出一种细胞浓度均匀性控制方法与装置，在对细胞无损坏的同时能自动混合细胞培养液与细胞混合液，并自动控制细胞浓度的均匀性。

[0004] 本发明提出的一种细胞浓度均匀性控制装置采用的技术方案是：具有一个细胞液混合罐，顶部连接输入软管，细胞液混合罐底部固定连接于水平布置的振动台底板中心上方，在旋转电机带动下振动台底板能以一侧边缘上下转动；细胞混合罐底部和顶部之间连接一根循环软管，循环软管装有蠕动泵，在蠕动泵和细胞液混合罐顶部之间的循环软管上装有第一电磁捏阀，在蠕动泵和细胞液混合罐顶部之间的循环软管通过采样软管连接图像采集装置顶部，采样软管上装有第二电磁捏阀；图像采集装置外部是一个密封的壳体，壳体内腔中设有转盘、步进电机和图像传感器，透明的转盘水平布置且由步进电机带动旋转，转盘的盘面靠近边缘处开有一个上下贯通的圆形镂空孔，转盘初始位置时，圆形镂空孔在采样软管出口的正下方且圆形镂空孔的正下方是余液罐，在转盘逆时针旋转一个步进角停止时，采样软管中的第一个采样液滴滴在转盘的上表面上，在第一个采样液滴的正下方装有图像传感器且正上方装有单色光源；步进电机、图像传感器、单色光源、旋转电机、蠕动泵以及第一电磁捏阀、第二电磁捏阀分别连接MCU控制系统。

[0005] 所述细胞浓度均匀性控制装置的均匀性控制方法采用的技术方案是采用以下步骤：

[0006] 步骤1：转盘在初始位置，从输入软管输入细胞混合液和细胞培养液至细胞液混合罐内；

[0007] 步骤2：MCU控制系统控制控制旋转电机转动，振动台底板带动细胞液混合罐内的液体振动混合；MCU控制系统控制蠕动泵转动，第一电磁捏阀打开，第二电磁捏阀关闭，液体经循环软管循环混合；

[0008] 步骤3：MCU控制系统控制第一电磁捏阀关闭，第二电磁捏阀打开，循环软管中的液体流向取样软管，余液经圆形镂空孔进入余液罐中，蠕动泵停止转动；

[0009] 步骤4：MCU控制系统控制步进电机正转，转盘逆时针转动一个步进角度α，转盘停在第一次采样位置，第二电磁捏阀关闭，第一个采样液滴滴落在转盘上；

[0010] 步骤5：步进电机再正转α角度，转盘停在第一次图像采集位置，打开单色光源，第一个采样液滴正下方的图像传感器采集第一个采样液滴的图像，将图像传给MCU控制系统；

[0011] 步骤6：MCU控制系统控制步进电机反转，使转盘转回初始位置；

[0012] 步骤7：MCU控制系统对图像进行处理，判断第一个采样液滴中细胞浓度均匀性，若均匀，则关闭蠕动泵、第一电磁捏阀、第二电磁捏阀、旋转电机和单色光源；若未均匀，则重复进行多次采样、图像采集和均匀性判断，直至细胞浓度均匀为止。

[0013] 本发明与已有方法和技术相比，具有如下优点：

[0014] 1、本发明由电机旋转带动振动台底板上下运动，进而使振动台底板中央的细胞混合罐振动，使细胞与培养液混合更充分。振动台的振动强度可通过控制旋转电机的转速控制。

[0015] 2、本发明设计的细胞混合罐是一个循环混合装置，通过蠕动泵的动力使细胞混合液流动，可以控制蠕动泵的挤压程度，使其不损伤细胞。细胞混合罐中安装有折流板，能增加流道路径。通过以上循环混合和增加流道的设计，使细胞混合液能混合更充分。

