酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

摘要

本发明提供了酶活性提高的β‑甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。本发明以能够在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris中进行高效表达的β‑甘露聚糖酶为基础，使用易错PCR方法对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法挑选出正突变，经过两轮易错PCR，最终获得4个酶活显著提高的突变体，分别为MAN‑M01、MAN‑M02、MAN‑M03和MAN‑M04，其酶活与原始β‑甘露聚糖酶相比，酶活分别提高了40%、58%、80%和64%，本发明获得了酶活性大大提高的β‑甘露聚糖酶，有利于实现其在商业中的应用，从而降低生产成本。

权利要求

1.β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体MAN-M01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

2.权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01的编码基因。

3.β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体MAN-M02由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第191位氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸、第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

4.权利要求3所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02的编码基因。

5.β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体MAN-M03由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第292位氨基酸由谷氨酸变为谷氨酰胺、第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

6.权利要求5所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03的编码基因。

7.β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体MAN-M04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第337位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺、第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

8.权利要求7所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04的编码基因。

9.含有权利要求2所述的MAN-M01的编码基因、或含有权利要求4所述的MAN-M02的编码基因、或含有权利要求6所述的MAN-M03的编码基因、或含有权利要求8所述的MAN-M04的编码基因的表达载体。

10.权利要求1、3、5和7任一项所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01、MAN-M02、MAN-M03或MAN-M04在用于制备动物饲料添加剂中的应用。

说明书

酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分。甘露聚糖在许多植物性饲料原料中含量很高，它提高了饲料的粘度，影响了动物对营养物质的吸收和利用，是一种抗营养因子。β-甘露聚糖酶是水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物是甘露寡糖和甘露多糖。β-甘露聚糖酶在饲料工业中作为一种饲料添加剂，能有效地降解饲粮中的甘露聚糖，提高饲料的消化率，提高动物生长性能，消除甘露聚糖的抗营养作用。β-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，而微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源。目前，应用于工业生产β-甘露聚糖酶的菌种也多为芽孢杆菌、曲霉、酵母等。野生型的β-甘露聚糖酶基因经过表达后已经能够获得较高的酶活力，而提高现有的β-甘露聚糖酶的酶活力和酶的性能对于其生产成本的控制效果的发挥有着至关重要的作用。利用蛋白质工程等技术改造β-甘露聚糖酶基因是提高β-甘露聚糖酶产量和性能的重要手段。

[0003] 易错PCR(error-prone PCR)技术是在利用Taq酶进行PCR扩增时，通过改变反应条件(如改变体系中4种dNTP的浓度等)，提高Taq酶的突变频率，从而向目的基因中以一定频率引入突变，然后根据需要筛选突变体。而连续易错PCR(sequential error prone PCR)策略可能会获得更好的突变效果，即将上一次PCR扩增得到的正突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供了酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过随机突变β-甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其酶活性，本发明的另一目的是提供了包含上述突变得到的β-甘露聚糖酶基因的重组载体。将突变得到的β-甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到重组酵母表达质粒。本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌和酵母菌。

[0005] 本发明的另一目的是提供了上述β-甘露聚糖酶突变体在制备动物饲料添加剂中的应用。所述动物为猪、鸡、鸭和牛，所述饲料为玉米-豆粕型日粮。

[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0007] 本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的突变体MAN-M01由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

[0008] 本发明提供了所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01的编码基因。

[0009] 本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述的突变体MAN-M02由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第191位氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸、第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

[0010] 本发明提供了所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02的编码基因。

[0011] 本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的突变体MAN-M03由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第292位氨基酸由谷氨酸变为谷氨酰胺、第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

[0012] 本发明提供了所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03的编码基因。

[0013] 本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04，所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的突变体MAN-M04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的β-甘露聚糖酶的第337位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺、第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸获得。

[0014] 本发明提供了所述的β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04的编码基因。

[0015] 本发明提供了含有所述的MAN-M01的编码基因、或含有所述的MAN-M02的编码基因、或含有所述的MAN-M03的编码基因、或含有所述的MAN-M04的编码基因的表达载体。

