一种用于LC‑MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法

摘要

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种用于LC‑MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法。所述方法包括：黄曲霉菌菌株培养；黄曲霉菌淬灭；黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取；黄曲霉菌代谢组分析。本发明采用冷甘油缓冲溶液结合快速抽滤法进行淬灭，以MeOH/DCM/ACN/EA/HCOOH混合溶液作为提取溶液，实现了高效提取不同极性化合物的目标，代谢组化合物覆盖率高；采用本发明所述方法对黄曲霉菌细胞代谢组学进行前处理可以保证代谢组学分析方法的可重复性、稳定性，降低检测结果的假阳性。

权利要求

1.一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）黄曲霉菌菌株培养：黄曲霉菌在固体培养基培养后，用无菌水将孢子从培养基上洗下，然后接种至液体培养基中扩培后得到黄曲霉菌样品；

（2）黄曲霉菌淬灭：将步骤（1）所得黄曲霉菌样品加入到冷甘油缓冲溶液淬灭剂中，快速混合涡旋、均质，然后置于低温条件下冷却，再通过真空抽滤快速过滤混合液，收集固体样品，冷冻干燥；

（3）黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取：将步骤（2）冷冻干燥所得黄曲霉菌细胞样品破碎，利用代谢组提取液进行提取处理，再经离心、膜过滤后得到代谢组提取溶液；

（4）黄曲霉菌代谢组分析：步骤（3）所得代谢组提取溶液进入HPLC-MS系统进行分析检测，然后依据所得谱图进行黄曲霉菌代谢组分析。

2.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（2）所述冷甘油缓冲溶液淬灭剂是由丙三醇和NaCl溶液以1：1 2：1的体积比混合而~成，所述冷甘油缓冲溶液淬灭剂预冷到-30℃以下使用，所述NaCl溶液的浓度为13.5 g/L。

3.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（2）所述黄曲霉菌样品和冷甘油缓冲溶液淬灭剂的体积比为1:4 1:6。

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4.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（2）所述低温条件下冷却为：混合液置于-20～-40℃条件下冷却3～5min。

5.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（2）所述冷冻干燥的时间为8 12小时。

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6.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（3）所述代谢组提取液是由甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯和甲酸按体积比20 30：~

20 30：20 30：20 30：1 2混合形成。

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7.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（3）中，以100 200mg黄曲霉菌细胞样品为基准，所述代谢组提取液的加入量为1~ ~

2mL。

8.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（3）所述细胞被膜破碎及代谢组提取为超声破碎提取，超声的功率为240W～300W，超声破碎提取的时间为15 20min。

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9.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（3）所述离心的转速为8000 10000rpm，离心时间为5 10min；所述膜过滤的滤膜为~ ~

0.22µm有机系滤膜。

10.根据权利要求1所述的用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，其特征在于，步骤（4）所述HPLC-MS系统分析检测的质谱条件为：离子源加热温度250 350℃，喷雾电~压：正离子模式下为3.5 4Kv，负离子模式下为3.0 3.5Kv，鞘气为30 40Arb，辅气为5~ ~ ~ ~

10Arb，离子传输毛细管温度为300 320℃。

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说明书

一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法

技术领域

[0001] 本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法。

背景技术

[0002] 黄曲霉代谢组是黄曲霉菌基因组、转录组、产毒机理等系统生物学研究中不可缺少一环，但目前的黄曲霉代谢组检测方法远远不能满足系统生物学研究的需要。前处理方法不佳严重影响了黄曲霉代谢组的覆盖率，往往含量较低且具有重要标志作用的代谢化合物没有被检测出来。

[0003] 黄曲霉代谢组研究属于微生物代谢组学研究范畴。微生物代谢组学是以微生物为研究对象，旨在研究细胞生长周期某一时刻胞内外所有小分子量的代谢物。微生物是地球上代谢最多样的生物体，细胞内酶系活跃，代谢物转换迅速，因此样品的培养条件是否稳定及样品的处理方法会显著影响分析结果的准确性。