[0016] 3、本发明设计的细胞图像采集装置能观察细胞混合液的均匀度，因混合过程中的细胞是流动的，无法直接观测，且细胞是μm量级的肉眼无法发看清，因此需要采样液静止。图像采集的是细胞采样液的二维图像，如果细胞上下重叠则会影响均匀性判断。本发明设计的采样装置是将采样软管从图像采集装置顶部的小孔中通过后，从软管输出口将一滴液体从高处滴落在其正下方的光滑透明玻璃转盘上，使其形成一个面积较大，厚度较小，基本不出现细胞上下重叠现象的细胞采样液，再将采样液转到图像传感器正上方进行图像采集。图像采集是一种无透镜成像装置，其成像结构简单，组成无透镜成像平台的器件简单，且具有比显微镜更大的成像视野，也就是说，采用无透镜成像可一次对较大面积的对象进行观察，这使成像效率有了很大提高，且节约成本。虽然细胞是μm量级的肉眼无法发看清，而无透镜成像的空间分辨率可达1μm，满足了细胞检测的要求。

[0017] 4、由于图像传感器大小的限制，一个图像传感器只能采集一个液滴，为了能用一个图像传感器进行多次图像采集，本发明采用了转盘，软管输出口和图像传感器位置不动。每次采样时转动转盘，使软管输出口正下方是转盘空白处，采样液滴滴到空白处，然后再转动转盘将新滴下的液滴转到图像传感器正上方。此外，每次采样时，采样软管里的液体都是上一次采样的余液，所以采样前都必须把余液放掉。本发明在转盘一侧设置了一个镂空孔，采样前先通过步进电机将转盘转到初始位置，将余液滴到镂空孔正下方的余液罐中。液滴的滴落、转盘的转动、余液的排放和图像传感器的控制都由MCU控制系统控制，增加系统的自动化水平。

[0018] 5、在判断细胞浓度均匀性时，本发明采用的是简单地均匀性判别方法来确定样液是需要进一步混合还是已达到均匀。

附图说明

[0019] 图1是本发明一种细胞浓度均匀性控制装置的整体结构示意图；

[0020] 图2是图1中图像采集装置的内部结构放大图；

[0021] 图3是图2中转盘的转动过程俯视示意图；

[0022] 图4是图1在检测细胞浓度均匀性时对图像中的液滴细胞的检测划分示意图；

[0023] 图5是图4中的I局部放大图。

[0024] 附图中各部件的序号和名称：1.墙壁，2.振动台底板，3.合页，4.铰接座，5.铰接轴，6.连接片，7.曲柄，8.旋转电机，9.细胞液混合罐，10.固定框，11.蠕动泵，12.第一电磁捏阀，13.循环软管，14.输入软管，15.取样软管，16.第二电磁捏阀，17.图像采集装置，18.MCU控制盒，19.导线，20.图像采集装置导线，21.步进电机，22.步进电机的输出轴，23.螺丝，24.转盘，25.图像传感器固定台，26.图像传感器，27.单色光源，28.转盘镂空孔，29.余液罐，30.图像采集装置的底座，31.图像采集装置的壳体，32.第一个采样液滴，33.折流板，34.第二个采样液滴。

具体实施方式

[0025] 参见图1，本发明一种细胞浓度均匀性控制装置包括一个振动台底板2，振动台底板2水平布置，其一侧用合页3固定在墙壁1上，使固定振动台底板2可以以该侧边缘为圆心转动。振动台底板2另一侧的下方安装了振动台铰接座4，铰接座4上固定一根水平的铰接轴5，连接片6上端空套在铰接轴5上，连接片6下端铰接曲柄7一端，曲柄7另一端与旋转电机8同轴相连。连接片6上端能以铰接轴5为圆心上下转动。旋转电机8安放在振动台底板2的下方，当旋转电机8匀速转动时，带动曲柄7旋转，曲柄7旋转时带动振动台底板2另一侧上下运动，进而使振动台底板2振动。

