DNA过氧化物模拟酶在2-羟基芴化学发光检测中的应用

摘要

本发明属于检测技术领域，提出DNA过氧化物模拟酶在2‑羟基芴的化学发光检测中的应用，所述DNA过氧化物模拟酶中的DNA具有G‑四联体核苷酸序列。本发明还提出一种应用DNA过氧化物模拟酶的2‑羟基芴化学发光检测方法。本发明提出DNA过氧化物模拟酶在2‑羟基芴的化学发光检测中的应用，建立、完善和发展了2‑羟基芴污染物的DNA生物分析方法，既可为环境健康风险评价及职业安全评估提供参考，同时开发一种新的高灵敏、低成本的检测方法，对完善现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。

权利要求

1.一种应用DNA过氧化物模拟酶的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将过氧化物模拟酶DNA酶与鲁米诺溶液混合并通过漩涡振荡器均匀；

(2)将待测样品2-羟基芴用缓冲溶液稀释后，与H2O2溶液混合均匀；

(3)将步骤(1)制备的混合溶液置于化学发光检测池内，然后将步骤(2)的混合溶液快速加入到化学发光检测池中，立即进行化学发光信号检测；

所述DNA过氧化物模拟酶中的DNA具有G-四联体核苷酸序列，

所述DNA过氧化物模拟酶中DNA的序列为PW17。

2.根据权利要求1所述的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，步骤(3)所得的混合发光体系中，DNA酶的浓度为1-300nM，鲁米诺的浓度为0.1-100μM，H2O2溶液的浓度为1-

10mM。

3.根据权利要求1所述的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，所述DNA过氧化物模拟酶通过以下方法制备：S1：将DNA用缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混匀，并于80-90℃的水浴中处理1-30min，取出，自然冷却，置于室温下自然冷却，备用；

S2：取步骤S1配制的DNA溶液加到离心管中，向其中加入缓冲溶液，孵育0.1-5h后，加入hemin，用漩涡振荡器混匀，放置0.1-10h，得到DNA过氧化物模拟酶。

4.根据权利要求3所述的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，所述的DNA过氧化物模拟酶中DNA与hemin的浓度比为1：1.0-1.5。

5.根据权利要求1～4任一项所述的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，构建的混合发光体系的pH值为7.5-12；所述缓冲溶液由Tris、KClO4、磷酸、柠檬酸、盐酸、氯化钾、KH2PO4，K2HPO4中的二种或三种配制而得。

6.根据权利要求5所述的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，所述混合发光体系的pH值为8.5-10，所述缓冲溶液由Tris和KClO4配制而得。

7.根据权利要求1～4任一项所述的2-羟基芴化学发光检测方法，其特征在于，利用标准梯度浓度的2-羟基芴制备混和发光体系，进行化学发光信号检测，构建标准曲线，将待测样品的检测值带入计算，对待测样品的2-羟基芴污染物进行定量分析。

说明书

DNA过氧化物模拟酶在2-羟基芴化学发光检测中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用于2-羟基芴的化学发光检测方法。

背景技术

[0002] 芴作为一种重要的化工原料，被广泛应用于医药，如止痛药、镇静剂、抗高血压药等、农药、除草剂、染料、有机玻璃等的合成，这也是人体芴暴露的重要途径。进入人体内的芴可以被体内酶代谢，在环境体系中亦可被微生物降解，其主要的降解产物为2-羟基芴。研究表明，由于2-羟基芴中羟基活化的作用而使得其同样具有代谢毒性。此外，人体内2-羟基芴的水平与芴的暴露水平具有正相关性，所以2-羟基芴也通常是一种被广泛用于评估芴暴露水平的生物标志物，可为人类健康风险预警及职业安全评估等提供数据支撑。因此，科研工作者需要迫切开发一种快速、简单、灵敏的2-羟基芴的检测方法，具有重要的研究价值。

