一种芝麻抗裂蒴性检测引物、检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及一种芝麻抗裂蒴性检测引物、检测试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。抗裂蒴芝麻KANADI基因与裂蒴芝麻基因的序列相比，DNA序列缺失14个碱基，cDNA序列缺失了77个碱基，缺失碱基位于转录起始密码子下游第1,118bp与1,132bp之间，14bp碱基位于第2个外显子和第2个内含子连接处。本发明根据该基因序列差别特点设计抗裂蒴性检测引物，为芝麻分子标记辅助选择育种提供了重要检测引物，为筛选抗裂蒴的芝麻新品种提供了快速、准确的检测方法。

权利要求

1.一种芝麻抗裂蒴性检测引物，其特征在于：包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为5'-ACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATT-3'，所述反向引物序列为5'-TGGGCTTCTTTCCTTTGACTAC-3'。

2.包含如权利要求1所述的检测引物的检测试剂盒。

3.采用如权利要求1所述的芝麻抗裂蒴性检测引物的检测方法，其特征在于：包括：提取待测样本的DNA为模板，加入正向引物及反向引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离或测序，判定结果；

所述正向引物序列为5'-ACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATT-3'，所述反向引物序列为5'-TGGGCTTCTTTCCTTTGACTAC-3'；

结果的判定方法为：若扩增产物仅一条89bp的条带，则样本为抗裂蒴性纯合材料；若扩增产物仅一条103bp的条带，则样本为裂蒴性纯合材料；若扩增产物为89bp和103bp两条条带，则为裂蒴性杂合材料。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系为10μL，包含25-

50ng的模板DNA，0.5U的Taq酶，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的10mM/μL dNTPs，0.2μL的10μM/μL正向引物，0.2μL的10μM/μL反向引物，余量为水。

5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序为：预变性94℃ 1min；变性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 30s，35个循环，延伸72℃ 10min。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述电泳分离为采用9%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述待测样本为郑芝InD01与其他材料获得的F2代以上群体的后代单株。

8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：采用CTAB法提取待测样本的DNA。

说明书

一种芝麻抗裂蒴性检测引物、检测试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种芝麻抗裂蒴性检测引物、检测试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

[0002] 芝麻(Sesamum indicum L.)属胡麻科胡麻属，是我国重要的优质油料作物和特色农产品，更是重要的出口创汇农产品。近年来，我国食用油供需矛盾十分突出，采取各种措施不断增加芝麻产量、提高芝麻生产效率是芝麻研究的重大课题。但芝麻种植手段落后，从播种到收获以人工操作为主，原始的种植方式导致芝麻生产投入的劳动力过多，劳动强度大，生产效率低。因此，降低芝麻生产成本，尽快推进芝麻生产机械化进程，是芝麻生产发展的必然趋势。

[0003] 目前我国种植的芝麻品种都是裂蒴型的，而且是无限生长习性，开花时间长，蒴果成熟时间不一致，成熟时蒴果易开裂落粒，收获不及时产量损失可达50％；气候干燥时，芝麻落粒达60-70％；雨后产量损失更多。增强芝麻的抗裂蒴性既可以降低机械化收获造成的落粒损失，提高种子的收获效率，还有利于提高籽粒成熟度，保证芝麻的品质。河南省农业科学院从20世纪80年代从国外引进了闭蒴型芝麻种质，但这些材料由于产量低、杯状叶、脱粒困难等缺点，限制了其在生产中的直接应用。另一方面，芝麻裂蒴的遗传机制模糊不清，也限制了芝麻抗裂蒴性品种的选育。

