基于响应面法优化提取的川白芷多糖及制备方法和应用

摘要

本发明公开了基于响应面法优化提取的川白芷多糖及制备方法和应用。该川白芷多糖的分子量为1.17kDa，由川白芷药材经水提醇沉、去蛋白去盐后，再经DEAE‑琼脂糖凝胶FF柱和琼脂糖凝胶6FF凝胶柱层析分离而得；所述水提条件为81℃浸提3次，每次浸提1h，所述水与川白芷粉末的用量比为68mL/g。本发明所得的川白芷多糖具有良好的抑菌活性、抗氧化能力和美白活性。本发明方法提取率高，纯化效果好，且不改变川白芷多糖的结构，不影响其生物活性。

权利要求

1.川白芷多糖在制备具有抑菌作用的日化用品、食品、保健品或药品中的用途，其特征在于：所述川白芷多糖为具有酰基或O-乙酰基的α-呋喃糖型氨基多糖，其表观分子量为

1.17kDa，由川白芷药材经水提醇沉、去蛋白去盐后，再经DEAE-琼脂糖凝胶FF柱和琼脂糖凝胶6FF凝胶柱层析分离而得；所述水提条件为81℃浸提3次，每次浸提1h，所述水与川白芷粉末的用量比为68mL/g；

所述川白芷多糖的制备方法具体包括以下步骤：

A：脱脂脱色素：将川白芷药材洗净烘干粉碎，得粉末；将所述粉末先加入石油醚脱脂后，再加入高浓度乙醇溶液脱除部分色素及低聚糖；

B：提取：将脱脂脱色素后的粉末加水于81℃浸提3次，每次浸提1h，所述水与川白芷粉末的用量比为68mL/g，合并提取液，过滤，滤液浓缩，得浓缩液；

C：醇沉除杂：将所述浓缩液醇沉除去水溶性杂质后得到川白芷粗多糖；

D：去蛋白：将所述川白芷粗多糖采用酶+Sevag结合法去除蛋白；

E：透析去盐：将所述去除蛋白后的川白芷粗多糖采用透析法去除无机盐和小分子物质，得去盐川白芷多糖；

F：将所述去盐川白芷多糖进行DEAE-琼脂糖凝胶FF柱层析，收集并合并第一个洗脱峰的收集液，浓缩，透析，冻干；

G：将步骤F冻干后的川白芷多糖进行琼脂糖凝胶6FF凝胶柱层析，收集并合并主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干，即得。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述步骤A中，将川白芷根洗净，于40-50℃烘干，粉碎，过40目筛，得川白芷粉末；取所述川白芷粉末加入石油醚加热回流脱脂4h，过滤，滤渣于40-50℃烘干后，再加入80％乙醇加热回流提取4h，过滤，滤渣挥干乙醇后粉碎，于40-50℃烘干，备用；所述石油醚的用量按每克川白芷粉末计为2-4mL，所述80％乙醇的用量按每克川白芷粉末计为2mL。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述步骤C中，向浓缩液中加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为50-70％，于0-6℃静置12-24h，离心，取离心沉淀加水溶解后，再次离心，取再次离心后的上清液，向所述上清液加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为50-

70％，于0-6℃静置12-24h，第三次离心，取第三次离心后的沉淀，得川白芷粗多糖，备用。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述步骤D中去蛋白所用的酶为木瓜蛋白酶，所用Sevag试剂为氯仿:正丁醇＝4:1，所述去蛋白的次数为10次；所述步骤E中，采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋，室温蒸馏水透析24h后，换干净蒸馏水再透析8h，重复2次。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述步骤F中，将川白芷多糖加水溶解后，上样于DEAE-琼脂糖凝胶FF柱，先以1.5倍柱体积的蒸馏水洗脱后，再以水和2mol/L的NaCl溶液混合洗脱，实现0～1.5mol/L NaCl溶液的梯度洗脱，分管收集，收集液用苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制苯酚-硫酸反应曲线图，并绘制反应曲线，根据所述反应曲线合并同一洗脱峰的收集液，浓缩，透析，冻干。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：将步骤F冻干后的川白芷多糖加水溶解后，上样于琼脂糖凝胶6FF凝胶柱，洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，分管收集，收集液用苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制苯酚-硫酸反应曲线图，采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量，并绘制反应曲线，根据所述反应曲线收集主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干。

说明书

基于响应面法优化提取的川白芷多糖及制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基于响应面法优化提取的川白芷多糖及制备方法和应用。

背景技术

[0002] 药材白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss)Shan et Yuan的干燥根。白芷味辛，性温，归胃、大肠、肺经。具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓的作用，用于感冒头痛，眉棱骨痛，鼻塞流涕，鼻鼽，鼻渊，牙痛，带下，疮疡肿痛。

[0003] 白芷是卫生部公布药食两用的87种中药材之一，也是我国常用的大宗药材。按产地分为川、杭、祁、禹白芷四大商品。其中产于四川的白芷则称川白芷，是著名的川产道地药材，产量约占全国商品白芷的70％。川白芷以四川遂宁出产的形优、质坚、粉多香浓、色白细腻、横切片成“菊花芯形”的川白芷品质最佳。白芷富含多种化学成分，现代研究表明，白芷的脂溶性化学成分主要为香豆素类，含量为0.211％～1.221％，其水溶性成分有棕榈酸、豆甾醇、β-谷甾醇、β-胡萝卜苷(β-daucosterin)等。白芷还富含多种多糖。

