本发明公开一种快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，包括步骤：制备实验样本；获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米植株冠层叶片的莽草酸含量；系统获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的高光谱数据，得到样本在可见近红外波段的吸光度；小波变换算法对提取的光谱数据进行去除噪声处理，经spxy选择建模集和预测集；利用所有的光谱建立玉米植株莽草酸含量与各个吸光度之间的最小二乘支持向量机回归分析模型；利用SPA方法获得特征光谱，基于特征光谱建立玉米植株莽草酸含量与各个吸光度之间的LSSVM回归分析模型。本发明预测精度高、操作简单、成本低，可实现转基因玉米草甘膦耐受性表型的快速无损检测。
1.一种快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，包括：S1：种植同等数量的转基因玉米和非转基因玉米，在玉米生长过程中，对一部分数量的转基因玉米和非转基因玉米喷施浓度为1080g a.e.ha-1的草甘膦溶液作为实验组，对剩余的转基因玉米和非转基因玉米喷施等量的水作为对照组；
S2：通过制定莽草酸标准曲线结合紫外分光光度法，获得受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的植株冠层叶片的莽草酸含量；
S3：利用高光谱成像系统，获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因玉米和非转基因玉米的植株冠层的高光谱数据，得到样本在可见近红外波段的吸光度；
S4：采用小波变换对高光谱数据预处理，去除噪声并剔除异常样本；
S6：通过SPXY方法将实验组和对照组内的样本分为建模集和预测集；
S7：以建模集内样本的特征波长的反射率值作为输入变量，步骤S2中测量得到的莽草酸含量作为输出变量，建立LSSVM回归分析模型；
Y＝56967.52*λ1+41852.64*λ2-55015.29*λ3+2881.984*λ4+9109.073*λ5-95879.78*λ6+
42727.5*λ7-18709.43*λ8+99941.35*λ9-132229.1*λ10+52584.88*λ11+107.4436*λ11+
38980.16*λ13-1926.05*λ14+22470.85*λ15-773.9245*λ16+194.71162其中，Y为莽草酸含量，λ1～λ16分别为高光谱数据中对应的玉米样本的反射率计算所得的吸光度。
S8：将预测集内样本的特征波长对应的吸光度输入所述的LSSVM回归分析模型，得出预测集内各样本的莽草酸含量。
2.如权利要求1所述的快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步骤S1中，分别种植120盆转基因玉米和非转基因玉米，其中转基因玉米内转入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因，在玉米生长至3叶期时，将草甘膦溶液置于便携式CO2高压喷雾器中，分别对80株转基因玉米和非转基因玉米植株进行喷施作为实验组，喷施压力为23lb pol-2，喷施量为120L ha-1，在同等条件下，分别对40株转基因玉米和非转基因玉米植株喷施等量的水作为对照组；
在喷施后的第2、4、6、8天各取转基因玉米和非转基因玉米各20株，喷施水的转基因玉米和非转基因玉米各10株进行实验，共有实验样本240个。
3.如权利要求1所述的快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步骤S2中，获取样本内莽草酸含量的具体过程如下：S2.1：获取莽草酸提取物：每个样本取0.1g叶片加入1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液中，在冰浴状态下迅速碾磨，于12000r/min离心10min，收集离心上清液；
S2.2：测定莽草酸提取物的OD值：取200μl的离心上清液加入微量滴定板上，加入2ml浓度为1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混匀后放置5min，在紫外分光光度计380nm下比色，记录OD值；