[0004] 芝麻蒴果的开裂是由其蒴果的结构、生理生化机制和分子遗传学基础决定。芝麻蒴果结构的研究发现，蒴果是沿着假隔膜处中果皮细胞分离形成的弱化带开裂(可能是由聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶活性引起)。蒴果壁干燥过程中，由于中果皮的薄壁细胞与内果皮的厚壁细胞收缩程度不同，蒴果壁产生张力，迫使蒴果开裂。一旦蒴果开裂，胎座枯萎时附着在胎座上的种子自然脱落。芝麻落粒性依赖于蒴果的开裂程度，以及种子对蒴果的附着性，而抗裂蒴性芝麻品种蒴果连接处外果皮和中维管束之间有许多细胞层，这个特点可以减少抗裂蒴性芝麻品种裂蒴。遗传研究方面，Langham et al研究表明芝麻蒴果类型是一个简单的质量性状，由一个位点上的两个等位基因控制，裂蒴(Id)相对于抗裂蒴(id)是完全显性。Weiss et al的研究也发现F2群体裂蒴与抗裂蒴之比为3:1。但Yermanos et al在F2群体中却发现裂蒴与抗裂蒴之比为8:1。Nafie Ali的研究解释了这种现象，认为抗裂蒴性有两种遗传控制模式，有些基因型材料抗裂蒴性是由1对基因(idid)控制，有些基因型材料抗裂蒴性是由两对基因控制。由于抗裂蒴性芝麻在机械收获时具有商业价值，很多学者试图将抗裂蒴性导入到栽培种芝麻中。但是，在所有的杂交和选择过程中，没有获得抗裂蒴且无不良性状的材料，这表明蒴果类型或者Id位点具有一因多效性。抗裂蒴性分子标记研究方面，Uzun et al利用土耳其品种“Muganli-57”与闭蒴突变体CC3杂交构建的F2群体为材料，利用分离群体混合分组分析法(Bulk Segregant Analysis，BSA)首次找到了1个与芝麻闭蒴性连锁的AFLP标记。

[0005] 但是，上述传统的分子标记检测芝麻的抗裂蒴性时具有检测繁琐，重复率低等诸多缺陷。因此，目前亟需找到一种能够简化检测流程、并且重复率高的方法。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种芝麻抗裂蒴性检测引物，该引物检测方便，检测效率高，重复率好。

[0007] 本发明还提供了包含上述检测引物的检测试剂盒。

[0008] 本发明还提供了芝麻抗裂蒴性检测方法，该方法可以对芝麻抗裂蒴性进行早期世代选择从而缩短育种周期，能够较快地筛选出抗裂蒴的芝麻材料。

[0009] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

[0010] 一种芝麻抗裂蒴性检测引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为5'-ACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATT-3'，所述反向引物序列为5'-TGGGCTTCTTTCCTTTGACTAC-3'。

[0011] 检测试剂盒，包含上述检测引物。

[0012] 上述的检测试剂盒，还包括Taq酶，PCR buffer，dNTPs等。

[0013] 采用上述芝麻抗裂蒴性检测引物的检测方法，包括：提取待测样本的DNA为模板，加入正向引物及反向引物进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离或测序，判定结果；

[0014] 所述正向引物序列为5'-ACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATT-3'，所述反向引物序列为5'-TGGGCTTCTTTCCTTTGACTAC-3'。

[0015] 所述待测样本为郑芝InD01与其他材料获得的F2代以上群体的后代单株，如采用叶片组织。

[0016] 所述PCR扩增的体系为10μL，包含25-50ng的模板DNA，0.5U的Taq酶，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的10mM/μL dNTPs，0.2μL的10μM/μL正向引物，0.2μL的10μM/μL反向引物，余量为水。

[0017] 所述PCR扩增的程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min。

[0018] 所述电泳分离为采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

[0019] 所述电泳分离时的电泳缓冲液为0.5×TBE。所述电泳分离为150V恒功率电泳分离。

[0020] 采用电泳分离，结果的判定方法为：若扩增产物仅一条89bp的条带，则样本为抗裂蒴性纯合材料；若扩增产物仅一条103bp的条带，则样本为裂蒴性纯合材料；若扩增产物为89bp和103bp两条条带，则为裂蒴性杂合材料。

[0021] 采用测序，结果的判定方法为：若测出仅有89bp的序列，则样本为抗裂蒴性纯合材料；若测出仅有103bp的序列，则样本为裂蒴性纯合材料；若测序结果有89bp和103bp两中序列，则为裂蒴性杂合材料。

[0022] 所述提取待测样本的DNA可采用CTAB法。

[0023] 本发明的有益效果是：本发明的检测引物所检测的片段为芝麻抗裂蒴性基因KANADI，该基因属于GARP家族的转录因子；该抗裂蒴芝麻KANADI基因与裂蒴芝麻基因的序列相比，DNA序列缺失14个碱基，cDNA序列缺失了77个碱基，所述缺失碱基位于转录起始密码子下游第1,118bp与1,132bp之间，14bp碱基位于第2个外显子和第2个内含子连接处。同时，本发明根据该基因序列差别特点设计抗裂蒴性检测引物，为芝麻分子标记辅助选择育种提供了重要检测引物，为筛选抗裂蒴的芝麻新品种提供了快速、准确的检测方法。

[0024] 本发明的方法克服了常规育种中，表型鉴定要等到收获蒴果时测定抗裂蒴指数，且易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用分子标记对芝麻抗裂蒴性进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出抗裂蒴的芝麻材料。本发明可应用于芝麻育种，以提高育种效率，具有以下优点：