[0004] 多糖广泛存在于动、植物和微生物(真菌和细菌)中，常与蛋白质和多聚核苷酸相连，是生命活动中必不可少的生物大分子，在细胞吸附、细胞与细胞信息交流、免疫系统分子识别方面扮演着重要的作用。目前多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分。植物多糖具有多种生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血糖血脂、抗衰老、抗炎、抗辖射、免疫调节等。现有技术中通常利用高温、超声波、微波、酶解等物理化学方法来提高多糖的提取率、缩短提取时间。但这些提取辅助手段的作用是有限的，当提取体系达到平衡后，单一条件改变对多糖的得率的影响将变小至不显著。此外，这些手段在提高多糖溶出率的同时，还会影响多糖的结构，从而改变多糖的生物活性，导致部分天然多糖活性的降低或丧失。

[0005] 目前对于白芷多糖的研究尚不够深入。仅个别学者对杭白芷多糖的提取以及抗氧化和增强动物皮肤组织免疫功能进行过分析，且尚未开展过白芷多糖热水提取法方法优化以及不同提取方法得到的多糖结构和活性差异的研究。

发明内容

[0006] 针对上述问题，本发明提供了基于响应面法优化提取的川白芷多糖。

[0007] 本发明的第二个目的在于提供了基于响应面法优化提取的川白芷多糖的制备方法。

[0008] 本发明的第三个目的在于提供了基于响应面法优化提取的川白芷多糖的应用。

[0009] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0010] 本发明所述的基于响应面法优化提取的川白芷多糖，该川白芷多糖的分子量为1.17kDa，由川白芷药材经水提醇沉、去蛋白去盐后，再经DEAE-琼脂糖凝胶FF柱和琼脂糖凝胶6FF凝胶柱层析分离而得；所述水提条件为81℃浸提3次，每次浸提1h，所述水与川白芷粉末的用量比为68mL/g。

[0011] 本发明所述的川白芷多糖的制备方法，该制备方法具体包括以下步骤：

[0012] A：脱脂脱色素：将川白芷药材洗净烘干粉碎，得粉末；将所述粉末先加入石油醚脱脂后，再加入高浓度乙醇溶液脱除部分色素及低聚糖；

[0013] B：提取：将脱脂脱色素后的粉末加水于81℃浸提3次，每次浸提1h，所述水与川白芷粉末的用量比为68mL/g，合并提取液，过滤，滤液浓缩，得浓缩液；

[0014] C：醇沉除杂：将所述浓缩液醇沉除去水溶性杂质后得到川白芷粗多糖；

[0015] D：去蛋白：将所述川白芷粗多糖采用酶+Sevag结合法去除蛋白；

[0016] E：透析去盐：将所述去除蛋白后的川白芷粗多糖采用透析法去除使无机盐和小分子物质，得去盐川白芷多糖；

[0017] F：将所述去盐川白芷多糖进行DEAE-琼脂糖凝胶FF柱层析，收集并合并第一个洗脱峰的收集液，浓缩，透析，冻干；

[0018] G：将步骤F冻干后的川白芷多糖进行琼脂糖凝胶6FF凝胶柱层析，收集并合并主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干，即得。

[0019] 进一步地，所述步骤A中，将川白芷根洗净，于40-50℃烘干，粉碎，过40目筛，得川白芷粉末；取所述白芷粉末加入石油醚加热回流脱脂4h，过滤，滤渣于40-50℃烘干后，再加入80％乙醇加热回流提取4h，过滤，滤渣挥干乙醇后粉碎，于40-50℃烘干，备用；所述石油醚的用量按每克川白芷粉末计为2-4mL，所述80％乙醇的用量按每克川白芷粉末计为2mL。

[0020] 进一步地，所述步骤D中，向浓缩液中加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为50-70％，于0-6℃静置12-24h，离心，取离心沉淀加水溶解后，再次离心，取再次离心后的上清液，向所述上清液加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为50-70％，于0-6℃静置12-24h，第三次离心，取第三次离心后的沉淀，得川白芷粗多糖，备用。

[0021] 进一步地，所述步骤D中去蛋白所用的酶为木瓜蛋白酶，所用Sevag试剂为氯仿:正丁醇＝4:1，所述去蛋白的次数为10次；所述步骤E中，采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋，室温蒸馏水透析24h后，换干净蒸馏水再透析8h，重复2次。

[0022] 进一步地，所述步骤F中，将川白芷多糖加水溶解后，上样于DEAE-琼脂糖凝胶FF柱，先以1.5倍柱体积的蒸馏水洗脱后，再以水和2mol/L的NaCl溶液混合洗脱，实现0～1.5mol/L NaCl溶液的梯度洗脱，分管收集，收集液用苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制苯酚-硫酸反应曲线图，并绘制反应曲线，根据所述反应曲线合并第一个洗脱峰的收集液，浓缩，透析，冻干。

[0023] 进一步地，将步骤F冻干后的川白芷多糖加水溶解后，上样于琼脂糖凝胶6FF凝胶柱，洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，分管收集，收集液用苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制苯酚-硫酸反应曲线图，采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量，并绘制反应曲线，根据所述反应曲线收集主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干。

[0024] 本发明所述的川白芷多糖在制备具有抑菌作用的日化用品、食品、保健品或药品中的用途。

[0025] 本发明所述的川白芷多糖在制备具有抗氧化作用的日化用品、食品、保健品或药品中的用途。

[0026] 本发明所述的川白芷多糖在制备具有美白作用的日化用品、食品、保健品或药品中的用途。

[0027] 本发明所用川白芷，其原植物为杭白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan]，产地为四川省遂宁市。