[0003] 目前，用于检测2-羟基芴的方法已主要是采用大型仪器设备，如液相色谱法，液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法等。然而这些传统的分析方法还存在一些不足之处，如在进行色谱分析前需对样品进行处理，耗时较长。此外，昂贵的测试仪器以及在测试时需经培训的专业技术人员、仪器放置场地等条件也限制了仪器方法在野外分析样品时的应用。在这种情况下，开发简单、廉价、高效的2-羟基芴的检测方法势在必行。DNA生物传感器具有快速、简单、廉价、可原位测定等特点，在此基础上，Liang课题组首次设计了DNA酶修饰电化学生物传感器[1]，基于酶催化双氧水氧化2-羟基芴的作用，其生成的难溶物沉积于电极表面，导致膜电阻增大，以电化学阻抗法为分析手段成功实现了对2-羟基芴的检测。然而，采用电化学DNA生物传感法检测2-羟基芴仍存在一些不足之处，如在检测前需先制备DNA修饰电极，该修饰过程使检测周期变长，大大降低了分析检测的效率；同时电极修饰膜材料的性能、修饰膜的稳定性也会影响测定结果的准确性；电极修饰膜批次之间的差异、电极之间的差异等均会对测定结果产生影响。检测2-羟基芴的方法因而是分析化学和环境化学的难点研究课题，探寻一种更加快速、简单、准确、灵敏、高效的检测2-羟基芴的方法具有重要的意义，也有很大的挑战性。

[0004] 化学发光法具有样品制备周期短、检测快速、样品用量少、响应值强等优点，是一种比较理想的快检方法。随着对DNA认识的深入，科研工作者发现G-四联体DNA和hemin分子结合后可以形成G-四联体/hemin复合物，该复合物具有类过氧化物模酶的催化活性，被称之为类过氧化物模拟酶DNA酶，该DNA酶具有极强的催化活性，能够催化双氧水氧化鲁米诺产生化学发光[2]，基于此该DNA酶已被广泛应用于生物传感分析领域。但是到目前为止，尚未有基于过氧化物模酶DNA酶对2-羟基芴污染物进行光学检测的研究报道。

[0005] 参考文献

[0006] 1.Liang G.,Liu,X.H.,2015.G-quadruplex  based  impedimetric2-hydroxyfluorene  biosensor  using  hemin  as a  peroxidase  enzyme mimic.Microchim.Acta 182(13),2233-2240.

[0007] 2.Kosman,J.,Juskowiak,B.,2011.Peroxidase-mimicking DNAzymes for biosensing applications:A review.Anal.Chim.Acta 707,7-17.

发明内容

[0008] 针对本领域的不足之处，本发明的目的在于提出DNA过氧化物模拟酶在2-羟基芴的化学发光检测中的应用。

[0009] 本发明的第二个目的是提出一种应用DNA过氧化物模拟酶的2-羟基芴化学发光检测方法。

[0010] 实现本发明上述目的的技术方案为：

[0011] DNA过氧化物模拟酶在2-羟基芴的化学发光检测中的应用，其特征在于，所述DNA过氧化物模拟酶中的DNA具有G-四联体核苷酸序列。

[0012] G-四联体DNA和hemin分子结合后可以形成G-四联体/hemin复合物，该DNA酶具有催化活性高、生产成本低、易于制备及贮存、热稳定好等优点。我们以过氧化物模酶DNA酶-双氧水-鲁米诺三者共存体系为化学发光探针，实现了对2-羟基芴的化学发光法检测。

[0013] 进一步地，所述DNA过氧化物模拟酶中DNA的序列为PW17,Tel22,PS2.M，T30695，PS2.M2所示的序列中的一种。

[0014] 具体采用的DNA粉末可以为PW17DNA，其核苷酸序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGG。

[0015] 实际应用中，可使用其它具有连续G序列的DNA序列进行替换，例如:

[0016] Tel22:AGGGTTAGGG TTAGGGTTAG GG；

[0017] PS2.M:GTGGGTAGGGCGGGTTGG；

[0018] T30695:GGGTGGGTGGGTGGGT；

[0019] PS2.M2:GGGTAGGGCGGGTTGGGT。

[0020] 本发明还提出一种应用DNA过氧化物模拟酶的2-羟基芴化学发光检测方法，包括如下步骤：

[0021] (1)将过氧化物模拟酶DNA酶与鲁米诺溶液混合并通过漩涡振荡器均匀；

[0022] (2)将待测样品2-羟基芴用缓冲溶液稀释后，与H2O2溶液混合均匀；

[0023] (3)将步骤(1)制备的混合溶液置于化学发光检测池内，然后将步骤(2)的混合溶液快速加入到化学发光检测池中，立即进行化学发光信号检测。

[0024] 其中，步骤(3)所得的混合发光体系中，DNA酶的浓度为1-300nM，鲁米诺的浓度为0.1-100μM，H2O2溶液的浓度为1-10mM。

[0025] 优选地，所述DNA过氧化物模拟酶通过以下方法制备：

[0026] S1：将DNA用缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混匀，并于80-90℃的水浴中处理1-30min，取出，自然冷却，置于室温下自然冷却，备用；

[0027] S2：取步骤S1配制的DNA溶液加到离心管中，向其中加入缓冲溶液，孵育0.1-5h后，加入hemin，用漩涡振荡器混匀，放置0.1-10h，得到DNA过氧化物模拟酶。

[0028] 其中，所述的DNA过氧化物模拟酶中DNA与hemin的浓度比为1：1.0-1.5。

[0029] 优选地，构建的混合发光体系的pH值为7.5-12；所述缓冲溶液由Tris、KClO4、磷酸、柠檬酸、盐酸、氯化钾、KH2PO4，K2HPO4中的二种或三种配制而得。

[0030] 更优选地，所述比色检测体系的pH值为8.5-10，所述缓冲溶液由Tris和KClO4配制而得。

[0031] 所述的2-羟基芴化学发光检测方法，还包括步骤：利用标准梯度浓度的2-羟基芴制备混和发光体系，进行化学发光信号检测，构建标准曲线，将待测样品的检测值带入计算，对待测样品的2-羟基芴污染物进行定量分析。

[0032] 本发明的有益效果在于：

[0033] 本发明提出DNA过氧化物模拟酶在2-羟基芴的化学发光检测中的应用，建立、完善和发展了2-羟基芴污染物的DNA生物分析方法，既可为环境健康风险评价及职业安全评估提供参考，同时开发一种新的高灵敏、低成本的检测方法，对完善现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。

[0034] 本发明建立了以一种基于过氧化物模拟酶DNA酶-双氧水-鲁米诺化学发光体系检测2-羟基芴污染物的化学发光方法，该化学发光法具有周期短、制备简单、快速、成本低、样品用量少、灵敏性高等优点。为环境体系2-羟基芴污染物的快速检测提供了一种新的检测方法，这在完善现有2-羟基芴污染物检测技术方面具有重要意义，同时拓宽了过氧化物模拟酶DNA酶在分析化学领域中的应用。

附图说明

[0035] 图1为本发明实施例4中不同体系测定的化学发光CL光谱；a代表含有鲁米诺、H2O2、过氧化物模拟酶DNA酶缓冲溶液体系；b代表含有鲁米诺、H2O2、2-羟基芴、过氧化物模拟酶DNA酶缓冲溶液体系。

具体实施方式

[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0038] 下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。

[0039] 实施例1 G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶

[0040] 将固体DNA粉末用pH＝8.5，20mM Tris-HClO4缓冲溶液溶解，用漩涡振荡器混匀，并置于85℃的水浴锅中5min，取出，静置于室温下自然冷却。