[0025] 1)在传统的分子标记辅助育种中，由于分子标记和抗裂蒴基因有一定的遗传距离，在育种过程中存在分离的可能性的问题，本发明的检测引物所检测的片段为抗裂蒴基因的一部分，克服了上述问题。本发明的检测引物所扩增的分子标记位点位于抗裂蒴基因的功能位点，与抗裂蒴基因紧密连锁，不会出现分离，可以更有效地提高育种效率。

[0026] 2)本发明的检测方法能够在幼苗期鉴定出芝麻是否具有抗裂蒴性，及时弃去不需要的材料，节省人力物力。

[0027] 3)本申请通过凝胶电泳区分抗裂蒴芝麻和不抗裂蒴芝麻，能够达到快速、直观检测的技术效果。

附图说明

[0028] 图1为裂蒴基因与抗裂蒴基因cDNA序列比对图；

[0029] 图2为裂蒴基因与抗裂蒴基因内含子和外显子示意图；

[0030] 图3为裂蒴基因与抗裂蒴基因氨基酸序列比对图；

[0031] 图4为实施例3中检测结果示意图。

具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

[0033] 以下实施例及对比例中的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0034] 实施例1

[0035] 芝麻抗裂蒴性检测引物的获得：

[0036] 1、郑芝InD01的获得：以抗裂蒴材料“UCR82-15NS”(1983年D.M.Yermanos,Riverside,USA提供)为母本，豫芝11号为父本，杂交获得F1，自交获得F2；选择F2中抗裂蒴单株与豫芝11号回交，获得BC1F1，自交获得BC1F2；选择BC1F2中抗裂蒴单株与豫芝11号回交，获得BC2F1，自交获得BC2F2；选择BC2F2中抗裂蒴单株与豫芝11号回交，获得BC3F1，自交获得BC3F2；自交2代，获得BC3F4，挑选抗裂蒴、结蒴性好且抗病的材料命名为郑芝InD01。

[0037] 以芝麻抗裂蒴性材料郑芝InD01和裂蒴芝麻品种豫芝11号，及其F2分离群体为实验材料。

[0038] 2、郑芝InD01、豫芝11号及F2分离群体DNA提取：采用CTAB法提取叶片DNA，具体步骤为：液氮研磨叶片0.5g，粉末加入2ml的离心管中，加入1ml的提取缓冲液，冰上放置10min，12000rpm离心5min，弃上清液；加入裂解缓冲液600μl，混匀，65℃水浴30～60min；加入1ml苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1，V/V/V)混匀30次，静置5min，12000rpm离心5min，吸取上清液；加入等体积异丙醇，混匀后放置10min，12000rpm离心5min，弃上清液；75％的乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入1×TE溶解(500μl)，加入两倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:
24:1，V/V/V)，混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸上清液，加入等体积氯仿混匀50次，静置5min，12000rpm离心5min；吸取上清液，加入十分之一体积3M NaAc(PH 5.2)，加入等体积异丙醇，混匀，12000rpm离心5min，弃上清液，75％乙醇清洗两次，通风橱内吹干，加入适量含有RNase的TE(50μl)溶解沉淀，37℃水浴30min，消化RNA。Nanodrop分析仪检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，保存于-20℃备用。

[0039] 3、抗裂蒴基因定位：采用Super BSA的方法分析，挑选极端裂蒴与抗裂蒴植株各50株，DNA等量混合，分别构建裂蒴与抗裂蒴混合池。利用HaeIII+Hpy166II对检测合格的各样品基因组DNA分别进行酶切。对得到的酶切片段进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段(264-364bp)，文库质检合格后用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。使用SNP-index方法，对标记与性状进行关联分析，将目标性状定位到LG8一个2.26M的染色体区段。为了进一步缩小定位区间，对双亲进行重测序，获得目标区段更多的SNP和InDel多态性位点，在F2群体中进行验证。最后将目标性状定位到LG8上39kb的区段。

