羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用

摘要

一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用。该特异性探针底物为1,3‑二氯‑7‑羟基‑9,9‑二甲基‑2(9H)‑吖啶酮(简称DDAO)的芳香酯(简称DDAE)。该底物可用于羧酸酯酶2(CE2)活性快速定量检测，以及羧酸酯酶2抑制剂与激活剂的快速筛选与评估。羧酸酯酶2活性快速定量检测流程如下：选择DDAE水解反应为探针反应，在含有羧酸酯酶2的缓冲液体系中加入适宜探针底物，在线性反应区间内通过定量检测单位时间内其水解代谢产物DDAO的生成量来测定各种体外生物样品中羧酸酯酶2酶的真实活性。该探针具有良好的选择性且水解产物DDAO的荧光发射波长(662nm)处于近红外区域，可显著减少生物样本自身背景荧光，提高灵敏度，具有良好的实用性和应用前景。

权利要求

1.一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物，其特征在于：该底物为1,3-二氯-7-羟基-9,

9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯，其结构通式为：

其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、2-呋喃基、2-噻吩基或4-乙氧基苯基取代基中的任意一种。

2.一种如权利要求1所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于：所述荧光探针底物在生理pH下可被羧酸酯酶2特异性催化并生成水解产物DDAO，该产物具有非常好的荧光发射属性，可采用荧光检测器实现产物的快速超灵敏检测；DDAO荧光检测条件为：激发波长600nm，在630～700nm进行荧光发射谱的检测；

该荧光探针底物可用作羧酸酯酶2活性快速定量检测，以及羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估。

3.按照权利要求2所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于羧酸酯酶2活性快速定量检测方法为：以DDAE水解反应作为羧酸酯酶2的特异性探针反应，CE2特异性催化DDAE并生成荧光产物DDAO，可通过定量检测单位时间内产物荧光强度的变化测定CE2的真实活性；其中所述DDAE为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯。

4.按照权利要求2所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以DDAE水解反应作为CE2的特异性探针反应，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物DDAO的生成量评估该生物体系中CE2的残余活性，进而实现CE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；其中所述DDAE为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯。

5.按照权利要求3所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于所述的羧酸酯酶2活性的快速定量检测方法，其特征在于羧酸酯酶2活性快速定量检测的具体步骤如下：(1)使用常用磷酸盐缓冲液，反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于7～10.5之间；

(2)以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；

(3)反应时间为5～30分钟，在确保水解产物达到定量限且底物转化率在0.1～20％之间终止反应；

(4)定量测定单位时间内水解产物生成量代入标准曲线后换算获得CE2的活性及酶量。

6.按照权利要求4所述的羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于所述羧酸酯酶2抑制剂筛选与评估的应用，其特征在于羧酸酯酶2抑制剂的筛选与评估方法具体步骤为：(1)使用常用磷酸盐缓冲液，反应温度为20～60℃之间；孵育体系pH介于7～10.5之间；

(2)以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；

(3)加入不同浓度的抑制剂并设置空白对照组，孵育5～30分钟，并在水解产物达到定量限且底物转化率在0.1～20％之间终止反应；

(4)定量测定单位时间内水解产物的荧光值并计算加入抑制剂组对荧光值减少的百分数作为抑制活性评估标准。

7.按照权利要求2～6中任意项所述羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物的应用，其特征在于：应用于重组表达的CE2酶、含有CE2的细胞及组织制备物生物样品中CE2活性的定量测定。

说明书

羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物及其应用。

背景技术

[0002] 羧酸酯酶(Carboxylesterases，CE)是一种重要I相药物代谢酶，广泛分布于多种哺乳动物细胞中。该酶参与多种酯类药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢，能有效催化含羧酸酯键、酰胺键、硫酯键等外源性物质的水解。在人体中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(CE1)和羧酸酯酶2(CE2)两个亚型，二者在组织分布和底物特异性上存在显著差异。CE2在人肠道和肿瘤组织中高表达，在提高很多前药的口服生物利用度中起着十分重要作用，并且其活性也会影响很多酯类抗癌试剂(如伊立替康和卡培他汀)的疗效。机体羧酸酯酶的组织分布与功能差异不仅决定其处置酯类外源物的能力，还与肥胖、动脉粥样硬化、高脂血症、高胆固醇血症、脂肪肝等代谢综合症发生发展密切相关。并且，羧酸酯酶2含量在结肠癌不同发病阶段具有显著差异，可作为结肠癌诊断的早期标志物。因此，精确测量不同生物体系中CE2的真实活性在临床上意义十分重大。