[0026] 振动台底板2中心上方安装有细胞液混合罐9，细胞液混合罐9的底部外侧是固定在振动台底板2上的混合罐固定框10，混合罐固定框10用以防止振动台底板2振动时细胞液混合罐9滑出振动台底板2。细胞混合罐9底部和顶部之间连接一根循环软管13，在循环软管13上安装蠕动泵11。在蠕动泵11和细胞液混合罐9顶部之间的循环软管13上装有第一电磁捏阀12，用于控制循环软管13的通断。蠕动泵11置放在振动台底板2上方，位于细胞液混合罐9的旁侧，循环软管13先经过振动台底板2中心的孔通到振动台底板2下方，再通过蠕动泵
11正下方的振动台底板2上的孔，回到振动台底板2顶部。在蠕动泵11的作用下，细胞混合罐
9内的液体能经从下往上流回细胞混合罐9内形成循环。

[0027] 在蠕动泵11和细胞液混合罐9顶部之间的循环软管13上引出一个采样软管15，循环软管13通过采样软管15连接图像采集装置17，采样软管15连接于循环软管13和图像采集装置17顶部的混合液输入孔之间。在采样软管15上安装第二电磁捏阀16，用于控制采样软管15的通断。采样软管15的内径比循环软管13的内径小很多，且采样软管15的长度短于循环软管13的的长度，使采样软管15中的余液较少，尽量减少采样液的浪费。

[0028] 旋转电机8、蠕动泵11以及第一电磁捏阀12、第二电磁捏阀16分别通过控制导线19连接MCU控制盒18内部，MCU控制盒18放置在振动台底板2的下方。MCU控制盒18内部设有MCU控制系统，通过MCU控制系统分别控制旋转电机8、蠕动泵11的启停和第一电磁捏阀12、第二电磁捏阀16的通断。

[0029] 细胞液混合罐9顶部连接输入软管14，输入软管14呈Y型，用于细胞培养液与细胞混合液从外部输入细胞液混合罐9中。

[0030] 细胞液混合罐9内部安装有多块折流板33，折流板33水平固定在混合罐9的内壁上，多块折流板33从上至下布置，上下相邻的两块折流板33之间间隔一定的距离，上下相邻的两块折流板33相互交错且分别固定连接于混合罐9相对面的内壁上，折流板33的作用是用于增加从输入软管14输入细胞液混合罐9中的细胞培养液与细胞混合液的流道路径。

[0031] 参见图2的图像采集装置17，图像采集装置17外部是一个壳体31，壳体31密封不透光。壳体31内腔中设有底座30、转盘24、步进电机21、图像传感器26等。壳体31内腔底部是底座30。壳体31顶部有一个小孔，用于采样软管15垂直通入这个小孔，且只通入一小部分。第二电磁捏阀16安装在小孔正上方的采样软管15上，以控制采样软管15的通断且通过挤压已饱和的采样软管15，使一滴采样液滴落进壳体内。在该小孔的下方是一个转盘24，转盘24是无色透明的玻璃制成的圆盘形，以便进行无透镜图像采集。转盘24水平布置，转盘24的中心用步进电机21控制旋转。步进电机21的外壳固定在底座30上，步进电机21的输出轴22垂直向上，输出轴22通过螺丝23同轴固定连接转盘24的中心。步进电机21正转时，则带动转盘24逆时针旋转；步进电机21反转时，则带动转盘24顺时针转动。在转盘24的盘面靠近边缘处开有一个上下贯通的圆形镂空孔28。转盘24在初始位置时，转盘24没有转动，圆形镂空孔28在采样软管15出口的正下方。圆形镂空孔28的正下方是余液罐29，余液罐29固定在底座30上，采样软管15中的采样液能经圆形镂空孔28落进余液罐29中。当转盘24第一次逆时针旋转一个步进角停止时，圆形镂空孔28从采样软管15的正下方转开相同的角度，从采样软管15下落的采样液的第一个采样液滴32便滴在转盘24的上表面上，在第一个采样液滴32的正下方安装图像传感器26，图像传感器26底部用螺丝固定在传感器固定台25上，传感器固定台25底部用螺丝固定在底座30上。在第一个采样液滴32正上方安装一个单色光源27，单色光源27用螺丝固定在图像采集装置17的壳体31内的顶部。步进电机21、图像传感器26和单色光源27分别连接外部的MCU控制系统，经图像采集装置导线20从壳体31内引出后与MCU控制系统相连接，由MCU控制系统控制步进电机21转动，图像传感器26采集采样液滴图像，将图像信号发送给MCU控制系统。