[0004] 目前，微生物代谢组学正处于其发展初级阶段。由于微生物本身具有系统简单、基因组数据丰富及代谢网络和生理特性了解全面等系列优势，微生物代谢组学已经成功地应用于新药开发、突变体筛选、微生物代谢工程、微生物降解污染物以及微生物与宿主间的病理关系等方面。有关黄曲霉菌的代谢组学研究刚刚起步，Roze等人用代谢组学的方法比较了黄曲霉菌野生型菌株和VeA突变的菌株的代谢物，发现有些挥发性成分的变化，揭示了VeA调节分支氨基酸和乙醇代谢的功能。

[0005] 因此，发明一种黄曲霉代谢组的高效前处理方法和宽覆盖率检测方法，对于深入研究黄曲霉菌生理代谢及相关环境响应机制具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法。

[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

[0008] 一种用于LC-MS检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法，包括如下步骤：

[0009] (1)黄曲霉菌菌株培养：黄曲霉菌在固体培养基培养后，用无菌水将孢子从培养基上洗下，然后接种至液体培养基中扩培后得到黄曲霉菌样品；

[0010] (2)黄曲霉菌淬灭：将步骤(1)所得黄曲霉菌样品加入到冷甘油缓冲溶液淬灭剂中，快速混合涡旋、均质，然后置于低温条件下冷却，再通过真空抽滤快速过滤混合液，收集固体样品，冷冻干燥；

[0011] (3)黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取：将步骤(2)冷冻干燥所得黄曲霉菌细胞样品破碎，利用代谢组提取液进行提取处理，再经离心、膜过滤后得到代谢组提取溶液；

[0012] (4)黄曲霉菌代谢组分析：步骤(3)所得代谢组提取溶液进入HPLC-MS系统进行分析检测，然后依据所得谱图进行黄曲霉菌代谢组分析。

[0013] 上述方案中，所述黄曲霉菌菌株培养的方法为：黄曲霉接种在察氏固体培养基基上、置于18～38℃培养8～12d后，用无菌水将孢子从固体培养基上洗下，然后接种至沙氏液体培养基中、置于恒温摇床培养5～7天，得到黄曲霉菌样品。

[0014] 上述方案中，所述无菌水中含有体积分数为0.05～0.2％的吐温-80，所述沙氏液体培养基中黄曲霉菌的接种量为1×105～5×105个/mL；所述恒温摇床培养的温度为25～30℃，摇床转速为150～250r/min。

[0015] 上述方案中，步骤(2)所述冷甘油缓冲溶液淬灭剂是由丙三醇和NaCl溶液以1：1～2：1的体积比混合而成，所述冷甘油缓冲溶液淬灭剂预冷到-30℃以下使用，所述NaCl溶液的浓度为13.5g/L。

[0016] 上述方案中，步骤(2)所述黄曲霉菌样品和冷甘油缓冲溶液淬灭剂的体积比为1:4～1:6。

[0017] 上述方案中，步骤(2)所述低温条件下冷却为：混合液置于-20～-40℃条件下冷却3～5min。

[0018] 上述方案中，步骤(2)所述冷冻干燥的时间为8～12小时。

[0019] 上述方案中，步骤(3)所述代谢组提取液是由甲醇(MeOH)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EA(乙酸乙酯)和HCOOH(甲酸)按体积比20～30：20～30：20～30：20～30：1～2混合形成。

[0020] 上述方案中，步骤(3)中，以100～200mg黄曲霉菌细胞样品为基准，所述代谢组提取液的加入量为1～2mL。

[0021] 上述方案中，步骤(3)所述细胞被膜破碎及代谢组提取为超声破碎提取，超声的功率为240W～300W，超声破碎提取的时间为15～20min。

[0022] 上述方案中，步骤(3)所述离心的转速为8000～10000rpm，离心时间为5～10min。

[0023] 上述方案中，步骤(3)所述膜过滤的滤膜为0.22μm有机系滤膜。

[0024] 上述方案中，步骤(4)所述HPLC-MS系统分析检测的质谱条件为：离子源加热温度250～350℃，喷雾电压：正离子模式下为3.5～4Kv，负离子模式下为3.0～3.5Kv，鞘气为30～40Arb，辅气为5～10Arb，离子传输毛细管温度为300～320℃。

