一种生产Longiborneol的萜类合酶及其应用

摘要

本发明公开了一种生产Longiborneol的萜类合酶及其应用，属于合成生物学领域。通过提供一种合成Longiborneol的萜类合酶FGJ01056，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，与含有甲羟戊酸途径相关基因一起构建用于生产Longiborneol的菌株。对甲羟戊酸途径的来源于大肠杆菌XL1‑blue的atoB基因或idi基因过表达，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP，可以进一步促进生产Longiborneol。本发明的萜类合酶具有专一性和高效性，可以提高Longiborneol的产量，克服了原料投入量大而Longiborneol产率低的弊端，降低了研究成本，并且保证绿色环保。

权利要求

1.一种萜类合酶FgJ01056，其特征在于，所述萜类合酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的萜类合酶FgJ01056，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的萜类合酶FgJ01056的用途，用于生产Longiborneol。

4.一种生产Longiborneol的菌株，其特征在于，该菌株含有甲羟戊酸途径和Longiborneol合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括atoB、erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1  和idi基因；所述的Longiborneol合成的相关基因包括ispA和萜类合酶FgJ01056基因，所述的FgJ01056基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求4所述的生产Longiborneol的菌株，其特征在于，生产Longiborneol的菌株为含有pMH1、质粒pFZ81 和质粒pGB235的大肠杆菌；

所述的质粒pMH1 以pBBR1MCS 为骨架载体、启动子为lac 启动子，复制子为p15A，包含atoB、erg13 和thmg1 基因；

所述的质粒pFZ81 以pBBR1MCS-2 为骨架载体、启动子为lac 启动子、复制子为pBBR1MCS 复制子，包含erg12、erg8、mvd1 和idi基因；

所述的质粒pGB233以pET21为骨架载体、启动子为T7 启动子、复制子为pBR322 高拷贝复制子，包含FgJ01056、ispA和idi基因。

6.根据权利要求4或5所述的生产Longiborneol的菌株，其特征在于，该菌株过表达来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因或idi基因，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP。

7.权利要求6所述的生产Longiborneol的菌株在生产Longiborneol中的应用。

说明书

一种生产Longiborneol的萜类合酶及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产倍半萜化合物—Longiborneol的萜类合酶及其应用。

背景技术

[0002] 萜类化合物是含有异戊二烯单元的化合物的总称。它在自然界广泛存在，迄今为止，人们已从动物、植物以及微生物体内发现大约76000种萜类化合物。该化合物具有许多生理活性，所以被广泛应用于香水生产行业、保健品行业、农业生产领域以及医疗行业。

[0003] 萜类化合物的生产方法有天然提取、化学合成法和发酵法。但由于天然提取法生产成本居高不下，化学合成法可能的毒害作用和国际上对天然产物的日益推崇，人们开始大量研究利用微生物发酵法生产萜类化合物。

[0004] 生物体利用2-甲基-赤藓糖醇磷酸(MEP途径)或者甲羟戊酸途径(MVA途径)的异戊烯焦磷酸异构酶Idi合成IPP以及DMAPP，随后IPP以及DMAPP在异戊烯转移酶催化下合成GPP、FPP，GGPP以及GFPP等不同链长的异戊二烯单元。随后萜类合酶(terpene synthase，TS)可以这些不同链长的异戊二烯单元为底物，合成单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C120)、二倍半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)以及多萜。

[0005] 这其中，单萜和倍半萜为香水及香料化合物的主要来源，对有关这些化合物生物合成基因的挖掘及在萜类化合物微生物合成高产平台中进行代谢工程改造，将使得我们能够高效经济地实现这些高附加值产物的合成。

发明内容

[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明提供一种新型的萜类合酶FgJ01056及含有该萜类合酶基因的生产Longiborneol的菌株，以实现倍半萜化合物Longiborneol的微生物合成，提高产量、降低成本，为香料的制备提供更多的来源，减少毒害作用。

[0007] 本发明的第一方面，提供一种萜类合酶FgJ01056，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