[0016] 本发明提供了β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01、MAN-M02、MAN-M03或MAN-M04在用于制备动物饲料添加剂中的应用。

[0017] 与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明通过对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的β-甘露聚糖酶使用易错PCR方法对β-甘露聚糖酶糖酶MAN-1基因进行改造，再使用高通量筛选方法挑选出正突变，经过两轮易错PCR，最终获得4个酶活显著提高的突变体，分别为MAN-M01、MAN-M02、MAN-M03和MAN-M04，其酶活与原始β-甘露聚糖酶相比，酶活分别提高了40％、58％、80％和64％，本发明获得的β-甘露聚糖酶糖酶突变体与野生型相比，突变体的酶活性得到显著提高，有利于实现其在商业中的应用，从而降低生产成本。

附图说明

[0018] 图1为β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01与野生型氨基酸序列比较结果；

[0019] 图2为β-甘露聚糖酶突变体MAN-M02与野生型氨基酸序列比较结果；

[0020] 图3为β-甘露聚糖酶突变体MAN-M03与野生型氨基酸序列比较结果；

[0021] 图4为β-甘露聚糖酶突变体MAN-M04与野生型氨基酸序列比较结果；

[0022] 图5为β-甘露聚糖酶突变体MAN-M01、MAN-M02、MAN-M03和MAN-M04与野生型的酶活比较测定结果。

具体实施方式

[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。

[0024] 实施例1：易错PCR(error–prone PCR)方法构建β-甘露聚糖酶MAN-1突变文库[0025] 来源于黑曲霉的β-甘露聚糖酶MAN-1由362个氨基酸组成(见SEQ ID NO：1)。根据已报道的MAN-1基因序列信息，全基因合成方法合成了β-甘露聚糖酶MAN-1全基因序列(如Genbank ID KM213619.1所示)。合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点，以便于和表达载体进行连接。采用MAN-1(核苷酸序列见SEQ ID NO：2)为模板扩增β-甘露聚糖酶糖酶MAN-1基因，使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)随机引入突变。

[0026] 所用引物为：

[0027] 5′-GCGCGAATTCCTGCCGAAAGCCTCCCCTGCACCG-3′(SEQ ID NO：7)；

[0028] 5′-TAAAGCGGCCGCTTAGGCGCTATCAATAGCAGCAAC-3′(SEQ ID NO：8)；下划线处分别为EcoR I和Not I酶切位点。

[0029] 反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火60s和72℃延伸1min20s，共30个循环。经过1％琼脂糖电泳后，使用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

[0030] 将目的片段用EcoR I和Not I双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 21a(+)载体(氨苄抗性基因)用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌BL21-DE3，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养，待平板上出现转化子后，挑取单克隆至96孔板，每孔中含有150uL LB培养基(含有1mM IPTG，50ng/mL氨苄青霉素)，同时每个孔板接种野生型基因表达菌株作为对照，30℃220rpm震荡培养12h，将孔板置于-20℃，反复冻融破壁，获得含有β-甘露聚糖酶的粗酶液。用排枪分别取20uL粗酶液加入到新的96孔板，加入20uLβ-甘露聚糖酶底物(角豆胶)反应后，用DNS法测定酶活力。

[0031] 取酶活力比野生型MAN-1高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选验证。最终筛选到1个突变体，为MAN-M01，酶活力高于野生型对照，挑取单克隆送基因测序公司测序。

[0032] 测序结果显示，如图1所示，本轮易错PCR获得了一个含S306P单点突变的突变体MAN-M01(其氨基酸序列为SEQ ID NO：3)。

[0033] MAN-M01：Mutation:306S→P(第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸，其对应的DNA序列由TCC变为CCA)。

[0034] 实施例2：第二轮易错PCR突变文库的构建和筛选突变文库的构建[0035] 将第一轮易错PCR方法筛选到的突变体MAN-M01提取质粒作第二轮易错PCR的模板，突变文库的构建过程，使用的引物，PCR反应条件，同实施例1。通过以上过程，同样获得了大量的突变体基因片段。将构建得到的突变体转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选高活性正突变时以MAN-M01为对照，其余操作与实施例2相同，取活性比突变型MAN-M01高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到3个酶活性提高的突变体，命名为MAN-M02、MAN-M03和MAN-M04。挑取单克隆送基因测序公司测序。