[0025] 本发明中，黄曲霉菌细胞代谢组化合物进入HPLC-MS系统进行分析，HPLC-MS系统分析检测采集到原始数据后，对原始数据分别进行峰对齐，提取，代谢物谱库检索得到原始峰表，然后进行代谢组分析；质谱原始数据文件提取峰表和代谢物定性通过SIEVE 3.0实现。

[0026] 本发明的有益效果：(1)本发明采用冷甘油缓冲溶液结合快速抽滤法对黄曲霉菌细胞进行淬灭，不仅能够快速淬灭细胞酶活性，使其定格在取样时的生理代谢时刻，以获取精确的代谢组数据；而且本发明淬灭方法不容易使黄曲霉菌细胞被膜破损，可较大程度维持细胞组织的完整性，具有重复性和准确性好的优点；(2)本发明以MeOH/DCM/ACN/EA/HCOOH混合溶液作为提取溶液，实现了高效提取不同极性化合物的目标，代谢组化合物覆盖率高；(3)本发明采用超声破碎提取工艺，通过一步法同步完成细胞被摸破碎和代谢组化合物提取，简化了前处理过程，节省了劳力与时间成本；(4)采用本发明所述方法对黄曲霉菌细胞代谢组学进行前处理可以保证代谢组学分析方法的可重复性、稳定性，降低检测结果的假阳性。

附图说明

[0027] 图1为18℃培养的黄曲霉菌代谢组质谱色谱图，其中Fig.1a为正离子采集模式，Fig.1b为负离子采集模式。

[0028] 图2为28℃培养的黄曲霉菌代谢组质谱色谱图，其中Fig.2a为正离子采集模式，Fig.2b为负离子采集模式。

[0029] 图3为38℃培养的黄曲霉菌代谢组质谱色谱图，其中Fig.3a为正离子采集模式，Fig.3b为负离子采集模式。

[0030] 图4为三种不同淬灭方式在激光共聚焦显微镜下的结果，其中(1)液氮淬灭，(2)冷甲醇淬灭，(3)冷甘油-缓冲溶液结合快速过滤淬灭。

具体实施方式

[0031] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0032] 实施例1

[0033] 18℃察氏固体培养基培养的黄曲霉菌代谢组分析前处理方法，包括如下步骤：

[0034] (1)黄曲霉菌株培养：黄曲霉菌接种刚在察氏固体培养基上，再18℃条件下培养8～12d后，用无菌水(含0.05～0.2％的吐温-80)将孢子从培养基上洗下；然后将黄曲霉孢子悬液接种到沙氏液体培养基中，接种量达到1×105～5×105个/毫升，将培养瓶置于25～30℃恒温摇床(150～250r/min)培养5～7天从而得到黄曲霉菌样品；

[0035] (2)采用冷甘油缓冲溶液结合快速抽滤法对黄曲霉菌细胞进行淬灭：

[0036] ①快速转移黄曲霉菌样品到一个含有冷甘油缓冲溶液淬灭剂(丙三醇和NaCl溶液以1:1体积比混合而成，＜-30℃)的离心管中，样品和淬灭剂体积比保持在1：4之间；

[0037] ②将样品和冷甘油缓冲溶液淬灭剂的混合液快速涡旋8～12s，均质，然后将混合液于-20℃冷却3～5min；

[0038] ③真空抽滤快速过滤混合液，收集固体样品，冰冻后置于冷冻干燥8小时；

[0039] (3)黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取：取1～2mL代谢组提取液加入100～200mg步骤(2)冷冻干燥后的菌球样品中，超声破碎提取处理15min，超声功率为240W，8000～10000rpm离心5～10min，0.22μm有机系滤膜过滤，得代谢组提取溶液；所述代谢组提取液的组分配比为：MeOH/DCM/ACN/EA/HCOOH的体积比＝24.5/24.1/24.7/25.7/1；

