一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒及其检测方法转让专利
申请号 : CN201710399343.3
文献号 : CN107085110A
文献日 : 2017-08-22
发明人 : 余跃飞 , 王小中 , 黄龙
申请人 : 江西乐成生物医疗有限公司
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒,其特征在于,包括捕获抗体,所述捕获抗体是L选择素制得的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒,其特征在于,所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下:S1:抗原的制备;把L选择素的基因克隆到真核表达载体,并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达,纯化后得到抗原;
S2:捕获抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物,得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。
3.根据权利要求1所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括检测抗体,所述检测抗体为L选择素制得的多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒,其特征在于,所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下:S1:抗原的制备;把L选择素的基因克隆到真核表达载体,并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达,纯化后得到抗原;
S2:检测抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物,得到相应的多克隆抗体为检测抗体。
5.根据权利要求1或2所述的一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒,其特征在于,所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内。
6.一种根据权利要求5所述的用于甲状腺癌体外诊断试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:抗原的制备:将L选择素基因克隆到真核表达载体,并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达,纯化后得到所需的抗原;
S2:捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体,所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体;
S3:检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体,所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体;
S4:捕获抗体包被:
S4.1:用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔;
S4.2:封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜;
S4.3:弃去包被液,并用洗涤液洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入200μlPBST,除去洗涤液和剩余的液滴,晾干放于4℃环境中;
S5:封闭:每孔添加200μl封闭缓冲液,封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
7.一种根据权利要求5所述的用于甲状腺癌体外诊断试剂盒的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:抗原的制备:将L选择素基因克隆到真核表达载体,并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达;
S2:捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体,所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体;
S3:检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体,所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体;
S4:捕获抗体包被:
S4.1:用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔;
S4.2:封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜;
S4.3:弃去包被液,并用洗涤液洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入200μl PBST,除去洗涤液和剩余的液滴,晾干放于4℃环境中;
S5:封闭:
S5.1:在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液,封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点;
S5.2:封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
S6:加样:
S6.1:将100μl样品添加到每个孔,在37℃孵育60分钟;
S6.2:弃去样品,并洗涤微量滴定板三次,每次在微孔中加入200μl PBST;
S6.3:将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔;
S6.4:封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
S6.5:用PBST洗涤微量滴定板四次;
S6.6:添加100μl标记二抗;
S6.7:封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
S6.8:用PBST 洗涤微量滴定板四次;
S7:检测:
S7.1:将TMB溶液添加到每个孔,孵育15-30分钟,添加等体积的终止液,然后在450nm处读取光密度;
S7.2:由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线,浓度标在X轴(对数标度)上,而吸光度标在Y轴(线性标度)上。
8.通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
说明书 :
一种用于甲状腺癌体外诊断试剂盒及其检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
S2:捕获抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物,得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。
S2:检测抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物,得到相应的多克隆抗体为检测抗体。
S1:抗原的制备:将L选择素基因克隆到真核表达载体,并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达,纯化后得到所需的抗原;
S2:捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体,所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体;
S3:检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体,所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体;
S4:捕获抗体包被:
S4.1:用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔;
S4.2:封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜;
S4.3:弃去包被液,并用洗涤液洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入200μl PBST,除去洗涤液和剩余的液滴,晾干放于4℃环境中;
S5:封闭:每孔添加200μl封闭缓冲液,封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
S2:捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体,所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体;
S3:检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体,所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体;
S4:捕获抗体包被:
S4.1:用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔;
S4.2:封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜;
S4.3:弃去包被液,并用洗涤液洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入200μl PBST,除去洗涤液和剩余的液滴,晾干放于4℃环境中;
S5:封闭:
S5.1:在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液,封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点;
S5.2:封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
S6:加样:
S6.1:将100μl样品添加到每个孔,在37℃孵育60分钟;
S6.2:弃去样品,并洗涤微量滴定板三次,每次在微孔中加入200μl PBST;
S6.3:将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔;
S6.4:封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
S6.5:用PBST洗涤微量滴定板四次;
S6.6:添加100μl标记二抗;
S6.7:封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
S6.8:用PBST 洗涤微量滴定板四次;
S7:检测:
S7.1:将TMB溶液添加到每个孔,孵育15-30分钟,添加等体积的终止液,然后在450nm处读取光密度;
S7.2:由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线,浓度标在X轴(对数标度)上,而吸光度标在Y轴(线性标度)上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
附图说明
图3是本发明用于甲状腺癌诊断试剂盒的对临床血清标本的诊断及鉴别诊断对比说明图;
图4是本发明甲状腺癌诊断试剂盒敏感性的检测;
图5是本发明甲状腺癌诊断试剂盒特异性的检测;
图6是本发明用于甲状腺癌诊断试剂盒在甲状腺癌治疗前后血中检测到L选择素的变化对比图。
具体实施方式
第二步:检测抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物,得到相应的多克隆抗体为检测抗体,哺乳动物是小鼠及兔子,优选兔子。
第二步:捕获抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体,单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体;
第三步:检测抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体,多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体;
第四步:捕获抗体包被,具体步骤如下:
(1)用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被于微量滴定板的孔;
(2)用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜;
(3)弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体),并用洗涤液洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入200μl PBST(磷酸盐吐温缓冲液),在水槽上方轻轻甩动微量滴定板,除去洗涤液,在纸巾上轻拍微量滴定板,除去剩余的液滴,晾干放于4℃环境中备用;
其洗涤液为PBS(磷酸盐缓冲液)中加入一定量的Tween20,所述Tween20的质量百分比浓度为0.05%;
第五步:封闭;首先在微量滴定板的每孔添加200μl封闭缓冲液(为含1.2%BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸盐缓冲液)),用于封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点;然后,用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时。
第二步:捕获抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体,单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体;
第三步:检测抗体的制备;将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体,其中,多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体;
第四步:捕获抗体包被,具体方法如下:
(1)用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔;
(2)用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜;
(3)弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体),并用洗涤液洗涤微量滴定板两次,每次在微孔中加入200μl PBST(磷酸盐吐温缓冲液,可以是含0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液),在水槽上方轻轻甩动微量滴定板,除去洗涤液,在纸巾上轻拍微量滴定板,除去剩余的液滴,晾干放于4℃环境中备用;所述洗涤液为PBS(磷酸盐缓冲液)中加入一定量的Tween 20,Tween20的质量百分比浓度为0.05%;
第五步:封闭;首先,在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液(1.2%BSA/PBS),封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点;然后,用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
第六步:加样,具体方法如下:
(1)将100μl适当稀释(稀释20倍)的样品添加到每个孔,在37℃下孵育60分钟,要得到准确的定量结果,通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号,每个酶标板都必须测定标准品(两重测定或三重测定)和空白样,以确保准确性;
(2)弃去样品,并洗涤微量滴定板三次,每次在微孔中加入200μl PBST(磷酸盐吐温缓冲液);
(3)将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔;
(4)用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
(5)用PBST洗涤微量滴定板四次;
(6)添加100μl标记二抗,其在使用前便已在PBS中稀释10000倍(1:10000),其标记二抗可以为HRP标记羊抗兔;
(7)用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时;
(8)用PBST洗涤微量滴定板四次;
第七步:检测;首先,将TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液添加到每个孔,孵育15-30分钟,添加等体积的终止液(2MH2SO4),然后用酶联免疫检测仪在450nm处读取光密度;然后,由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线,浓度标在X轴(对数标度)上,而吸光度标在Y轴(线性标度)上,通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
1.2%BSA。