[0036] 测序结果显示，如图2所示，本轮易错PCR获得了S306P和C191R两点突变的突变体MAN-M02，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

[0037] MAN-M02：Mutation:191C→R(第191位氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸，其对应的DNA序列由TGT变为AGA)；

[0038] Mutation:306S→P(第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸，其对应的DNA序列由TCC变为CCA)。

[0039] 如图3所示，本轮易错PCR获得了S306P和E292Q两点突变的突变体MAN-M03，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5。

[0040] MAN-M03：Mutation:292E→Q(第292位氨基酸由谷氨酸变为谷氨酰胺，其对应的DNA序列由GAA变为CAA)；

[0041] Mutation:306S→P(第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸，其对应的DNA序列由TCC变为CCA)。

[0042] 如图4所示，本轮易错PCR获得了S306P和D337N两点突变的突变体MAN-M04，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

[0043] MAN-M04：Mutation:337D→N(第337位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺，其对应的DNA序列由GAT变为GGT)；

[0044] Mutation:306S→P(第306位氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸，其对应的DNA序列由TCC变为CCA)。

[0045] 实施例3：毕赤酵母工程菌株的构建

[0046] 使用实施例1中所述引物，以实施例1和实施例2获得的突变体作为模板进行PCR扩增，得到了4条两端带有EcoR I和Not I酶切位点的β-甘露聚糖酶突变体基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min20s，30个循环，72℃延伸10min。

[0047] 将上述克隆得到的β-甘露聚糖酶突变体基因片段和原始β-甘露聚糖酶基因MAN-1基因片段经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，和同样经过双酶切的pPIC9k载体相连接，构建表达载体pPIC9K-MAN-M01、pPIC9K-MAN-M02、pPIC9K-MAN-M03、pPIC9K-MAN-M04和pPIC9K-MAN-1。

[0048] 将以上表达载体用Sac I进行线性化，线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化收集后，通过电转化方法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。将在MD平板上生长出的菌落涂布到浓度依次逐渐升高(1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL)的遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的阳性转化子，得到毕赤酵母重组菌株。

[0049] 将5个基因的转化子分别命名为毕赤酵母MAN-M01(Pichia pastoris MAN-M01)、毕赤酵母MAN-M02(Pichia pastoris MAN-M02)、毕赤酵母MAN-M03(Pichia pastoris MAN-M03)、毕赤酵母MAN-M04(Pichia pastoris MAN-M04)和毕赤酵母MAN-1(Pichia pastorisMAN-1)，分别挑取每个基因的转化子转接于BMGY培养基中，30℃，220rpm振荡培养18h后，离心获得菌体，将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600＝1，30℃，
220rpm继续振荡培养，每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达4d后，将培养液离心获得上清，将上清液进行β-甘露聚糖酶活力测定。

[0050] β-甘露聚糖酶酶活力检测方法：

[0051] β-甘露聚糖酶活性的测定：吸取2mL经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入2mL浓度为0.6％(w/v)的甘露聚糖溶液，震荡3s，50℃下温育30min。加入5mL DNS试剂，震荡均匀，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容到25mL，在540nm处测定吸光度。

[0052] DNS试剂配制方法：称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌后水浴至45℃，缓慢加入100mL 0.2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。冷却至室温后，用去离子水定容至1000ml。此时溶液应清澈透明(如浑浊应重新配制)，储存在棕色瓶中并混合均匀，避光保存。室温下存放7天后标定标准曲线，有效期为6个月，每2个月重新标定曲线。

[0053] 酶活单位与定义：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

[0054] 酶活测定结果：如图5所示。按照上述方法测定得到毕赤酵母MAN-1发酵上清液的酶活为198U/mL，而毕赤酵母MAN-M01、毕赤酵母MAN-M02、毕赤酵母MAN-M03和毕赤酵母MAN-M04发酵上清液的酶活分别为278U/mL，312U/mL，356U/mL和325U/mL，酶活水平分别提高了40％、58％、80％和64％。