[0003] 截至目前，CE2的定量方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹法(Western Blotting)、质谱法和荧光法等。荧光检测方法由于高灵敏度、低侵袭性、快速和高通量等优点而备受欢迎，但是已有的荧光底物的发射波长都较短(λem＜630nm)，受生物基质自发荧光干扰较大，定量误差较大。而近红外荧光底物(λem＞650nm)可克服上述缺点，提高灵敏度。故而开发高选择性的人羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物具有非常广泛的应用价值。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种羧酸酯酶2的荧光探针底物及其制备方法与应用，该探针底物的水解产物具有良好的荧光属性。利用该探针反应可对多种生物体系中CE2的分布和功能进行定量评价。

[0005] 一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物，该底物为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(简称DDAO)的芳香酯(简称DDAE)，其结构通式为：

[0006]

[0007] 其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、2-呋喃基、2-噻吩基或4-乙氧基苯基取代基中的任意一种。

[0008] 一种羧酸酯酶2的近红外荧光探针底物在生物检测中的应用，所述荧光探针底物可被羧酸酯酶2特异性催化并生成水解产物DDAO，该产物具有良好的荧光发射属性，可采用荧光检测器实现产物的快速超灵敏检测；DDAO荧光检测条件为：激发波长600nm，在630～700nm进行荧光发射谱的检测；该荧光探针底物可用作羧酸酯酶2活性快速定量检测，以及羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估。

[0009] 羧酸酯酶2活性快速定量检测方法为：以DDAE水解反应作为CE2的特异性探针反应，CE2特异性催化DDAE并生成水解产物DDAO，该产物具有良好的荧光属性，可通过定量检测单位时间内荧光强度的变化测定CE2的真实活性。

[0010] 羧酸酯酶2抑制剂的快速筛选与评估方法为：以DDAE水解反应作为CE2的特异性探针反应，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物DDAO的生成量评估该生物体系中CE2的残余活性，进而实现CE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

[0011] 羧酸酯酶2活性快速定量检测的具体步骤如下：

[0012] (1)使用常用缓冲液，反应温度为20℃至60℃之间；孵育体系pH介于7～10.5之间；

[0013] (2)以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；

[0014] (3)反应时间为5～30分钟，在确保水解产物达到定量限且底物转化率在0.1％～20％之间终止反应；

[0015] (4)定量测定单位时间内水解产物生成量代入标准曲线后换算获得CE2的活性及酶量。

[0016] 羧酸酯酶2抑制剂的筛选与评估方法具体步骤为：

[0017] (1)使用常用缓冲液，反应温度为20℃至60℃之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；

[0018] (2)以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km，优选Km；

[0019] (3)加入不同浓度的抑制剂并设置空白对照组，孵育5～30分钟，并在水解产物达到定量限且底物转化率在0.1％～20％之间终止反应；

[0020] (4)定量测定单位时间内水解产物的荧光值并计算加入抑制剂组对荧光值减少的百分数作为抑制活性评估标准。

[0021] 本发明所述特异性检测羧酸酯酶2活性的荧光探针底物的应用领域，包括但不限于重组表达的CE2酶、含有CE2的细胞及组织制备物等生物样品中CE2活性的定量测定。

[0022] 本发明提供的特异性检测羧酸酯酶2活性的荧光探针底物的应用，需注意所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。

[0023] 本发明提供的特异性检测羧酸酯酶2活性的荧光探针底物的应用，探针分子的水解产物具有良好的荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长600nm，在630～700nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应CE2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中CE2酶活的定量测定。

[0024] 该特异性探针反应可用于重组表达的人源或动物源的羧酸酯酶2、含有羧酸酯酶2的细胞或组织制备物、动物及病理组织切片、人源及动物源的正常或肿瘤细胞等多种生物样本中CE2酶活的定量测定，还可用于快速筛选CE2酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。

[0025] 采用CE2单酶或肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物可特异性的经CE2代谢生成相应的水解产物。

[0026] 选用本发明所述CE2的特异性探针底物检测CE2酶体外活性具有以下突出优势：

[0027] (1)高特异性：1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的芳香酯类衍生物可被CE2高特异性地代谢成单一代谢产物，其它人体常见水解酶或具有水解活性的蛋白不参与此类化合物的水解；

[0028] (2)廉价易得：底物DDAE及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行；

[0029] (3)高灵敏度：产物1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮具有良好的荧光属性，发射波长处于近红外区域(最大发射波长在662nm)，可减少生物样本自身背景荧光，增强检测的灵敏度，在生物样本中具有良好的应用前景。