S2.3：测定莽草酸标准品的OD值并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线：将sigma莽草酸标准品10mg溶于1.5ml、0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用测定莽草酸标准品OD值，并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线，计算得到每个样本的莽草酸含量。
4.如权利要求1所述的快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步骤S5中，利用SPA算法进行特征波长选择，记XK(0)为初始迭代向量，N为需要提取的变量个数，光谱矩阵为j列，具体过程如下：记XK(0)为初始迭代向量，N为需要提取的变量个数，光谱矩阵为j列；
a：迭代开始前，任选光谱矩阵的1列j，把建模集的第j列赋值给Xj，记为XK(0)；
d：记k(n)＝arg(max(||Pxj||)，j∈s；
最后，提取出的变量为{xk(n)＝0……，N-1}。对应于每一个k(0)和N，分别建立多元线性回归分析模型，得到建模集的交互验证均方根，由最小的RMSECV值对应的k(0)和N就是最优值,其提取的变量即为特征变量。
5.如权利要求4所述的快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，提取的特征波长分别为：433.82nm，438.67nm，445.97nm，450.83nm，452.05nm，475.24nm
489.93nm，507.12nm，523.14nm，545.38nm，570.2nm，593.88nm，673.08nm，703.54nm，
6.如权利要求1所述的快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步骤S4中，小波变换的小波基函数为db3，分解层数为6。
7.如权利要求1所述的快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步骤S6中，应用SPXY方法进行样本划分时，选择欧氏距离最远的两个样本进入建模集，迭代过程中拥有最大或最小距离的待选样本随之被选入建模集。
一种快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法
技术领域
[0001] 本发明属于转基因作物的除草剂耐受性无损检测技术领域，具体涉及一种高光谱成像技术的转基因玉米草甘膦耐受性的检测方法。
背景技术
[0002] 随着现代农业的快速发展，影响农业生产发展的农田杂草得到广泛关注。研究表明，田间杂草影响农作物的品质，还会使作物的产量达到10％-100％不等的损失，严重威胁农业生产。目前，杂草的防除主要依靠喷施除草剂。草甘膦是上世纪70年代开发最为成功的一种除草剂。由于它杀草谱广且具有极好的内吸传导性能，能有效防除多年生深根恶性杂草，且对人畜安全，易分解、不污染环境，已成为目前应用最为广泛的除草剂。但由于其是非选择性除草剂，在防除杂草的同时杀死农作物，这就限制了它的使用范围和使用时间。因此培育出具有抗草甘膦特性的作物，能大大的提高除草效率降低生产成本。
[0003] 自从Comai等从鼠伤寒沙门氏菌中分离出抗草甘膦突变基因(aroA)以来，各国科研工作者对抗草甘膦转基因作物进行了广泛的研究。目前，全球已经成功研制多种抗草甘膦作物，其中玉米发展最为迅速。目前转基因耐草甘膦玉米的检测方法主要有生物测定法、生理生化法、核酸分析法、蛋白质分析法等。但这些方法对样本具有破坏性，耗费大量人力、物力，且时效性差，不利于推广应用。因此，急需一种快速无损检测技术对转基因玉米草甘膦耐受性进行检测，为转基因耐草甘膦玉米的培育提供技术支持。
[0004] 有研究表明喷施草甘膦后，植物体内莽草酸含量升高，因此，莽草酸积累是植物经草甘膦处理后最早出现的且相对敏感的生理指标。高光谱成像技术能够及时探测外界胁迫对作物内部生理的细微变化，简单、快速、精确地预测玉米受到胁迫后莽草酸的含量，较好的反映玉米草甘膦的胁迫程度，对转基因玉米草甘膦耐受性表型进行评价，具有广阔的应用前景。
发明内容
[0005] 鉴于原有生物技术检测的利弊现状，本发明提供一种快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，应用高光谱成像技术结合化学计量学方法对转基因玉米草甘膦耐受性进行检测，模型预测精度较高，为转基因玉米草甘膦耐受快速检测提供切实有效的检测手段。
[0006] 为了实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 一种快速获取转基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，包括：