[0028] 与现有技术相比，本发明具备的有益效果为：

[0029] 本发明提供了基于响应面法优化提取的川白芷多糖，具有良好的抑菌活性、抗氧化能力和美白活性。

[0030] 采用响应面法优化后的工艺提取川白芷多糖，川白芷多糖得率平均值为16.84％，近似于Design-expert 8.0.7.1 Trail软件计算所得理论值16.957％。所得川白芷多糖经醇沉、去蛋白去盐后，再经两次柱层析，得到良好的纯化效果，含糖量显著提高，淀粉含量降低。采用本发明方法提取川白芷多糖，不影响其结构，不改变其生物活性。由扫描电镜图可知，其表面光滑，结构完整。

[0031] 本发明建立了一条完整可行的川白芷多糖提取、分离纯化、理化性质、结构和生物活性研究技术路线。

附图说明

[0032] 附图1为本发明提取次数、浸提温度、水料比对川白芷多糖提取率影响的响应面图(E、G)和等高线图(e、g)。其中，图1中的E为提取次数和浸提温度对川白芷多糖提取率影响的响应面图，图1中的G为浸提温度和水料比对川白芷多糖提取率影响的响应面图；图1中的e为提取次数和浸提温度对川白芷多糖提取率影响的高等线图，图1中的g为浸提温度和水料比对川白芷多糖提取率影响的高等线图。

[0033] 附图2为本发明提取时间对川白芷多糖得率的影响图。

[0034] 附图3为本发明提取次数对川白芷多糖得率的影响图。

[0035] 附图4为本发明浸提温度对川白芷多糖得率的影响图。

[0036] 附图5为本发明水料比对川白芷多糖得率的影响图。

[0037] 附图6为本发明川白芷多糖DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱柱洗脱曲线图，其中A图为蒸馏水洗脱曲线，B图为NaCl梯度洗脱曲线。

[0038] 附图7为本发明川白芷多糖初步分离组分的琼脂糖凝胶7FF色谱柱洗脱曲线图，附图8为本发明川白芷多糖初步分离组分的扫描电镜图。

[0039] 附图9为本发明川白芷多糖初步分离组分与刚果红反应曲线图。

[0040] 附图10为本发明川白芷多糖初步分离组分的傅里叶变换红外光谱图。

[0041] 附图11为本发明川白芷多糖1的1H和13C NMR图谱，其中A图1H图谱，B图为13C NMR图谱。

[0042] 附图12为本发明川白芷多糖初步分离组分清除DPPH·自由基活性图。

[0043] 附图13为本发明川白芷多糖初步分离组分FRAP值图。

[0044] 附图14为本发明川白芷多糖初步分离组分清除ABTS+·自由基活性图。

[0045] 附图15为本发明川白芷多糖初步分离组分酪氨酸酶抑制活性图。

[0046] 附图16为超声提取法制备川白芷多糖的扫描电镜图。

[0047] 附图17为酶提取法制备川白芷多糖的扫描电镜图。

具体实施方式

[0048] 下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

[0049] 实施例1

[0050] 响应面法优化热水浸提白芷多糖工艺考察

[0051] 以单因素试验为基础，利用Design-expert 8.0.7.1 Trail软件的Box-Behnken方法进行试验设计，以川白芷多糖得率为响应值，得到最佳提取条件。

[0052] 1.单因素试验

[0053] 取川白芷根洗净，40℃烘干，粉碎过40目筛。称取白芷粉样，加入石油醚55℃回流脱脂4h，40℃烘干后，再加入80％乙醇80℃回流提取4h，以除去部分色素及低聚糖，挥干乙醇后粉碎，45℃烘干备用。石油醚的用量按每克川白芷粉末计为3mL，80％乙醇的用量按每克川白芷粉末计为2mL。

[0054] 称取1g脱脂脱色素后的川白芷粉样置于离心管中进行单因素实验。以川白芷多糖得率为参考，考察各提取因素对川白芷多糖提取的影响。固定其他条件，分别考察提取时间(1、2、3、4、5h)、温度(60、70、80、90、100℃)、水料比(10：1、30：1、50：1、70：1、90：1mL/g)、次数(1、2、3、4、5次)对川白芷多糖得率的影响。

[0055] 2.响应面优化试验

[0056] 在单因素试验基础上，利用Design-expert 8.0.7.1 Trail软件的Box-Behnken方法优化影响提取率的主要因素，进行3因素3水平的试验设计，以川白芷多糖得率为响应值，得到最佳提取条件，并验证。试验设计因素及水平如表1所示。

[0057] 表1 Box-Behnken设计因素及水平表

[0058]

[0059]

[0060] 3.试验结果

[0061] (1)提取时间

[0062] 如附图2所示，随着提取时间的增长，多糖得率呈现先增多后减少的趋势。由此确定川白芷多糖最佳提取时间为2h。

[0063] (2)提取次数

[0064] 如附图3所示，随着提取次数的增加，川白芷多糖的得率呈现先增加，随后逐渐稳定的趋势，说明提取3次后样品中的多糖几乎提取完全，由此确定川白芷多糖响应面优化提取次数范围为2～4次。

[0065] (3)浸提温度

[0066] 如附图4所示，随着浸提温度的升高，川白芷多糖的得率呈现先升高后降低的趋势，在浸提温度为80℃时提取多糖得率达到峰值，由此确定川白芷多糖响应面优化提取温度范围为70～90℃。

[0067] (4)水料比

[0068] 如附图5所示，随着水料比的增加，川白芷多糖的得率呈现先增加后降低的趋势，在水料比为70:1时提取多糖得率为14.76％，此时多糖溶出量几乎已达最高值，原因可能是溶液量增加导致原料的物质分子间相互作用减弱，由此确定川白芷多糖响应面优化水料比范围为60:1～90:1mL/g。

