香柏总多糖及其在制备免疫抑制药物中的用途

摘要

本发明属中药领域，涉及一种香柏总多糖，该多糖为从藏药徐巴原植物香柏（Sabina pingii var.wilsonii）枝叶中提取制备的水溶性粗多糖，本发明对其糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量、分子量分布、单糖组成等结构特征进行了表征；经活性测定，结果表明所述的香柏多糖具有明显的抗补体作用，对补体激活经典途径的半数有效抑制浓度达到23～35μg/ml，与阳性对照药物肝素钠活性相当；同时可显著抑制LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO的水平，表明其具有很好的抗炎作用；本发明的香柏总多糖可用于制备抗补体、抗炎等免疫抑制相关药物。

权利要求

1.香柏总多糖，其特征在于，所述香柏总多糖为水溶性植物总多糖，来源于香柏Sabina pingii var. wilsonii，具有以下特征：分子量小于25000 Da；总糖含量不低于55%，糖醛酸含量高于8%，蛋白含量低于2%；单糖组成以阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖和葡萄糖为主，含有鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。

2.如权利要求1所述的香柏总多糖在制备补体抑制药物中的用途。

3.如权利要求1所述的香柏总多糖在制备抗炎药物中的用途。

说明书

香柏总多糖及其在制备免疫抑制药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明属中药领域，涉及一种植物多糖及其药物用途，具体涉及一种从香柏（Sabina pingii var. wilsonii）中提取制备的总多糖及其在制备抗补体、抗炎药物中的用途。

背景技术

[0002] 现有技术公开了补体系统的正常激活在消灭外来微生物、清除肌体内损伤或死亡的细胞和组织、维持机体的平衡中起着重要的作用。然而该系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，造成人体自身正常组织的损伤，参与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病的病理过程。目前临床上广泛使用的糖皮质激素、环磷酰胺、甲胺蝶吟等免疫抑制剂虽然对某些与补体过度激活相关的疾病有一定治疗作用，但由于该类药物并非专一的补体抑制剂，选择性差，长期应用会降低机体的防御机能，导致抗感染能力下降，易继发感染和使潜在病灶扩散，产生多种并发症和副作用。因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。

[0003] 天然多糖是中草药的主要活性成分类群，如人参多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、枸杞多糖等，常被报道具有免疫增强、抗肿瘤、降血糖等重要活性，越来越引起天然药物或保健食品领域研究人员的重视。而部分清热类中药多糖，如鱼腥草多糖、紫草多糖等则表现出明显的抗补体、抗炎活性，在防治与补体过度激活相关的急性肺损伤等重症炎性疾病方面表现出良好的疗效（ZL201010022880.4, ZL201110284642.5）。

[0004] 香柏（Sabina pingii var. wilsonii）是藏药“徐巴”的原植物之一，主要分布在湖北西北部、陕西南部、甘肃南部、四川、云南及西藏等省区海拔2600-4900米高山地带，以枝叶入药，具有清热、祛湿、解毒等功效，用于治疗肺炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎等疾病。文献报道香柏中含有挥发油、黄酮、苯丙素、甾体等成分，但迄今尚未见对其多糖的活性研究报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种水溶性植物总多糖及其在制备免疫抑制药物中的用途。尤其是香柏总多糖及其在制备抗补体、抗炎药物中的用途。

[0006] 本发明所述的香柏总多糖是从藏药徐巴原植物香柏（Sabina pingii var. wilsonii）枝叶中提取制备的一种水溶性粗多糖，通过以下步骤制得：将香柏枝叶粉碎、用乙醇除脂，进行水提，水提液浓缩后醇沉，沉淀复溶后冷冻干燥。

[0007] 本发明制得的香柏总多糖具有以下结构特征：

[0008] 分子量分布：小于25000 Da；单糖组成：以阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖为主，并含有少量鼠李糖、甘露糖、葡萄糖醛酸；糖含量大于55%，糖醛酸含量大于8%，蛋白含量小于2%。