[0041] 取适量上述DNA溶液加到离心管中，向其中加入pH＝8.5，20mMTris-KClO4溶液，稀释到5μmol/L，孵育2h后，加入6μmol/L的hemin，用漩涡振荡器混匀，放置2h，得到浓度为5μmol/L的G-四联体/hemin复合物，即为类过氧化物模酶DNA酶。

[0042] 实施例2

[0043] 用20mM,pH 9.0的Tris-KClO4缓冲溶液配制含300nM过氧化物模拟酶DNA酶及50μM鲁米诺的混合溶液，记为A液；配制20mMH2O2溶液，记为B液；混合配制含20mM H2O2及10μM 2-羟基芴的混合溶液，记为C液。

[0044] 1、取800μL上述缓冲溶液加入到测定池中，取A液100μL加入到化学发光检测池中，然后取100μL B液加入化学发光检测池中，进行化学发光测定(图1a线)。

[0045] 2、取800μL上述缓冲溶液加入到测定池中，取A液100μL加入到化学发光检测池中，然后取100μL C液加入化学发光检测池中，进行化学发光测定(图1b线)。

[0046] 从图1中可以看出，当测定体系中存在鲁米诺、双氧水、过氧化物模拟酶DNA酶时，化学发光信号(化学发光强度，CL intensity)非常强(a线)，说明过氧化物模拟酶DNA酶可以有效催化鲁米诺、双氧水体系产生化学发光；当含有2-羟基芴存在时，化学发光体系化学发光信号显著下降(b线)，从而可以根据信号的变化实现对2-羟基芴的检测。

[0047] 实施例3 pH对化学发光信号的影响

[0048] 设定不同pH值的混合发光体系，按照和实施例2相同的方法进行化学发光检测。其中，缓冲溶液分别为pH值为7.5的Tris-KCl缓冲液，pH值为8.5的Tris-KCl缓冲液、pH值为9.0的Tris-KClO4缓冲液、pH值为10.0的Tris-KCl缓冲液、pH值为12.0的Tris-KCl缓冲液。

[0049] 当混和发光体系的pH值为7.5-12时，可检测到明显发光信号。

[0050] 当所述混和发光体系的pH值为8.5-10时，发光信号较强。

[0051] 实施例4

[0052] 1、将实施例1制备的过氧化物模拟酶DNA酶与鲁米诺溶液使用漩涡振荡器混合均匀；

[0053] 2、将2-羟基芴用Tris-KClO4溶液稀释后，与H2O2溶液混合均匀；

[0054] 3、将步骤1所得的混合溶液置于化学发光检测池，然后快速加入步骤2所得的混合溶液于检测池，进行化学发光信号检测。

[0055] 其中，为了验证不同浓度2-羟基芴对发光信号的影响，通过加入不同体积的2-羟基芴溶液使得混和体系中的2-羟基芴浓度分别为0nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、50000nmol/L。同时混合发光体系中：G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶的浓度为30nM，K+的浓度为20mM，H2O2的浓度为2mM，鲁米诺的浓度为5μM。

[0056] 检测不同混合发光体系的化学发光强度，见表1。

[0057] 表1 与不同浓度2-羟基芴作用后化学发光强度

[0058]

[0059] 实施例5

[0060] 以9-羟基芴代替实施实例2中的2-羟基芴，其它条件如鲁米诺、H2O2、G-四联体/Hemin过氧化物模拟酶缓冲溶液等化学发光体系条件同实施例1，测定加入不同浓度9-羟基芴体系化学发光强度。化学发光强度变化值见表2。

[0061] 表2 与不同浓度9-羟基芴作用后化学发光强度变化

[0062]

[0063] 本实施例以同样方法检测结构相近的9-羟基芴，随着9-羟基芴浓度变化，发光强度变化明显不同于2-羟基芴，说明本方法对2-羟基芴有特异性，因而有很好的实际应用价值。

[0064] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。