[0069] 4.采用BBD响应面法设计得到17组试验，结果见表2。回归模型方差分析见表3。

[0070] 表2 Box-Behnken试验设计及结果

[0071]

[0072]

[0073] 利用Box-Behnken响应面法设计，得到川白芷多糖得率(Y)与提取次数(A)、浸提温度(B)、水料比(C)的二元多项回归方程：

[0074] Y＝16.72+0.65A+0.35B-0.33C+0.14AB+0.12AC+0.71BC-0.32A2-2.31B2-0.88C2[0075] 通过回归模型的方差分析：回归项P<0.0001，即回归模型极显著；失拟项0.2816>0.05，即模型失拟合度检验不显著，模型拟合度较好。方程的相关系数R2为0.9882，即川白芷多糖得率变化有98.82％来于所选变量提取次数、浸提温度和水料比，回归模型可用来分析和预测川白芷多糖的提取工艺条件。回归模型中A、B、C、BC、B2、C2极显著，A2显著，AB、AC不显著，说明提取条件不同对川白芷多糖得率的影响存在非线性关系，而各因素之间的交互作用影响程度不同。

[0076] 表3回归模型方差分析

[0077]

[0078]

[0079] 注:"*"表示：显著；"**"表示：极显著；"ns"表示：不显著

[0080] 在提取次数、浸提温度、水料比中固定一个因素，其余两个因素与其之间的交互作用对川白芷多糖得率的影响如附图1所示，可由相应曲面图和等高线图表示，等高线图越接近于椭圆形表示两因素交互作用越显著。

[0081] 由回归方程做响应面分析图，如附图1所示，结合方差分析表可知，FA＝55.97，FB＝16.88，FC＝14.18，因素对应的F值大小，表明因素对试验指标的影响程度。因此，影响川白芷多糖提取各因素的顺序为：提取次数(A)>浸提温度(B)>水料比(C)。回归方程优化川白芷多糖提取条件最佳方案为：提取次数3.40次、浸提温度80.68℃、水料比68.41:1(mL/g)。

[0082] 5.验证试验

[0083] 根据试验设计中最佳方案，结合到实际情况，修正试验操作设置的条件为提取3次、浸提温度81℃、水料比68mL/g，提取时间1h，3次重复试验，实得川白芷多糖得率平均值为16.84％，近似于Design-expert 8.0.7.1 Trail软件计算所得理论值16.957％，响应面法优化所得的回归方程具指导意义。

[0084] 实施例2

[0085] 川白芷多糖的制备

[0086] 川白芷多糖的制备方法，包括以下步骤：

[0087] A：脱脂脱色

[0088] 取川白芷根洗净，45℃烘干，粉碎过40目筛。称取白芷粉样，加入石油醚55℃回流脱脂4h，45℃烘干后，再加入80％乙醇80℃回流提取4h，以除去部分色素及低聚糖，挥干乙醇后粉碎，45℃烘干备用。所述石油醚的用量按每克川白芷粉末计为3mL，80％乙醇的用量按每克川白芷粉末计为2mL。

[0089] B：提取

[0090] 将脱脂脱色素后的粉末加水于81℃浸提3次，每次浸提1h，所述水与川白芷粉末的用量比为68mL/g，合并提取液，过滤，滤液浓缩，得浓缩液；

[0091] C：醇沉除杂

[0092] 向所述浓缩液中缓慢加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为60％，置于4℃静置12h，离心得川白芷多糖沉淀，弃上清液。川白芷多糖沉淀用水复溶，4000r/min离心10min除杂质，得上清液加乙醇浓度至60％，4℃静置12h后，第三次离心，取第三次离心后的沉淀，备用；

[0093] D：去蛋白

[0094] 按照1g川白芷多糖沉淀加入200mL水的比例溶解样品，在50℃水浴加热并间歇性搅拌至其完全溶解，4000r/min离心5min除去杂质，川白芷多糖溶液pH调节到6.5。木瓜蛋白酶用pH 6.5的PBS配成50mg/mL的酶溶液，按照1g川白芷多糖沉淀加20mg木瓜蛋白酶的比例加到上述的糖溶液中，然后在50℃水浴加热3h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，4000r/min离心10min除去变性蛋白和酶。

[0095] 在经过木瓜蛋白酶解后的混合溶液中加入等体积的Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)，剧烈振摇15min，5000r/min离心10min，离心后液体三分层，小心吸取上层清液并重复去蛋白10次后40℃旋转蒸发真空浓缩得到去蛋白川粗多糖。

[0096] E：透析去盐

[0097] 8000-14000Da透析袋处理液为0.01mol/L NaHCO3和l mmol/L EDTA的水溶液。将长度为25cm左右透析袋放入处理液加热煮沸半个h。蒸馏水清洗透析袋，置于50％乙醇中，4℃保存备用。将去蛋白川粗多糖溶液适量装于透析袋中，透析袋两头扎好后留出1/3的空间防止其中亲水性物质过度吸水使袋破裂。室温下用蒸馏水透析24h后，换干净蒸馏水再透析8h，重复2次。透析后浓缩、冻干得到川白芷粗多糖。