[0009] 本发明中采用体外细胞溶血法测定，结果显示，所述的香柏总多糖具有明显的抑制补体过度激活作用，测定的三批批香柏总多糖的IC50值为23μg/ml～35μg/ml，与阳性对照药肝素钠（27.81μg/ml）活性相当；

[0010] 本发明中采用巨噬细胞分泌NO法测定，结果显示，所述的香柏总多糖能显著抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO分泌，具有较强的抗炎效果；

[0011] 本发明经活性测定结果表明，所述的香柏总多糖可作为良好的天然免疫抑制剂，进一步制备制备抗补体、抗炎药物，用于治疗补体过度激活或病原微生物引发的炎性疾病。

附图说明

[0012] 图1是香柏多糖高效凝胶电泳图。

[0013] 图2是香柏总多糖SP1、SP2对巨噬细胞分泌NO的影响。

具体实施方式

[0014] 实施例1 制备香柏总多糖

[0015] 将香柏枝叶粉碎，用95%乙醇按1:30的料液比进行减压加热回流（55℃，分3次，每次4h）除脂后的药渣挥干，用水按1:50的料液比进行减压加热回流提取（70℃，分3次，每次5h）将水提液浓缩至0.4g生药/ml，加4倍体积的95%乙醇，醇沉24h后过滤，用水将沉淀复溶后冷冻干燥，得到总多糖；依此工艺，分别制备三批香柏总多糖SP1、SP2和SP3。

[0016] 实施例2 香柏总多糖的结构表征

[0017] （1）分子量分布：

[0018] 将香柏总多糖SP3配制成0.3mg/ml水溶液，进行HPLC分析：采用TSK-GEL GMPWXL 凝胶柱 （300×7.6 mm），流动相为去离子水，流速0.8 mL/min，柱温25℃，检测波长210nm；用相同方法分析多糖标准品，通过比较谱图表明，香柏多糖的分子量基本小于25000 Da；

[0019] （2）单糖组成：

[0020] 取8 mg多糖样品加入1M TFA 2ml，110℃加热5h，离心，上清蒸干，沉淀用甲醇洗三次；然后进行PMP衍生化：酸水解产物用2mldd-H2O溶解，取1ml加入1ml PMP溶液和1ml 0.3 M NaOH，70℃加热2h水解。冷却后加入1ml 0.3M HCl中和，加入氯仿萃取3次后弃去氯仿层，然后进行HPLC分析：采用Agilent extend C18柱(250*4.6mm, 5μm)，用PBS（磷酸盐缓冲液）：乙腈为流动相梯度洗脱，流速0.7ml/min，检测波长245nm；通过与单糖标准品对照，得单糖组成及其相对含量（如表1所示），三批香柏总单糖的组成基本一致，主要含有阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖，并含少量的甘露糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸；

[0021] 表1 三批香柏总多糖的单糖组成HPLC分析结果

[0022]

[0023] （3）糖含量：

[0024] 建立标准曲线：称取阿拉伯糖单糖对照品3.8mg，加水溶解，定容至25.0ml作为标准溶液，分别吸取0，0.5，0.25，0.15，0.1，0.05，0.02 ml标准溶液于磨口试管中，加蒸馏水水至0.5ml，然后加入5%苯酚溶液0.5ml，再加入浓硫酸2.5ml （本实施例中优选直接加在液面上）后剧烈振荡5min，放置15min，在490nm下用分光光度计测其吸收值，绘制标准曲线；

[0025] 测定样品溶液：称取香柏多糖3.0mg，置于10ml容量瓶中，加水至刻度，吸取样品液0.2 ml体积于磨口试管中，按以上操作步骤测其吸收值，通过标准曲线计算含量为59.96%；