[0055] 实施例4：β-甘露聚糖酶的养殖应用实验

[0056] 4.1实验设计

[0057] 实验采用单因素完全随机设计，从150只AA肉公鸡中选取体重接近的36只，随机分成6个处理，每个处理设6个重复，每个重复1只鸡。分别设正对照组、负对照组和4个实验组。实验设计见表1，各实验组添加由本发明提供的β-甘露聚糖酶，各实验组的日粮组成及营养水平详见表2。动物自由采食和饮水；按常规免疫程序进行免疫，并记录肉仔鸡发病和死亡情况。

[0058] 表1.实验设计

[0059]分组 日粮
正对照组 玉米豆粕型基础日粮
负对照组 玉米豆粕型基础日粮基础上降低50Kcal/Kg能量。
实验1组 负对照组日粮+β-甘露聚糖酶250U/Kg
实验2组 负对照组日粮+β-甘露聚糖酶500U/Kg
实验3组 负对照组日粮+β-甘露聚糖酶1000U/Kg
实验4组 负对照组日粮+β-甘露聚糖酶1500U/Kg

[0060] 表2.各实验组基础日粮的组成与营养水平

[0061]

[0062]

[0063] 4.2样品处理与测定指标

[0064] 采用全收粪法，将每日的排粪样放在-20℃的冰柜中冷冻保存，实验期结束后将收集的全部4天的粪样混匀后，取其总鲜粪样的2/5放在70℃制成风干样品，待测干物质、能量和粗蛋白。

[0065] 能量的测定采用氧弹测热器测量、粗蛋白的测定采用凯氏定氮仪。

[0066] 4.3结果与分析

[0067] 表3.β-甘露聚糖酶对肉仔鸡平均采食量、干物质、能量和粗蛋白表观消化率的影响

[0068]

[0069] 添加不同剂量β-甘露聚糖酶对肉仔鸡平均采食量、干物质、能量和粗蛋白表观消化率的影响见表3。从表3可以看出，与负对照组相比，在降低50Kcal/Kg代谢能值玉米豆粕型日粮中分别添加250U/Kg、500U/Kg、1000U/Kg、1500U/Kg的β-甘露聚糖酶(实验1至4组)均可以不同程度提高饲料干物质、能量表观消化率，其中添加500U/Kg的β-甘露聚糖酶组(实验2组)饲料干物质、能量表观消化率较负对照组(降低50Kcal/Kg能量组)提高2.23％(P＜0.05)、2.18％(P＜0.05)，较正对照组提高1.77％和1.15％。添加不同剂量β-甘露聚糖酶对肉仔鸡粗蛋白代谢率和平均采食量没有影响(P＞0.05)。

[0070] 本实验在肉仔鸡玉米-豆粕型日粮中添加不同剂量的β-甘露聚糖酶，研究β-甘露聚糖酶对肉仔鸡平均采食量，干物质、能量和粗蛋白表观消化率的影响，探讨其在肉仔鸡日粮中的作用效果。实验结果表明在降低50Kcal/kg能量的玉米-豆粕型日粮中添加不同剂量的β-甘露聚糖酶可以不同程度提高饲料的干物质、能量表观消化率，从而提高饲料的利用率，降低饲养成本。

[0071] 本实施例4为了便于体现本发明所述的β-甘露聚糖酶的应用，并不限于肉鸡的应用，因为所述的β-甘露聚糖酶可以添加到基础日粮中，可以用于其他畜禽类的饲喂。通常可以在猪、兔等养殖过程中在其配合饲料中添加。

[0072] 对于仔猪来说，在其基础日粮中添加甘露聚糖酶可以有效提高仔猪的生产性能，表现为提高仔猪的日增重、降低料重比，从生化指标来看，甘露聚糖酶可以改善仔猪的免疫功能。对于育肥猪，在其基础日粮中添加甘露聚糖酶也可以提高其生产性能。近年来，作为非淀粉多糖酶的一种，甘露聚糖酶也开始应用于水产养殖，研究表明，水产饲料中添加复合甘露聚糖酶可以提高饲料的消化利用率,增强非特异免疫性能力，进而促进鱼类和虾类等水产动物的生长。

[0073] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。