[0098] F：DEAE-琼脂糖凝胶FF柱层析

[0099] 首先，将500mL的DEAE-琼脂糖凝胶FF装入2.5×100cm的中压层析柱中。柱子装好后用3倍柱体积的去蒸馏水，1mL/min流速进行平衡。

[0100] 其次，将川白芷粗多糖配制成50mg/mL的水溶液样品，所有备用洗脱液要超声脱气，上样量5mL，流速lmL/min，先以1.5倍柱体积的去蒸馏水洗脱，再以水和2mol/L的NaCl混合洗脱，实现0～1.5mol/L NaCl溶液的梯度洗脱，每10mL收集一管。每隔一管取样100μL用苯酚-硫酸法(100μL样品溶液+200μL5％苯酚溶液+1mL浓硫酸)检测多糖含量，绘制苯酚-硫酸反应曲线图，并绘制反应曲线。收集并合并第一个洗脱峰的收集液，浓缩，透析，冻干。川白芷多糖DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱柱洗脱曲线如附图6所示。

[0101] G：琼脂糖凝胶6FF凝胶柱层析

[0102] 将步骤F冻干后的川白芷多糖过琼脂糖凝胶6FF凝胶柱进行过滤层析，配制成30mg/mL的多糖水溶液，上样量10mL，洗脱液为0.05mol/L NaCl溶液，流速为0.5mL/min，每管收集5mL。每管取样100μL用苯酚硫酸法检测多糖，绘制苯酚-硫酸反应曲线图，采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白含量，并绘制反应曲线。收集主峰的洗脱液，浓缩，透析，冻干。川白芷多糖初步分离组分的琼脂糖凝胶7FF色谱柱洗脱曲线如附图7所示。

[0103] 实施例3

[0104] 川白芷多糖的制备

[0105] 本实施例与实施例2相比，步骤A中的烘干温度均为50℃，加入川白芷4倍量石油醚加热回流脱脂；

[0106] 步骤C中，向所述浓缩液中缓慢加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为70％，置于6℃静置24h，离心得川白芷多糖沉淀，弃上清液。川白芷多糖沉淀用水复溶，4000r/min离心
10min除杂质，得上清液加乙醇浓度至70％，6℃静置24h后，第三次离心，取第三次离心后的沉淀，备用；

[0107] 其余条件同实施例2。

[0108] 实施例4

[0109] 川白芷多糖的制备

[0110] 本实施例与实施例2相比，步骤A中的烘干温度均为40℃，加入川白芷2倍量石油醚加热回流脱脂；

[0111] 步骤C中，向所述浓缩液中缓慢加入无水乙醇至混合溶液乙醇终浓度为50％，置于2℃静置12h，离心得川白芷多糖沉淀，弃上清液。川白芷多糖沉淀用水复溶，4000r/min离心
10min除杂质，得上清液加乙醇浓度至60％，62℃静置12h后，第三次离心，取第三次离心后的沉淀，备用；

[0112] 其余条件同实施例2。

[0113] 实施例5

[0114] 对实施例2得到的川白芷多糖及实施例2中步骤B所得浓缩液进行总糖检测，检测方法如下：

[0115] 1mg/mL葡萄糖母液的配置：葡萄糖在烘箱中100℃烘干至恒重，称0.1033g葡萄糖于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解定容，备用。

[0116] 葡萄糖标准曲线绘制：分别取适量1mg/mL葡萄糖母液，稀释至葡萄糖浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/mL，吸取100μl葡萄糖溶液，然后加入5％苯酚200μl及1mL浓硫酸，摇匀，室温放置20min后于490nm下测吸光度。以加入葡萄糖浓度为横坐标，490nm下吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

[0117] 取实施例2中步骤B所得浓缩液干燥后，得水提粗多糖样品；配制成1mg/mL的水提粗多糖样品溶液，取100μl检测，做三组平行试验取平均值。

[0118] 取实施例2得到的川白芷多糖，配制1mg/mL的不同样品溶液，取100μl检测，做三组平行试验取平均值。

[0119] 以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，苯酚-硫酸法检测总糖的含量，回归方程为y＝2.6803x+0.1572，R2＝0.994。根据样品测定的吸光度值对照标准曲线回归方程计算白芷多糖总糖含量，得到实施例2所得的川白芷多糖中总糖的含量为65.40±0.02％，实施例2步骤B所得的水提粗多糖样品中总糖的含量为63.60±0.04％。

[0120] 实施例6

[0121] 对实施例2得到的川白芷多糖进行蛋白质分析，实验方法如下：

[0122] 考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质结合使之染色在595nm处有最大吸收，常用来定性和定量测定蛋白质，该方法操作简单、反应迅速适合大量样品的测定，在0-100mg/L蛋白质浓度范围内，吸光值与蛋白质含量呈良好的线性关系。

[0123] 1mg/mL样品的水溶液，可见光-紫外光分光光度计进行400-200nm紫外扫描，以蒸馏水为空白对照。

[0124] 蛋白质标准曲线绘制：称100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL 95％乙醇，加入100mL 85％磷酸，蒸馏水定容至1L，滤纸过滤备用。配制0.1mg/mL牛血清白蛋白标准溶液，分别取
0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，用蒸馏水补充至1.0mL，分别加入考马斯亮蓝G250溶液各5mL，混匀。放置2min后在595nm下测吸光度。

[0125] 配制成1mg/mL的不同样品溶液，取1mL检测，做三组平行试验取平均值。

[0126] 以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线，线性回归方程为：y＝0.0025x+0.006，R2＝0.9907。根据样品测定的吸光度值对照标准曲线回归方程计算白芷多糖蛋白质含量，得到实施例2所得的川白芷多糖中蛋白质含量为1.44％。由于测量存在一定误差，该值并不能代表样品蛋白质含量，只能说明这些样品中不含蛋白质或可能含有结合蛋白。