[0008] S1:种植同等数量的转基因玉米和非转基因玉米，在玉米生长过程中，对一部分数量的转基因玉米和非转基因玉米喷施浓度为1080g a.e.ha-1的草甘膦溶液作为实验组，对剩余的转基因玉米和非转基因玉米喷施等量的水作为对照组；
[0009] S2：通过制定莽草酸标准曲线结合紫外分光光度法，获得受草甘膦胁迫不同天数的转基因和非转基因玉米植株冠层叶片的的莽草酸含量。
[0010] S3：应用高光谱成像系统，获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因和非转基因玉米植株冠层的高光谱数据，得到样本在可见近红外波段(380-1030nm)的吸光度。
[0011] S4：采用小波变换(wt)对高光谱数据预处理，去除噪声影响，同时剔除异常样本。
[0012] S5：对经过预处理的光谱数据进行特征波长选择，采用连续投影算法(SPA)进行特征波长选择。
[0013] S6：通过SPXY方法将实验组和对照组内的样本分为建模集和预测集；
[0014] S7：以建模集内样本的特征波长的反射率值作为输入变量，步骤S2中测量得到的莽草酸含量作为输出变量，建立LSSVM回归分析模型；
[0015] Y＝56967.52*λ1+41852.64*λ2-55015.29*λ3+2881.984*λ4+9109.073*λ5-95879.78*λ6+42727.5*λ7-18709.43*λ8+99941.35*λ9-132229.1*λ10+52584.88*λ11+
107.4436*λ11+38980.16*λ13-1926.05*λ14+22470.85*λ15-773.9245*λ16+194.71162[0016] 其中，Y为莽草酸含量，λ1～λ16分别为高光谱数据中对应的玉米样本的反射率计算所得的吸光度。
[0017] S8：将预测集内样本的特征波长对应的吸光度输入所述的LSSVM回归分析模型，得出预测集内各样本的莽草酸含量。
[0018] 在步骤S1中，分别种植120盆转基因(转入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因)和非转基因玉米，在玉米生长至3叶期时，将浓度为1,080g a.e.ha-1的草甘膦溶液置于便携式CO2高压喷雾器中，分别对80株转基因和非转基因玉米植株进行喷施作为实验组，喷施压力为23lb pol-2，喷施量为120L ha-1。在同等条件下，分别对40株转基因和非转基因玉米植株喷施等量的水作为对照组。在喷施后的第2、4、6、8天各取40株株喷施草甘膦的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各20株)，20株喷施水的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各10株)进行实验，共有实验样本240个。
[0019] 在步骤S2中，采用紫外分光光度法结合建立莽草酸标准曲线的方法测定实验样本莽草酸含量，具体包括：
[0020] S2.1：获取莽草酸提取物：每个样本取0.1g叶片加入1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液，在冰浴状态下迅速碾磨，于12000r/min离心10min，收集离心上清液。
[0021] S2.2：测定莽草酸提取物的OD值：取200μl的离心上清液加入微量滴定板上，加入2ml浓度为1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混匀后放置5min，在紫外分光光度计380nm下比色，记录OD值。
[0022] S2.3：测定莽草酸标准品的OD值并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线：将sigma莽草酸标准品10mg溶于1.5ml的0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用上述②步骤测定莽草酸标准品OD值，并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线。其中，OD值为吸光度，实验所测的OD值是用Gen5酶标仪(美国博腾仪器有限公司生产)来测量的，通过莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线，可计算得到每个样本的莽草酸含量。