[0040] (4)黄曲霉菌代谢组分析：步骤(4)所得代谢组提取溶液进入HPLC-MS系统进行分析检测，质谱条件为：离子源加热温度250～350℃，喷雾电压：正离子模式下为3.5～4Kv，负离子模式下为3.0～3.5Kv，鞘气为30～40Arb，辅气为5～10Arb，离子传输毛细管温度为300～320℃，HPLC-MS采集到原始数据后，对原始数据分别进行峰对齐，提取，代谢物谱库检索得到原始峰表，进行代谢组分析。

[0041] 本实施例HPLC-MS采集到的18℃培养的黄曲霉菌代谢组质谱色谱图见图1。图1说明了采用本前处理方法处理18℃培养的黄曲霉菌，0～5分钟的极性化合物，5～10分钟的中等极性化合物，10～18分钟的弱极性化合物，全部通过前处理方法提取及色谱洗脱完成；在正离子采集模式和负离子采集模式下，质谱色谱图均显示出出峰多的特点。

[0042] 实施例2

[0043] 28℃察氏固体培养基培养的黄曲霉菌代谢组分析前处理方法，包括如下步骤：

[0044] (1)黄曲霉菌株培养：黄曲霉菌接种刚在察氏固体培养基上，再28℃条件下培养8～12d后，用无菌水(含0.05～0.2％的吐温-80)将孢子从培养基上洗下；然后将黄曲霉孢子悬液接种到沙氏液体培养基中，接种量达到1×105～5×105个/毫升，将培养瓶置于25～30℃恒温摇床(150～250r/min)培养5～7天从而得到黄曲霉菌样品；

[0045] (2)采用冷甘油缓冲溶液结合快速抽滤法对黄曲霉菌细胞进行淬灭：

[0046] ①快速转移黄曲霉菌样品到一个含有冷甘油缓冲溶液淬灭剂(丙三醇和NaCl溶液以3:2体积比混合而成，＜30℃)的离心管中，样品和淬灭剂体积比保持在1：5之间；

[0047] ②将样品和冷甘油缓冲溶液淬灭剂的混合液快速涡旋8～12s，均质，然后将混合液于-30℃冷却3～5min；

[0048] ③真空抽滤快速过滤混合液，收集固体样品，冰冻后置于冷冻干燥10小时；

[0049] (3)黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取：取1～2mL代谢组提取液加入到100～200mg步骤(2)冷冻干燥后的菌球样品中，超声破碎提取处理15～20min，超声功率为260w，
8000～10000rpm离心5～10min，0.22μm有机系滤膜过滤，得代谢组提取溶液；所述代谢组提取液的组分配比为：MeOH/DCM/ACN/EA/HCOOH的体积比＝24.5/24.1/24.7/25.7/1；

[0050] (4)黄曲霉菌代谢组分析：步骤(4)所得代谢组提取溶液进入HPLC-MS系统进行分析检测，质谱条件为：离子源加热温度250～350℃，喷雾电压：正离子模式下为3.5～4Kv，负离子模式下为3.0～3.5Kv，鞘气为30～40Arb，辅气为5～10Arb，离子传输毛细管温度为300～320℃，HPLC-MS采集到原始数据后，对原始数据分别进行峰对齐，提取，代谢物谱库检索得到原始峰表，进行代谢组分析。

[0051] 本实施例HPLC-MS采集到的28℃培养的黄曲霉菌代谢组质谱色谱图见图2。图2说明了采用本前处理方法处理28℃培养的黄曲霉菌，0～5分钟的极性化合物，5～10分钟的中等极性化合物，10～18分钟的弱极性化合物，全部通过前处理提取及色谱洗脱完成；在正离子采集模式和负离子采集模式下，质谱色谱图均显示出出峰多的特点。

[0052] 实施例3

[0053] 38℃察氏固体培养基培养的黄曲霉菌代谢组分析前处理方法，包括如下步骤：

[0054] (1)黄曲霉菌株培养：黄曲霉菌接种刚在察氏固体培养基上，再38℃条件下培养8～12d后，用无菌水(含0.05～0.2％的吐温-80)将孢子从培养基上洗下；然后将黄曲霉孢子悬液接种到沙氏液体培养基中，接种量达到1×105～5×105个/毫升，将培养瓶置于25～30℃恒温摇床(150～250r/min)培养5～7天从而得到黄曲霉菌样品；