[0127] 实施例7

[0128] 对实施例2得到的川白芷多糖进行糖醛酸定性分析，实验方法如下：

[0129] 咔唑试液的制备：精密称取0.125g咔唑，加无水乙醇溶解定容至100mL的量瓶中，备用。

[0130] 配制0.4mg/mL葡萄糖醛酸标准溶液，1mg/mL的样品溶液。

[0131] 取50μL样品溶液，加入50μL咔唑试液，冰浴加入300μL浓硫酸，观察颜色变化。

[0132] 结果表明：实施例2得到的川白芷多糖醛糖酸检测与400μg/mL D-葡萄糖醛酸显色一致，均呈蓝绿色阳性显色，说明其含有一定的醛糖酸，是酸性杂多糖。

[0133] 实施例8

[0134] 对实施例2得到的川白芷多糖进行扫描电镜分析

[0135] 扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)，具体操作如下：将放置分析试样的载物台放置在溅射仪(JEOL JFC-1600)内真空喷金(铂金)30s，试样喷金后，放进扫描电镜系统(JEOL JSM-6390A)，真空条件下，5kV加速电压，放大2000×和5000×倍扫描成像。

[0136] 如附图8所示，扫描电镜显示实施例2得到的川白芷多糖表面平整光滑，表明其制备方法未对其结构有影响。

[0137] 实施例9

[0138] 对实施例2最终得到的川白芷多糖及其步骤B浓缩液干燥后所得的水提粗多糖进行碘-碘化钾反应检测，方法如下：

[0139] 碘试剂为含0.02％碘的0.2％KI溶液，川白芷多糖及水提粗多糖的样品浓度均为1mg/mL。分别取50μl各样品溶液，加入200μl碘试剂，观察颜色变化后用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan GO)进行200—800nm扫描。

[0140] 结果显示，川白芷多糖及水提粗多糖均呈阳性显色反应，川白芷多糖反应后但颜色较浅，说明通过两次过柱可以除去多糖中的淀粉。

[0141] 将川白芷多糖样品溶液与碘试剂(含0.02％碘的0.2％KI溶液)混匀，测定300-700nm范围内的吸收光谱，在565nm附近有最大吸收，说明其有较少的分支和较短的侧链。

[0142] 实施例10

[0143] 对实施例2得到的川白芷多糖进行刚果红试验，具体实施方法如下：

[0144] 配置1mg/mL川白芷多糖溶液，80μmol/L刚果红溶液，1mol/L的NaOH溶液。

[0145] 吸取0.5mL川白芷多糖溶液，加入80μmol/L刚果红溶液0.5mL，混匀。然后加入适量1mol/L的NaOH溶液，使反应溶液中NaOH的终浓度分别为0.0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、
0.3mol/L和0.4mol/L混匀室温静置后，200-800nm区间进行光谱扫描，测量不同浓度下溶液的最大吸收波长。另取空白对照，即不加川白芷多糖样品，以相同方法测量不同浓度下溶液的最大吸收波长。

[0146] 比较样品溶液与空白对照溶液的最大吸收波长变化情况。

[0147] 结果如附图9所示，川白芷多糖与空白对照溶液变化趋势基本相同，说明其可能不具有三股螺旋结构。

[0148] 实施例11

[0149] 对实施例2得到的川白芷多糖进行多糖分子量分析，具体实验方法如下：

[0150] 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)对川白芷多糖分子量进行测定。HPLC色谱条件如下：色谱柱：TSK-GEL G5000PWXL凝胶柱(7.8mm×30cm)；流动相：水；流速：0.5mL/min；进样量：20μL；检测器：Alltech 2000型ELSD检测器，漂移管温度：115℃，气体流量：3.2(SLPM)。

[0151] 标准曲线的制备：取平均分子量分别为T10、T40、T70、、T500、T2000道尔顿的标准葡聚糖对照品，以水溶解，配制为2mg/mL的标准溶液。照上述HPLC色谱条件检测，以标准葡聚糖的保留时间和分子量分别取自然对数绘制。

[0152] 用高纯水将多糖样品制成2mg/mL的溶液，在相同色谱条件下进样分析，记录保留时间，带入回归方程算得平均分子量。

[0153] 标准多糖参照品：Blue 2000(Mw：2 000kDa)，T-700(Mw：700kDa)，T-500(Mw：500kDa)，T-70(Mw：70kDa)T-40(Mw：40kDa)，T-10(Mw：10kDa)经HPLC-ELSD分析后。以保留时间对分子量对数作图，得到回归方程y＝-1.99x+21.104，R2＝0.9991。由回归方程可以计算得到川白芷多糖的表观分子质量。

[0154] 结果表明，川白芷多糖的表观分子质量为1.17kDa。

[0155] 实施例12

[0156] 对实施例2得到的川白芷多糖进行红外光谱和核磁共振分析

[0157] 将干燥的川白芷多糖样品3.0mg与干燥的KBr在玛瑙研钵中研磨均匀后压片，在4000-400cm-1，范围内进行扫描。取20mg川白芷多糖溶于0.5mL重水中，核磁共振仪进行
600MHz NMR分析。

[0158] 如附图10红外图谱显示，川白芷多糖为具有酰基或O-乙酰基(O-Ac)的一种α-呋喃糖型氨基多糖片段。

[0159] 如附图11核磁共振图谱显示，川白芷多糖可能为多种糖残基组成存在α构型链接糖残基的酸性杂多糖，还有MeO基团，在C2、C3、C4均可能存在取代。

[0160] 实施例13

[0161] 对实施例2得到的川白芷多糖进行抑菌活性分析，具体实验方法如下：

[0162] (1)试验菌种

[0163] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，革兰氏染色阳性球菌)，大肠埃希菌(Escherichia coli，革兰氏阴性短杆菌)，铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa，又称绿脓杆菌，革兰阴性杆菌，细菌)，白色念珠菌(Monilia albican，真菌，革兰阳性)。