[0032] 参见图1-2，为本发明细胞浓度均匀性控制装置工作的具体步骤如下：

[0033] 步骤1：取干净的玻璃制转盘24，用螺丝23固定在步进电机21的输出轴22上，合上图像采集装置7的壳体31，使转盘24处于初始位置，此时转盘24上的圆形镂空孔28在采样软管15出口的正下方和余液罐29的正上方，如图3所示的位置a，是转盘24在初始位置时的状态。从输入软管14输入细胞混合液和细胞培养液至细胞液混合罐9内，细胞液混合罐9内的液体来回途经折流板33后到达细胞液混合罐9中。同时，MCU控制系统开始工作，MCU控制系统设置参数i=0。

[0034] 步骤2：MCU控制系统控制控制旋转电机8转动，旋转电机8经曲柄7和连接片6带动铰接轴旋转，从而使振动台底板2开始振动，振动台底板2带动细胞液混合罐9内的液体振动混合。

[0035] 然后MCU控制系统控制蠕动泵11转动，第一电磁捏阀12打开，第二电磁捏阀16关闭，循环软管13开通，液体经循环软管13从细胞液混合罐9底部从顶部泵入细胞液混合罐9中，开始循环混合。MCU控制系统的内部定时器定时为t1，并开始计时。

[0036] 步骤3：当MCU控制系统的内部定时器到达定时t1后，蠕动泵11继续正转，但控制第一电磁捏阀12关闭，第二电磁捏阀16打开，此时停止循环混合，取样软管15开通，通过蠕动泵11的推力排放取样软管15内的余液，使循环软管13中的液体流向取样软管15，余液经取样软管15垂直向下进入图像采集装置17内，再从转盘24上的圆形镂空孔28进入余液罐29中。MCU控制系统的内部定时器定时为t2，并重新开始计时。MCU控制系统的内部定时器到达定时t2后，MCU控制系统设置参数i=i+1，控制蠕动泵11停止转动，停止余液排放，确保取样软管15中上一次的余液排空，取样软管15中是最新的细胞采样液。

[0037] 步骤4：然后，MCU控制系统控制步进电机21正转，使转盘24逆时针转动一次，一次转动角度为α，α是步进电机21的步进角。然后保持在这个位置，如图3中位置b所示，即转盘24从初始位置a经第一次逆时针转动后到达位置b的状态，位置b也是第一次采样时的位置。
然后，MCU控制系统控制第二电磁捏阀16关闭，通过第二电磁捏阀16的挤压力使细胞采样液滴落在转盘24上。由于重力的作用，且转盘24是光滑玻璃制成的，滴落的第一个采样液滴32在转盘24的上表面上向周围会扩散，便于图像的采集。

[0038] 步骤5：再控制步进电机21正转，使转盘24再逆时针转动角度为α，转盘24停在转过2α角的位置，即转盘24停在图3中位置c所示的状态，位置c是第一次采样后图像采集时的位置，此时，在第一个采样液滴32的正下方是图像传感器26，打开单色光源27，由图像传感器
26第一次采集第一个采样液滴32的图像，并将第一次采集到的图像传给MCU控制系统。

[0039] 步骤6：MCU控制系统控制步进电机21反转，使转盘24顺时针转动，转动角度为2α，转盘24转回到了初始位置，停在图3中位置d所示的状态，位置d是第一次图像采集完后又转回初始的位置，位置d和位置a的区别仅是位置d中的转盘24上留有第一个采样液滴32。

[0040] 步骤7： MCU控制系统对图像进行处理，判断采样液滴的均匀性。若已经均匀，则发送信息给MCU控制系统，MCU控制系统控制蠕动泵11关闭，第一电磁捏阀12、第二电磁捏阀16、旋转电机8、单色光源27都关闭，由混合人员取出细胞混合液进行后续操作。反之，若采样液滴未均匀，则进行下一步骤的第二次采样。