[0040] 4、抗裂蒴基因确定：通过在NCBI上进行BLAST分析，39kb区段只有1个基因LOC105167765。LOC105167765预测为KANADI基因，一个GARP家族的转录因子，在水稻、玉米和拟南芥中负调促进叶远轴面分化，表现为卷叶。以往研究过程发现芝麻卷叶和抗裂蒴性状是紧密连锁的，推测该基因具有一因多效的作用，既控制芝麻抗裂蒴，又控制卷叶。前期对芝麻抗裂蒴性表型遗传分析也表明抗裂蒴性受一对隐性基因控制。通过对抗裂蒴和裂蒴亲本基因DNA和cDNA全长进行分析，抗裂蒴亲本比裂蒴亲本DNA第2个外显子及第2个内含子连接处缺失一段14bp的序列TACAGGTAGCTATG，cDNA序列缺失77bp(如图1所示，每行第一排为裂蒴基因，第二排为抗裂蒴基因，第三排为碱基差异分析；其中“*”为一致的碱基，“-”为缺失的碱基。)，抗裂蒴亲本缺少第二个外显子序列(如图2所示，第一行为裂蒴基因，第二行为抗裂蒴基因)。对推测的氨基酸进行比对分析，发现抗裂蒴亲本由于DNA序列14bp缺失，导致翻译提前终止(如图3所示，每行第一排为裂蒴基因氨基酸序列，第二排为抗裂蒴基因氨基酸序列，第三排为序列差异分析；“*”为一致的氨基酸，“.”为不同的氨基酸，“-”为缺失的氨基酸)。对蛋白结构域分析发现，抗裂蒴亲本没有GARP功能结构。推测由于抗裂蒴材料的DNA序列14bp缺失，导致mRNA发生可变剪接，使得抗裂蒴亲本KANADI基因翻译提前终止，功能结构域缺失，导致抗裂蒴性状的产生。

[0041] 5、根据芝麻抗裂蒴性基因特异序列设计功能标记InDel-Kan，其检测引物序列如下：

[0042] 正向引物序列：5'-ACTCTTGCTCATGTCAAGAGCCATT-3'；

[0043] 反向引物序列：5'-TGGGCTTCTTTCCTTTGACTAC-3'。

[0044] 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用灭菌ddH2O稀释到10μmol/L，-20℃保存备用。

[0045] 6、使用上述的检测引物检测待测样本，具体步骤如下：

[0046] 1)采用CTAB法提取204个株系的叶片组织的DNA，为模板；

[0047] 2)PCR反应体系为10μL，包含1μL的模板DNA(25-50ng/μL)，0.1μL的Taq酶(5U/μL)，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的dNTPs(10mM/μL)，0.2μL的正向引物(10μM/μL)，0.2μL的反向引物(10μM/μL)，7.3μL的ddH2O；扩增程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃
30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min；

[0048] 3)将扩增产物采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色，观察带型。

[0049] 根据带型进行结果的判定，判定方法为：若扩增片段仅一条，大小为89bp，则为隐性纯合材料(表现抗裂蒴性)；若扩增片段仅一条，大小为103bp，则为显性纯合材料(表现裂蒴性)；若扩增片段为89bp和103bp各一条，则为杂合材料(表现裂蒴性)。

[0050] 上述204个株系进行检测结果：204个株系中共196个株系的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算准确率为96.07％。

[0051] 实施例2

[0052] 芝麻抗裂蒴性检测试剂盒，包括：10μmol/μL实施例1的正向引物2mL，10μmol/μL实施例1的反向引物2mL，5U/μL的Taq酶1mL，10×PCR buffer 10mL，10mM/μL的dNTPs 2mL，ddH2O 10mL。

[0053] 实施例3

[0054] 芝麻抗裂蒴性检测方法，包括如下步骤：

[0055] 1)采用CTAB法提取郑芝InD01与其它芝麻材料杂交获得的F2代以上群体的后代植株叶片组织的DNA；

[0056] 2)PCR反应体系为：10μL，包含1μL的模板DNA(25-50ng/μL)，0.1μL的Taq酶(5U/μL)，1μL的10×PCR buffer，0.2μL的dNTPs(10mM/μL)，0.2μL的正向引物(10μM/μL)，0.2μL的反向引物(10μM/μL)，7.3μL的ddH2O；扩增程序为：预变性94℃1min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s，35个循环，延伸72℃10min；

[0057] 3)将扩增产物采用9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色，观察带型。

[0058] 根据带型进行结果的判定，判定方法为若扩增产物仅一条89bp的条带，则样本为抗裂蒴性纯合材料；若扩增产物仅一条103bp的条带，则样本为裂蒴性纯合材料；若扩增产物为89bp和103bp两条条带，则为裂蒴性杂合材料。

[0059] 结果如图4所示，M为DNA maker；Yu11为豫芝11号；InD01为郑芝InD01；1-5号单株，仅有一条89bp的条带，为抗裂蒴性隐性纯合材料；6-10号单株，仅有一条103bp的条带，为裂蒴性显性纯合材料；11-15号单株，具有89bp和103bp两条条带，为裂蒴性杂合材料。