[0164] (2)菌悬液制备

[0165] 将各供试菌种接种于适宜的培养基上，进行斜面活化，恒温37℃培养18～24h，挑取单个菌落分别接种于新鲜肉汤培养基中，置37℃恒温箱中培养18～24h，然后用肉汤(或5 5
灭菌生理盐水)稀释至1×10～2×10CFU/mL后备用。

[0166] (3)川白芷多糖药敏纸片的制备

[0167] 将新华一号定性滤纸，用直径5.5mm的打孔器打成5.5mm的圆片，经高压灭菌处理后，置100℃烘干，保存备用。用二倍稀释法将川白芷多糖溶液稀释成浓度分别为50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL，4个梯度，后放入滤纸片浸泡30～60min。以无菌水纸片作为空白对照。

[0168] (4)体外抑菌试验(定性试验)

[0169] 滤纸片法：将直径为5.5mm的滤纸片浸泡于各浓度川白芷多糖溶液中2h，分别吸取0.2mL各供试菌悬液涂布于平板培养基上，在每个培养基表面放3片浸泡好的滤纸片，然后将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌置于37℃培养箱中培养36h，白色念珠菌置于28℃培养箱中培养48h，取出，观察抑菌圈大小，测量并记录结果。测量抑菌环时，选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行测量，用游标卡尺测量抑菌环的直径，并记录测量数据。试验重复3次。

[0170] 结果表明，不同浓度川白芷多糖对细菌的抑菌作用不同，在抑菌浓度范围内，随着多糖浓度的增加抑菌效果会增强。川白芷多糖抑菌效果强弱顺序为：金黄色葡萄球菌>铜绿假单胞杆菌>白色念珠菌>大肠杆菌，多糖浓度为10mg/mL时抑菌圈直径为6.44、5.08、1.83和1.50mm；抑菌效果强弱顺序为：铜绿假单胞杆菌>白色念珠菌>大肠杆菌，多糖浓度为10mg/mL时抑菌圈直径分别为4.04、2.85、2.75mm，对金黄色葡萄球菌无抑制作用。

[0171] 表4川白芷多糖初步分离组分对不同菌种的抑菌圈大小

[0172]

[0173] 实施例14

[0174] 对实施例2得到的川白芷多糖进行体外抗氧化活性测定，具体实验方法如下：

[0175] (1)多糖对DPPH·清除率的测定

[0176] 0.0004％DPPH·：准确称取0.00406g DPPH·，用75％乙醇定容至100mL，避光低温保存。

[0177] 2mg/mL VC：称取0.2g VC用蒸馏水定容至100mL。

[0178] 分别吸取1mL不同浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL)的样品溶液，加入2.0mL 0.004％的DPPH溶液，摇匀，37℃水浴避光反应30min，517nm处测定其吸光度。以VC作对照。

[0179] 自由基清除率(％)＝[1-(As-Ar)/A0]×100

[0180] 式中：A0为100μl DPPH溶液与50μl样品溶剂的吸光度；As为100μl DPPH溶液与50μl样品溶液的吸光度；Ar为100μl样品溶剂与50μl样品溶液的吸光度。

[0181] 如附图12所示，不同浓度的川白芷多糖对自由基DPPH·都具有一定的清除能力。随着川白芷多糖浓度的增加，清除率逐渐升高，呈现明显的量效关系，其IC50值为1.4mg/mL。

[0182] (2)多糖总还原能力的测定(FRAP·值测定)

[0183] 40mM HCl：取浓HCl(12M)0.1mL加蒸馏水至30mL(或0.17mL加水至5mL)，避光保存。

[0184] 2mM FeCl3：取0.1625gFeCl3，蒸馏水定容至50mL，避光保存。

[0185] 0.3M pH 3.6醋酸钠缓冲液：取醋酸钠5.1g，加醋酸20mL，用水稀释至250mL，避光保存。

[0186] 10Mm TPTZ：称取0.03123gTPTZ，用40mM HCl定容至10mL，低温避光保存。

[0187] FRAP工作液(现配现用)：300mM pH 3.6醋酸钠缓冲液25mL、10mM TPTZ2.5mL、20Mm FeCl3 2.5mL混合。避光低温保存。

[0188] 将300mmol/L醋酸钠缓冲溶液(pH＝3.6)，10mmol/L TPTZ溶液和20mmol/LFeCl3溶液按体积比10:1:1混合配制FRAP工作液。移取1mL的不同浓度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL)样品溶液，加入2mL 37℃预热的FRAP工作液，摇匀，37℃反应30min，于593nm处测定其吸光度，以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白。以不同浓度(25～1600μmol/L)FeSO4绘制标准曲线，在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(μmol/L)。FRAP值越大，抗氧化活性越强。

[0189] 移取10μl的样品溶液，加入100μl FRAP工作液，37℃反应30min，于590nm处测定其吸光度，用蒸馏水调零。以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白，每个稀释度做3次平行试验，求平均值。根据反应后A值，在标准曲线上求得相应FeSO4的浓度(μmol/L)，定义为FRAP值，样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO4的μmol数表示。