[0023] 在步骤S3中，采用实验室高光谱成像系统,获取受草甘膦胁迫不同天数的转基因和非转基因玉米植株冠层在可见近红外波段(380-1030nm)的高光谱数据，物镜高度为258mm，相机曝光时间为3s，平台移动速度为19mm/s。
[0024] 在步骤S4中，wt将信号分解成高频的细节系数和低频的近似系数部分，噪声通常表现为高频部分，对高频部分进行阈值处理，即可有效的去除噪声的影响。本发明采用的小波基函数为db3，分解层数为6。
[0025] 在步骤S5中，SPA能够从光谱信息中充分寻找含有最低限度的冗余信息的变量组，有效的提取特征变量，提高建模速度和效率。具体算法如下。
[0026] 记XK(0)为初始迭代向量，N为需要提取的变量个数，光谱矩阵为j列；
[0027] a：迭代开始前，任选光谱矩阵的1列j，把建模集的第j列赋值给Xj，记为XK(0)(即k(0)＝j)；
[0028] b：把未选入的列向量位置的集合记为s；
[0029]
[0030] c：分别计算Xj对剩下的列向量的投影：
[0031] PXj＝xj-(xTjxk(n-1))xk(n-1)(xTk(n-1)xk(n-1))-1，j∈s，其中，xT表示相应列向量的转置，xk表示除Xj之外建模集中其他的列向量；
[0032] d：记k(n)＝arg(max(||Pxj||)，j∈s；
[0033] e：令xj＝Pxj，j∈s；
[0034] f：n＝n+1如果n＜N,回到b循环计算；
[0035] 最后，提取出的变量为{xk(n)＝0……，N-1}。对应于每一个k(0)和N，分别建立多元线性回归分析(MLR)模型，得到建模集的交互验证均方根(RMSECV)，由最小的RMSECV值对应的k(0)和N就是最优值，其提取的变量即为特征变量。
[0036] 利用SPA算法提取特征波长16个，分别为433.82nm，438.67nm，445.97nm，450.83nm，452.05nm，475.24nm 489.93nm，507.12nm，523.14nm，545.38nm，570.2nm，
593.88nm，673.08nm，703.54nm，723.93nm，801.01nm
[0037] 在步骤S6中，应用SPXY方法选择建模集144个，预测集72个。SPXY方法在样本划分时，把所有的样本都看作建模集候选样本,依次从中挑选样本进建模集。首先选择欧氏距离最远的两个样本进入建模集,在接下来的迭代过程中拥有最大最小距离的待选样本被选入建模集,以此类推,以达到所要求的样本数目。但其在样品间距离计算时将x变量和y变量同时考虑在内,够有效地覆盖多维向量空间,从而改善所建模型的预测能力。其距离公式如下：
[0038]
[0039] 式中，p，q均为建模集中的候选样本
[0040] 在步骤S7中，对转基因和非转基因玉米植株，基于全谱和特征波长建立LSSVM回归分析模型，结果如下表所示。
[0041]
[0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0043] (1)操作简单环保，避免了传统莽草酸含量检测所需化学试剂的使用及样品制备的繁琐过程，能快速有效地监测草甘膦胁迫的转基因玉米植株莽草酸含量，为反映玉米草甘膦的胁迫程度提供有效手段，具有良好的应用前景；
[0044] (2)系统结构简单，易于操作，可以实现作物表型的高通量检测，基本实现自动化检测。
附图说明
[0045] 图1是本发明基于高光谱成像技术的转基因玉米草甘膦耐受性表型检测的技术路线图。
[0046] 图2是本发明基于转基因玉米植株莽草酸LSSVM模型的回归分析结果。
具体实施方式
[0047] 下面结合附图和实施例，进一步详细描述。本具体实施方式是以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明以转双价基因(cry1Ab/cry2Aj-G10evo)的玉米为实施实例，其他的转基因作物加工品的识别可参照该实施例的方法进行。如图1所示，包括以下步骤：
[0048] 1.制备实验样本。种植120盆转基因(转入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因)和非转基因玉米，在玉米生长至3叶期时，将浓度为1,080g a.e.ha-1的草甘膦溶液置于便携式CO2高压喷雾器中，分别对80株转基因和非转基因玉米植株进行喷施作为实验组，喷施压力为23lb pol-2，喷施量为120L ha-1。在同等条件下，分别对40株转基因和非转基因玉米植株喷施等量的水作为对照组。在喷施后的第2、4、6、8天各取40株株喷施草甘膦的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各20株)，20株喷施水的玉米植株(转基因玉米和非转基因玉米各10株)进行实验，共有实验样本240个。