[0055] (2)采用冷甘油缓冲溶液结合快速抽滤法对黄曲霉菌细胞进行淬灭：

[0056] ①快速转移黄曲霉菌样品到一个含有冷甘油缓冲溶液淬灭剂(丙三醇和NaCl溶液以2:1体积比混合而成，＜30℃)的离心管中，样品和淬灭剂体积比保持在1：6之间；

[0057] ②将样品和冷甘油缓冲溶液淬灭剂的混合液快速涡旋8～12s，均质，然后将混合液于-20～-40℃冷却3～5min；

[0058] ③真空抽滤快速过滤混合液，收集固体样品，冰冻后置于冷冻干燥8～12小时；

[0059] (3)黄曲霉菌细胞被膜破碎及代谢组提取：取1～2mL代谢组提取液加入到100～200mg步骤(2)冷冻干燥后的菌球样品中，超声破碎提取处理15～20min，超声功率为300w，
8000～10000rpm离心5～10min，0.22μm有机系滤膜过滤，得代谢组提取溶液；所述代谢组提取液的组分配比为：MeOH/DCM/ACN/EA/HCOOH的体积比＝24.5/24.1/24.7/25.7/1；

[0060] (4)黄曲霉菌代谢组分析：步骤(4)所得代谢组提取溶液进入HPLC-MS系统进行分析检测，质谱条件为：离子源加热温度250～350℃，喷雾电压：正离子模式下为3.5～4Kv，负离子模式下为3.0～3.5Kv，鞘气为30～40Arb，辅气为5～10Arb，离子传输毛细管温度为300～320℃，HPLC-MS采集到原始数据后，对原始数据分别进行峰对齐，提取，代谢物谱库检索得到原始峰表，进行代谢组分析。

[0061] 本实施例HPLC-MS采集到的38℃培养的黄曲霉菌代谢组质谱色谱图见图1。图3说明了采用本前处理方法处理38℃培养的黄曲霉菌，0～5分钟的极性化合物，5～10分钟的中等极性化合物，10～18分钟的弱极性化合物，全部通过前处理方法提取及色谱洗脱完成；在正离子采集模式和负离子采集模式下，质谱色谱图均显示出出峰多的特点。

[0062] 本发明还对黄曲霉菌淬灭方法进行了比较：为获取一份有生物学意义的代谢组学数据，微生物代谢组样品准备第一步应及时淬灭细胞内外酶活性，而理想的淬灭技术应包括两个基本原则：(1)快速淬灭酶活，(2)尽可能维持细胞组织的完整性。

[0063] 本发明考察了三种不同低温淬灭方式是否会造成黄曲霉等丝状真菌胞代谢物泄漏，包括液氮淬灭法(＜-196℃)，冷甲醇(＜-30℃)淬灭，冷甘油缓冲溶液(＜-30℃)结合快速过滤法，结果如图4所示，其中(1)液氮淬灭，(2)冷甲醇淬灭，(3)冷甘油-缓冲溶液结合快速过滤淬灭。溴化丙啶(PI)染色原理是失活的细胞被膜受到损伤后，PI可进入细胞并与细胞内DNA结合，在荧光显微镜下可以观察到结合处发红光，因此基于此原理研究细胞在不同淬灭溶剂处理后其细胞被膜破损情况。由图4可见，以冷甲醇和液氮淬灭方式对黄曲霉菌细胞被膜会造成轻微的损伤，造成细胞内代谢物外流，从而降低实验的重复性和准确性；冷甘油缓冲溶液淬灭具有较温和的特性，不易使细胞被膜破损，是一种有前景的淬灭溶剂，但因甘油密度大，丝状真菌质量轻，容易悬浮而不易使丝状真菌体与淬灭剂离心分离，本发明采用冷甘油缓冲溶液淬灭剂结合快速抽滤分离，克服了冷甘油密度大，黄曲霉菌浮于上层不易离心分离的缺陷。本发明中将冷甘油缓冲液淬灭结合快速过滤法分离作为黄曲霉菌全组分代谢组学取样淬灭方法。

[0064] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。