[0190] 如附图13所示，不同浓度的川白芷多糖的FRAP值都严重低与阳性对照VC。随着多糖浓度的增加，FRAP值几乎没有什么变化，说明川白芷多糖总的还原能力弱，并且还原能力强弱与白芷多糖浓度间没有量效关系。

[0191] (3)多糖总抗氧化能力测定(ABTS清除能力测定)

[0192] 2.45mM过硫酸钾：称取0.331g K2S2O8蒸馏水定容至500mL。

[0193] 7mM ABTS+：称取0.384g ABTS蒸馏水定容至100mL。

[0194] ABTS储备液：2.45mM K2S2O8与7mM ABTS等体积混合。室温、避光静置保存12-16h，可稳定3-4h。

[0195] ABTS工作液：用75％乙醇(或pH＝7.4磷酸缓冲液)稀释至734nm下吸光度稳定为0.7±0.002。

[0196] 将7mmol/L ABTS水溶液与2.45mmol/L过硫酸钾水溶液等体积混合，在避光、室温条件下放置16h，形成ABTS+母液；将此母液与无水乙醇按照约1:60(V:V)的比例混合在734nm下调吸光度为0.700±0.02，得到ABTS+工作液，30℃下预热备用。移取50μl的样品溶液(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)，加入100μl ABTS工作液，混匀，37℃下避光反应
30min，于734nm处测定其吸光度，用蒸馏水调零。以无水乙醇代替样品加入ABTS工作液作为空白，以VC作为对照。

[0197] ABTS+清除率(％)＝(1-A样品/A0)×100％

[0198] 其中：A样品表示加入样品后的吸光度，A0表示ABTS+的吸光度

[0199] 如附图14所示，不同浓度的川白芷多糖对自由基ABTS+·都具有一定的清除能力。随着多糖浓度的增加，清除率逐渐升高，呈现明显的量效关系，其IC50值为1.1mg/mL。

[0200] 实施例15

[0201] 对实施例2得到的川白芷多糖进行美白活性分析，具体实验方法如下：

[0202] 采用酪氨酸酶多巴速率氧化法，以酪氨酸酶抑制率为指标进行评价，具体操作如下。

[0203] 试剂配制

[0204] (1)PBS缓冲液配制

[0205] 0.2mol/L的NaH2PO4：称取NaH2PO4·H2O 3.12g加蒸馏水定容至100mL溶解。

[0206] 0.2mol/L的Na2HPO4：称取Na2HPO4·2H2O 3.56g加蒸馏水定容至100mL溶解。

[0207] 0.1mol/L的PBS，49mL 0.2mol/L的Na2HPO4，51mL 0.2mol/L的Na2HPO4，加100mL蒸馏水稀释。

[0208] (2)多巴配制

[0209] 取0.075g左旋多巴，用PBS缓冲液定容到100mL容量瓶。

[0210] (3)酪氨酸酶配制

[0211] 取0.5mg的酪氨酸酶，用PBS缓冲液溶解，定容值2mL。酶活力单位在250U/mL左右。

[0212] (4)样品处理

[0213] 川白芷多糖配置成1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL，0.125mg/mL，0.0625mg/mL，0.03125mg/mL、0.01625mg/mL，相应浓度曲酸做阳性对照，反应体系如表5。

[0214] 表5酪氨酸酶抑制反应体系

[0215] Table 3 System of tyrosine enzyme inhibited reaction

[0216]

[0217] 按照顺序加入多巴、PBS、多糖/曲酸，加入酶液后迅速放入37℃的酶标仪孵育5min测值，每个样品做三个重复。

[0218] A：处理组样品在475nm处的吸光度；

[0219] A0：空白组样品在475nm处的吸光度；

[0220] B：对照组样品在475nm处的吸光度；

[0221] B0：总空白组样品在475nm处的吸光度。

[0222] 如附图15所示，川白芷多糖具有抑制酪氨酸酶的作用，且随着浓度的增加，酪氨酸酶抑制率逐渐升高，呈现明显的量效关系。

[0223] 实施例16

[0224] 对比例

[0225] 采用SB25-12DTD超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)超声提取川白芷多糖，包括以下步骤：

[0226] 步骤A：同实施例2中的步骤A。

[0227] 步骤B：称取步骤A所得的白芷粉样100g，加入3倍量去蒸馏水400W超声1h，然后4000r/min离心5min，收集上清液，重复提取一次，合并提取液并浓缩。

[0228] 其余步骤同实施例2。

[0229] 将超声提取后分离所得的川白芷多糖扫描电镜放大2000倍与5000倍扫描，如附图16所示，表面粗糙，凹凸不平，甚至出现些许空洞。多糖属于天然高分子凝胶，糖链间通过氢键交联，当糖苷键被酶解切断后，导致糖链间氢键交联键密度变小，畴结构变大，即表面粗糙度增加。因此可知，采用超声法提取川白芷多糖会破坏其结构。

[0230] 实施例17

[0231] 对比例

[0232] 采用酶提取法制备川白芷多糖，包括以下步骤：

[0233] 步骤A：同实施例2中的步骤A。

[0234] 步骤B：称取步骤A所得白芷粉样500g，加入4倍量pH 4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和0.45％纤维素酶，50℃水浴提取160min，沸水浴10min使酶灭活，4000r/min离心5min收集上清液，重复提取2次，合并提取液并浓缩。

[0235] 其余步骤同实施例2。

[0236] 将酶法提取后分离所得的川白芷多糖扫描电镜放大2000倍与5000倍扫描，如附图17所示，表面粗糙，凹凸不平。因此可知，采用酶法提取川白芷多糖会破坏其结构。

[0237] 上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。