[0049] 2.采用紫外分光光度法结合制定莽草酸标准曲线的方法测定实验样本莽草酸含量。①获取莽草酸提取物：每个样本取0.1g叶片加入装有1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液的离心管中，在冰浴状态下迅速碾磨，于12000r/min离心10min，收集离心上清液。②测定莽草酸提取物的OD值：取200μl的离心上清液加入微量滴定板上，加入2ml浓度为1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混匀后放置5min，在紫外分光光度计380nm下比色，记录OD值。③测定莽草酸标准品的OD值并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线：将sigma莽草酸标准品10mg溶于1.5ml的0.25mol/LHCL中，取
0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/L HCL至1.0ml，用上述②步骤测定莽草酸标准品OD值，并绘制莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线。其中，OD值为吸光度，实验所测的OD值是用Gen5酶标仪(美国博腾仪器有限公司生产)来测量的，通过莽草酸标准品的浓度与OD值的标准曲线，可计算得到每个样本的莽草酸含量。
[0050] 3.应用高光谱成像系统对受草甘膦胁迫不同天数的的转基因和非转基因玉米样本及实验对照组进行光谱扫描，系统参数设置为：物镜高度258mm，相机曝光时间3s，平台移动速度7mm/s。
[0051] 4.采用小波变换(wt)预处理获得的光谱数据，小波基函数为db3，分解层数为6。
[0052] 小波变换是将信号分解成高频的细节系数和低频的近似系数部分，噪声通常表现为高频部分，对高频部分进行阈值处理，即可有效的去除噪声的影响。
[0053] 5.剔除异常样本24个，应用SPXY方法选择建模集和预测集，建模集样本144个，预测集样本72个。
[0054] 6.经wt预处理后得到的全谱光谱数据作为输入，建立玉米植株LSSVM回归分析模型。模型建模集和预测集的相关系数达到了0.972和0.867。
[0055] 7.基于连续投影算法(SPA)进行特征波长选择。SPA能够从光谱信息中充分寻找含有最低限度的冗余信息的变量组，有效的提取特征变量，提高建模速度和效率。利用SPA算法获取的特征波长分别为：433.82nm，438.67nm，445.97nm，450.83nm，452.05nm，475.24nm 489.93nm，507.12nm，523.14nm，545.38nm，570.2nm，593.88nm，673.08nm，703.54nm，
723.93nm，801.01nm
[0056] 8.SPA方法提取特征波长建立的LSSVM模型
[0057] 以SPA方法提取的特征波长的反射率值作为LSSVM模型的输入变量，实际测量得到的莽草酸含量作为输出变量，计算得到多元线性回归方程。所述的线性回归模型为：
[0058] Y＝56967.52*λ1+41852.64*λ2-55015.29*λ3+2881.984*λ4+9109.073*λ5-95879.78*λ6+42727.5*λ7-18709.43*λ8+99941.35*λ9-132229.1*λ10+52584.88*λ11+
107.4436*λ11+38980.16*λ13-1926.05*λ14+22470.85*λ15-773.9245*λ16+194.71162[0059] 方程中Y为莽草酸含量；λ1～λ16分别为高光谱中对应的玉米样本的反射率计算所得的吸光度。
[0060] 如图2所示，利用本发明的线性回归模型对受草甘膦胁迫不同天数的玉米植株莽草酸含量的LSSVM模型预测值与真实化学方法测量值进行了预测，结果显示建模集和预测集的相关系数达到了0.891和0.784。获得了较好的的预测精度。说明本发明的线性回归模型能够有效的检测受草甘膦胁迫的玉米莽草酸含量，为转基因玉米草甘膦耐受性的快速无损检测提供技术和理论支持。本发明大大缩短了检测的时间，减少了环境污染，降低了检测成本。
[0061] 以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