[0008] 进一步地，本发明提供一种核酸分子，其编码上述萜类合酶FgJ01056，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0009] 本发明的第二方面，提供萜类合酶FgJ01056的用途，用于生产Longiborneol。

[0010] 本发明的第三方面，提供一种生产Longiborneol的菌株，该菌株含有甲羟戊酸途径(MVA途径)和Longiborneol合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括(1)将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB、(2)将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13、(3)将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1、(4)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、(5)将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、(6)将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1和(7)将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的Longiborneol合成的相关基因包括ispA和萜类合酶FgJ01056基因，所述的FgJ01056基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。合成的目标萜类化合物Longiborneol具有下列式(I)的结构：

[0011]

[0012] 所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因(AM946981.2)、idi(CP010152.1)和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13基因(CP005477.2)、tHMG1(CP005464.2)、erg12(CP008027.1)、erg8(CP005426.1)、mvd1(CP005554.2)。

[0013] 所述的萜类合酶FgJ01056基因来源于真菌禾谷镰刀菌J1-012(Fusarium graminearum J1-012)的FgJ01056，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

[0014] 优选的，所述的生产Longiborneol的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pGB235的大肠杆菌；所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、启动子为lac启动子，复制子替换为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.3所示；所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为质粒自带的pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.4所示；所述的质粒pGB233以pET21为骨架载体、启动子为T7启动子、复制子为质粒自带的高拷贝的pBR322复制子，包含FgJ01056、ispA、idi基因，pGB233的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.5所示。

[0015] 优选的，所述的生产Longiborneol的菌株原核表达时过表达来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因或idi基因，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP。

[0016] 本发明的第四方面是提供上述生产Longiborneol的菌株在生产Longiborneol中的应用。

[0017] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：本发明首次利用萜类合酶FgJ01056基因结合外源的甲羟戊酸途径获得了稳定生产Longiborneol的大肠杆菌。本发明的萜类合酶具有专一性和高效性，可以提高Longiborneol的产量，极大地克服了原料投入量大而Longiborneol产率低的弊端，降低了研究成本，并且保证绿色环保；此外，由于Longiborneol合酶抑制剂可以阻断Culmorin在真菌毒素中重要的协同增效毒力作用，通过对longiborneol的进一步研究我们可以进一步发掘出如何准确快速阻断culmorin的毒力作用。

附图说明

[0018] 图1为GC-MS检测FgJ01056以FPP为底物的体外反应和FgJ01056发酵(pGB233)，E.coli L1体外反应色谱图；

[0019] 图2为质粒pMH1结构示意图；

[0020] 图3为质粒pFZ81结构示意图；

[0021] 图4为质粒pGB148结构示意图；

[0022] 图5为质粒pGB232结构示意图；

[0023] 图6为质粒pGB233结构示意图；

[0024] 图7为菌株发酵产物的MS图；

[0025] 图8为化合物(I)的谱图，

[0026] 其中a为化合物(I)的结构示意图；b为碳谱图(13C NMR，CDCl3，101MHz)；c为氢谱图1
(H NMR，CDCl3，400MHz)。

具体实施方式

[0027] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

[0028] 实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0029] 【实施例1】体外验证萜类合酶的功能

[0030] 1、质粒pGB148的构建

[0031] 以反转录的Fusarium graminearum J1-012的cDNA为模板，用引物P27/P29(见表1)扩增获得FgJ01056的编码区并连接到质粒pET28a上获得质粒pGB148(图4)，用于纯化蛋白。

[0032] 2、蛋白的纯化

[0033] 将含有目的基因(SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)的表达载体pGB148转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，转化后挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养。按1％接种量转接至1L含相应抗生素的新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600约为0.6-0.8，降温至16℃，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃，220rpm培养16-18h。8 000rpm离心5min收集细胞，之后用30-40mL蛋白纯化缓冲液A(Buffer A：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，4mMβ-巯基乙醇，pH 7.6)彻底重悬细胞，超声破碎(脉冲5s，停顿8s，超声破碎5min)。4℃，12,000g离心30min以上，收集上清，4℃，20,000rpm离心1h，收集上清，用0.45μm滤膜进行过滤，加入6％buffer B(Buffer B：500mM咪唑加入到Buffer A中)使咪唑约为30mM，混匀备用。