[0041] 步骤8：重复步骤4，所不同的是MCU控制系统控制转盘24逆时针转动的转动角度为2α，然后保持在这个位置，如图3中位置e所示，也是第二次采样的位置，即转盘24从初始位置a直接旋转到第二次采样的位置。然后，MCU控制系统控制第二电磁捏阀16关闭，通过第二电磁捏阀16的挤压力使细胞采样液滴落在转盘24上，由于重力的作用，滴落的第二个采样液滴34在第一个采样液滴32旁，两个采样液滴的中心在同一个圆周上并且相差α角度。

[0042] 步骤9：重复步骤5，转盘24逆时针转动角度α后停在了转过3α角的位置，即转盘24停在图3中位置f所示的状态，位置f是第二次采样后图像采集时的位置，此时，在第二个采样液滴34的正下方是图像传感器26，由图像传感器26第二次采集第二个采样液滴34的图像，并将第二次采集到的图像传给MCU控制系统。

[0043] 步骤10：MCU控制系统控制步进电机21反转，使转盘24顺时针转动角度为3α，转盘24转回到了初始位置，停在图3中位置g所示的状态，位置g是第二次图像采集完后又转回初始的位置，位置g和位置a的区别仅是位置d中的转盘24上留有二个采样液滴。

[0044] 如此循环往复地进行第三次、第四次直至第N次采样和图像采集，在第i次采样时，N是总采样次数， ，转盘24先逆时针转过i*α角度到达第i次采样的位置，再逆时转到（i+1）*α角度的位置进行图像采集，然后转盘24反转（i+1）*α度回到初始位置， MCU控制系统对图像处理，直至判断采样液滴均匀为止。

[0045] 转盘24上最多容纳y个液滴，且满足y=360/α-1，一般细胞循环混合2-3次后基本就会均匀，所以只需要进行2-3次液滴图像采集，也就是采样次数N应该满足N小于y，但如果采样次数N超过了y，则MCU控制系统提醒更换转盘24。

[0046] MCU控制系统对采集图像进行处理，对细胞浓度进行均匀性判断，如图4所示，所采集图像中液滴细胞的分布图，首先将采集到的图像进行二值化处理，得到二值图像，从图像中提取一个大正方形，大正方形的体积为V。将大正方形分成n个小正方形，小正方形的边长2
为3*m，m是细胞的平均直径，因此有V=n*(3*m) 。再参见图5所示，从大正方形左上侧第一个小正方形开始扫描直至右下侧最后一个小正方形，扫描每个小正方形，计算每个小正方形的黑色像素点数P，判断是否满足Pmin≤P≤Pmax，Pmin和Pmax分别是系统设定的黑色像素点数的下限值和上限值，下限值Pmin是为了防止一些非细胞的微小颗粒的干扰；上限值Pmax则是为了防止细胞浓度过高。若左上侧第一个小正方形有黑色像素点数P满足Pmin≤P≤Pmax，则继续向右扫描第二个小正方形。若有PPmax，则直接结束扫描，确定混合不均匀，需要继续混合。若PPmax则可以避免浓度过高，因为浓度过高则很可能抱团，就会有小正方形的黑色像素点数很高。用同样的方法扫描右侧第二个小正方形，如果满足Pmin≤P≤Pmax，则继续向右扫描第三个小正方形；否则直接结束扫描，确定混合不均。如此扫描下去，扫描到最右侧第x个小正方形仍未出现PPmax的小正方形，则从左侧第x+1个小正方形开始向右扫描，用相同的方法判断。如此扫描，直到整个大正方形均被扫描结束，但未出现PPmax的小正方形，则确定混合均匀,停止混合，否则继续混合。因为细胞分布是自由且不受控制的，不可能要求每个小正方形里的细胞个数相同，但一个区域中细胞个数过多或过少，则都能表明其混合还不够均匀。