[0026] （4）糖醛酸含量：

[0027] 建立标准曲线：称取半乳糖醛酸1.9mg，加水溶解，定容至25.0ml作为标准溶液，分别吸取0，0.04，0.08，0.12，0.24，0.40ml标准溶液于磨口试管中，加蒸馏水至0.50 ml，在冰浴中预冷，加入3.0 ml四硼酸钠-硫酸试剂(0.0125 M四硼酸钠的硫酸溶液)，振荡混合，在沸腾水浴中加热5 min。以冰浴冷却至室温后加50μl 0.15%间羟联苯溶液(以0.5%氢氧化钠配制，冰箱保存，一个月稳定)，摇匀，在520nm下用分光光度计测其吸收值，绘制标准曲线；

[0028] 测定样品溶液：精密称取香柏多糖1.2 mg，置于10 ml容量瓶中，加水至刻度，吸取样品液0.5 ml体积于磨口试管中，按以上操作步骤测其吸收值，通过标准曲线计算含量为9.43%；

[0029] （5）蛋白质含量：

[0030] 考马斯亮蓝G-250溶液的配制：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸50ml，最后用蒸馏水定容到500ml；

[0031] 建立回归方程：取25mg牛血清白蛋白，溶于25ml蒸馏水中，即为1.0mg/ml的原液，取该原液用水对倍稀释得0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0312 mg/ml的牛血清白蛋白溶液，从各试管中分别吸取溶液0.1 ml放入10 ml具塞试管中，以0.1 ml水作为空白，加入5 ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，盖塞、混匀，放置5 min后测595 nm下吸光度，绘制标准曲线；

[0032] 测定样品溶液：称取香柏多糖3.0mg，置于10 ml 容量瓶中，加水至刻度，吸取0.1 ml于磨口试管中，按以上操作步骤测其吸收值通过标准曲线计算含量为1.05%。

[0033] 实施例3 细胞溶血法测定香柏总多糖抗补体活性

[0034] 取约2.0mg香柏总多糖，精密称定，溶于0.8ml BBS（巴比妥盐缓冲液）中，对倍稀释，得到2.5，1.25，0.625，0.3125，0.1563，0.0781，0.0391，0.0195mg/ml的样品溶液各0.4ml，分别吸取0.2ml至0.4ml BBS中做空白对照；在剩余的样品溶液中分别加入0.2ml的补体、0.1ml的溶血素和0.1ml 2%的羊红细胞溶液，离心后取上清液在405nm下测吸收值，扣除空白对照的吸收值后计算三批香柏多糖的溶血抑制率的IC50分别为SP1: 25.04μg/ml、SP2: 35.40μg/ml、SP3: 23.82μg/ml；阳性对照药肝素钠的IC50为27.81μg/ml。

[0035] 实施例4 测定香柏总多糖对巨噬细胞分泌NO的影响

[0036] Balb/c小鼠实验前4天腹腔注射5%硫乙醇酸盐培养基，4天后收集小鼠腹腔巨噬细胞，将细胞浓度调整为5×105/ml种入96孔板中，200ul/孔，置于细胞培养箱中贴壁培养2h（37 ℃, 5% CO2）；按照以下分组加样：(1) 空白对照组；（2）多糖单独处理组；（3） LPS处理组 （LPS终浓度为1µg/ml）；(4) 多糖与LPS联合处理组；（5）阳性药地塞米松与LPS联合处理组（DEX）；每组四复孔，置于培养箱中培养24 h，收集上清，采用Griess法测定NO的水平，取上清液50 µl加入50 µl Griess试剂，混匀后室温放置10 min，使其充分反应，540 nm检测光吸收值，以亚硝酸钠溶液为标准溶液建立NO标准曲线（测量范围0-200 µM），确定各实验组细胞培养上清中的NO水平；

[0037] 实验结果表明，SP1、SP2单处理时能显著上调巨噬细胞NO分泌水平，具有免疫增强活性；同时，SP1、SP2均能显著抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO分泌，具有较强的抗炎效果；结果表明，SP1、SP2能对腹腔巨噬细胞分泌功能具有双向调节作用。