[0034] 使用Bio-Rad的Biologic DuoFlow Chromatography System纯化组氨酸标签蛋白。蛋白分离柱加载至FPLC上加以控制，FPLC的流速始终为1.5mL/min，而样品自动上样的流速为2mL/min。所得到的上清样品用5mL Hitrap HP Ni-NTA柱子经Biorad做第一步纯化，该镍离子螯合柱先经过30mL(6个柱体积)缓冲液A(Buffer A：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，4mMβ-巯基乙醇，pH7.6)的平衡，然后通过自动进样器将准备好的30mL上清液加载到柱子上，再用20mL的缓冲液A(4个柱体积)对柱子进行清洗，这时启动缓冲液B(50mM Tris-HCl，
150mM NaCl，250mM Imidazole pH 7.6)的线性梯度，在100mL(20个柱体积)的流量内，缓冲液B由0％增长为100％，再用20mL(4个柱体积)100％的缓冲液B清洗柱子。根据紫外吸收收集并通过SDS-PAGE检测带有组氨酸标签的目的蛋白。挑选比较纯的组分收集起来，通过Millipore公司的离心浓缩管Amicon Centricon-10(分子量在10,000以下的会被滤出)来离心浓缩至2.5mL，然后通过Pharmacia公司的PD-10柱子脱盐并交换到缓冲液C(含有10％甘油的50mM磷酸缓冲液，pH 7.6)中，分装后液氮速冻并保存于-80℃冰箱。

[0035] 3、体外催化反应

[0036] 我们设立了以下体外酶促反应体系：向200μL终浓度为50mM含有10％甘油的PB buffer(pH 7.6)缓冲液中添加10μM纯化的蛋白，100μM的底物GPP、FPP或GGPP，以及2mM的Mg2+，30℃过夜反应。随后用等体积的正己烷萃取2次，合并有机相并用GC-MS检测生成的产物。

[0037] 萜类化合物检测所用的GC-MS为Thermo TRACE GC ULTRA气相色谱配备TSQ QUANTUM XLS MS，气相色谱柱为TRACE TR-5MS(30m×0.25mm×0.25um)。每次分析进样1μL，以高纯的氦气为载气，设置流速为1mL/min。GC条件为80℃维持1min，随后以10℃/min的速率升温到220℃，再在220℃维持15min。进样器和传输线温度分别设定为230℃和240℃。

[0038] 结果显示，FgJ01056表达的萜类合酶能够以FPP为底物，合成倍半萜产物(图1)。

[0039] 【实施例2】构建表达载体

[0040] 用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit纯化获得大肠杆菌XL1-blue基因组DNA和酿酒酵母INVSC1基因组DNA。

[0041] 质粒pMH1含有甲羟戊酸途径前三个基因：来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因(乙酰乙酰辅酶A硫酯酶，AM946981.2)，来源于酿酒酵母INVSC1的erg13(HMG-CoA synthase，CP005477.2)和tHMG1(HMG-CoA还原酶，删除了HMG1的跨膜区域，CP005464.2)。

[0042] 质粒pFZ81含有甲羟戊酸途径后四个基因：来源于酿酒酵母INVSC1的erg12(甲羟戊酸激酶，CP008027.1)，erg8(甲羟戊酸-5-磷酸激酶，CP005426.1)和mvd1(甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶，CP005554.2)，来源于大肠杆菌XL1-blue的idi(异戊烯焦磷酸异构酶，CP010152.1)基因。

[0043] 质粒pGB233含有合成倍半萜化合物的三个基因，分别是来源于真菌禾谷镰刀菌J1-012(Fusarium graminearum J1-012)的FgJ01056(SEQ ID NO：2)，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；来源于大肠杆菌XL1-blue的Idi；来源于大肠杆菌XL1-blue的ispA，能够以甲羟戊酸产物异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)为底物合成法尼基焦磷酸，用于倍半萜的合成。

[0044] 所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物见表1。

[0045] 表1引物序列表

[0046]