[0030] (4)高通量：利用该类荧光探针底物可实现96,386孔板的快速检测，可实现每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。

附图说明

[0031] 图1.1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的酯类衍生物的结构通式；

[0032] 图2.1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯的代谢反应表型筛选结果；

[0033] 图3.1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯随CE2蛋白浓度增大的荧光谱图；

[0034] 图4.1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯在人肝微粒体、人肠微粒体和羧酸酯酶2中被洛哌丁胺抑制的残余活性曲线拟合图；

[0035] 图5.羧酸酯酶2活性的个体差异分析；

[0036] 图6.1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯的合成路线图；

[0037] 图7.1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯的13C-NMR谱图具体实施方式

[0038] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

[0039] 实施例1

[0040] 探针的特异性评价

[0041] (1)含有羧酸酯酶1、羧酸酯酶2、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶、a-糜蛋白酶、对氧磷酶1、对氧磷酶2、a酸性糖蛋白、乙酰胆碱酯酶(5μg/mL)、丁酰胆碱酯酶(20U/L)、人血清白蛋白(50μg/mL)、牛血清白蛋白(50μg/mL)的磷酸盐198μL，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

[0042] (2)加入2μL的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(终浓度为5μM)起始反应，37度震荡孵育；

[0043] (3)30分钟后，加入200μL的乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

[0044] (4)检测水解产物(λex＝600nm，λem＝662nm)在采集波长处的荧光强度值(见图2)。

[0045] 实施例2.

[0046] 羧酸酯酶2定量标准曲线的绘制

[0047] (1)采用5mg/mL的羧酸酯酶2(CE2)的标准溶液，用磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度的单酶工作液(0,0.5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/mL)，37℃下预孵育5min；

[0048] (2)向每个所述溶液样本(198μL)中加入2μL的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(终浓度为10μM)，37℃震荡孵育15min，加入200μL的乙腈剧烈震荡15秒钟终止反应；

[0049] (3)检测水解产物DDAO(λex＝600nm，λem＝662nm)在采集波长处的荧光强度值，将DDAO的荧光强度值对CE2浓度进行线性拟合作图，建立人羧酸酯酶2的定量标准曲线；曲线方程为Y＝2521*X–72.24，相关系数平方为0.997(见图3)。

[0050] 实施例3

[0051] 洛哌丁胺的抑制实验

[0052] (1)重组表达CE2单酶(2μg/mL)、人肝微粒体(4μg/mL)、人肠微粒体(4μg/mL)各198μL，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

[0053] (2)向反应体系中加入1μL的CE2的阳性抑制剂洛哌丁胺终浓度(0-100μM)，继续孵育5分钟；

[0054] (3)加入2μL的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(终浓度为5μM)起始反应；

[0055] (3)15分钟后，加入200μL的乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

[0056] (4)进行荧光检测(λex＝600nm，λem＝662nm)，根据各组在662nm的荧光强度值与DMSO组的比值计算CE2的抑制强度(见图4)。

[0057] 实施例4.

[0058] 不同个体来源肝微粒体中CE2的活性定量评估

[0059] (1)选取12例人肝微粒体(HLM)稀释至4μg/ml，准备CE2代谢反应体系，包括pH 7.4的磷酸盐缓冲液(100mM)、人肝微粒体(4μg/ml mg/ml)，于37℃条件下震荡预孵5分钟；

[0060] (2)向反应体系中加入2μl的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(终浓度为5μM)起始反应；

[0061] (3)15分钟后，加入200μl的乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

[0062] (4)进行荧光检测(λex＝600nm，λem＝662nm)，计算单位时间内产物的生成率从而得到12例人肝微粒体(HLM)对荧光底物的代谢速率(图5)。

[0063] 实施例5.

[0064] 1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯的合成方法[0065] (1)向10mL含有0.25mmol的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮和0.3125mmol三乙胺的二氯甲烷溶液中，缓慢滴加0.3mmol的苯甲酰氯(溶于5mL的二氯甲烷中)，控制温度在0℃；

[0066] (2)混匀1h后，加热反应溶液至室温，过夜反应(见图6)；

[0067] (3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-乙烷(1:5,v/v)进行洗脱，得36.5mg淡黄色固体粉末状纯品；

[0068] (4)采用高分辨质谱和核磁进行化合物结构的表征(如图7)；其结构式如图1所示。