[0047]

[0048] 具体构建方法如下：

[0049] ①质粒pMH1的构建

[0050] 首先将pBBR1MCS质粒的复制子替换为来源于pMSD15质粒的p15A复制子。以质粒pBBR1MCS为模板用引物P1/P2进行扩增，同时p15A复制子用引物P3/P4扩增(引物序列见表1)，经PCR产物纯化后用Nanodrop测定DNA浓度，然后将20ng pCR扩增的p15A片段和等摩尔的pBBR1MCS片段混合，经过一轮PCR扩增，扩增条件为：98℃，2min预变性，然后30个PCR循环
98℃,20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。随后转化大肠杆菌XL1-blue获得质粒pBBR1MCS/p15A。

[0051] 用引物P5/P6以pBBR1MCS/p15A为模板扩增pMH1质粒骨架，同时用P7/P8、P9/P10、P11/P12为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pBBR1MCS/p15A扩增产物和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pMH1(图2)。

[0052] ②质粒pFZ81的构建

[0053] 用引物P13/P14以pBBR1MCS-2为模板扩增pFZ81质粒骨架，同时用P15/P16、P17/P18、P19/P20、P21/P22为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pBBR1MCS-2扩增产物和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pFZ81(图3)。

[0054] ③质粒pGB232的构建

[0055] 以反转录的Fusarium graminearum J1-012的cDNA为模板，用引物P27/P28扩增获得FgJ01056的编码区并连接到质粒pET21a上获得质粒pGB232(图5)。

[0056] ④质粒pGB233的构建

[0057] 用引物P23/P24以及P25/P26分别从E.coli BL21(DE3)基因组上扩增ispA以及idi基因，随后将ispA克隆至pET21a获得质粒pGB305；将idi克隆至pET21a(+)获得质粒pGB306。分别用XbaI/XhoI，SpeI/XhoI酶切质粒pGB305和pGB306，随后借助同尾酶将pGB306上酶切下来的idi片段连接至质粒pGB305从而获得质粒pGB308。随后用XbaI/XhoI从pGB308上酶切下来ispA-idi片段并借助同尾酶分别将其连接至质粒pGB232，获得质粒pGB233(图6)。

[0058] 【实施例3】大肠杆菌体内合成FgJ01056来源的倍半萜化合物

[0059] 为了生产倍半萜化合物，将甲羟戊酸途径的两个质粒pMH1和pFZ81同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81，命名为PS，随后将pGB233转化进入菌株PS中，获得菌株L1，随后分别挑取单克隆至10mL的LB培养基中(同时含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃，220rpm过夜培养，随后按1％接种量接种到新鲜的同一培养基中37℃，220rpm继续培养至OD600约为0.6～0.8时，降温至16℃并加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达18h后升温至28℃发酵72h，随后对其进行发酵及产物萃取，收集菌体及发酵液用等体积的正己烷萃取2次，减压蒸馏后甲醇复溶(加入甲醇前先加入少量DMSO助溶)，用于产物纯化。

[0060] 结果显示，含有FgJ01056的突变株E.coli L1能够以FPP为底物合成保留时间为11.95min的具有苔藓气味的化合物longiborneol(图1、7)。

[0061] 【实施例4】化合物鉴定

[0062] 1H NMR和13C NMR结果显示(图8)GC-MS保留时间为11.95min的化合物为白色至浅黄色结晶的longiborneol。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.74(td,J＝4.9,1.9Hz,1H),1.89–1.81(m,1H),1.83(d,J＝4.3Hz,1H),1.75–1.66(m,1H),1.47–1.38(m,2H),1.37–1.24(m,4H),1.23–1.16(m,1H),1.16–1.10(m,1H),0.95(d,J＝4.9Hz,1H),0.92(d,J＝1.4Hz,6H),0.85(s,3H),0.82(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ79.70,64.52,51.26,50.17,44.00,40.99,
35.10,33.37,30.29,29.26,28.85,26.33,22.65,22.46,12.99。倍半萜醇longiborneol的理论分子量为223.2056，高分辨质谱检测结果显示其实际分子量为223.2047。