一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法及引物和试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法及引物和试剂盒，涉及农业生物技术领域。本发明公开的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其包括比对所述目标蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列；根据序列比对结果，判断所述目标蚜虫的蓝光趋光性。该检测方法时间短，准确性高，避免了传统测定趋光性方法所存在的工作量大、用时较长、易受环境因素影响等缺陷，是一项重大技术革新，效率显著提高，为蚜虫预警和绿色防控提供关键技术支撑，在蚜虫防治领域具有十分重要的应用价值，可应用于蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警等领域。

权利要求

1.一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其特征在于，其包括：

序列比对，比对所述目标蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列；

根据序列比对结果，判断所述目标蚜虫的蓝光趋光性，若所述目标蚜虫的CRY1蛋白与所述豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列之间的相似度低于或等于84%，则所述目标蚜虫缺失蓝光趋光性；若所述目标蚜虫的CRY1蛋白与所述豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列之间的相似度高于91%，则所述目标蚜虫具有蓝光趋光性，所述的氨基酸序列如Seq ID No.9所示。

2.根据权利要求1所述的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其特征在于，在序列比对之前，所述方法还包括：获取所述目标蚜虫的编码CRY1蛋白的CRY1基因序列。

3.根据权利要求2所述的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其特征在于，所述方法包括：以所述目标蚜虫的cDNA为模板，用Seq ID No.5-6所示的引物进行PCR扩增，对得到的目标片段进行测序，得到所述目标蚜虫的CRY1基因序列，其中，所述目标蚜虫为油菜蚜虫。

4.根据权利要求3所述的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为55℃。

5.根据权利要求3所述的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其特征在于，所述方法包括：提取所述目标蚜虫的RNA，反转录后得到所述cDNA。

6.权利要求1-5中任一项所述的检测蚜虫蓝光趋光性的方法在蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警中的应用。

说明书

一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法及引物和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体而言，涉及一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法及引物和试剂盒。

背景技术

[0002] 蚜虫在农林生产中是危害严重的害虫之一，主要危害的农作物有棉花、小麦、蔬菜、油菜等。它的危害性可以让植物无法正常生长发育，如植物营养缺乏、生长畸形、产量下降，质量受损等。油菜上蚜虫的主要种类有桃蚜(Myzus persicae)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)和甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)3种，以成蚜或若蚜刺吸养分，不仅危害油菜生长，而且传播多种病毒病，影响油菜的产量和品质，造成严重的经济损失。因此，油菜蚜虫的加剧，对整个油菜产业都会造成损失，特别是对经济效益的影响。

[0003] 目前化学农药一直是害虫防治中应用最广泛、最有效的手段之一。化学防治虽然见效快，使用方便，但是会造成害虫抗药性增加、环境污染、破坏生态系统等一系列问题。

[0004] 物理防治是绿色防控最直接的防治手段。可以利用害虫的趋光性达到诱杀的效果，如黄板诱杀、黑光灯、频振杀虫灯等。利用物理措施防治害虫，污染小且不产生抗性，极大地提高了“益害比”，符合绿色防控的基本要求。

[0005] 昆虫对颜色的趋性本质是趋光性。昆虫的趋光性是通过其视觉器官(复眼和单眼)中的感光细胞对光波产生感应而做出的趋向反应。何国兴(光谱视觉匹配方法的探讨.照明工程学报，2000，11(3)：20-23)根据色彩视觉理论研究发现，最终的色觉是由于不同光感受器在不同程度同时活动所产生的，取其各类光感受器反应最敏感波长的光线混合，可获得与单色光等同的视觉识别效应。昆虫对色彩的反应各有差异，特别是不同种类之间的差异更加明显。

[0006] 昆虫对光谱有单色光的选择和复色光的选择。Duafy(Contibutiou a I’etude du phototvopisme desLepidopteres Noctuids.Ann.Sci.Nat,1964,12(6):281-406)曾对几种夜蛾科昆虫分别进行3～5种单波光趋性试验，发现趋性峰值分别在365nm、450nm、525nm等处。果蝇(Drosophila melanogaster)对UV(350nm)、蓝光(430nm)和绿光(508nm)也具有显著的趋性(Yamaguchi S et al.Contribution of photoreceptor subtypes to spectral wavelength preference in Drosophila.Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(12):5634-5639)。研究发现，大部分的昆虫光谱敏感区域集中在紫外光、蓝光和绿光范围。昆虫对复色光的趋性同样存在差异性。因此，昆虫的趋光性是由外界多种刺激作用所引起的适应行为。

[0007] Kirchner等(Evidence for trichromacy in the green peach aphid,Myzus persicae,(Sulz.)(Hemiptera:Aphididae).Journal of Insect Physiology,2005,51(11):1255-1260.)研究结果表明，蚜虫的视觉系统为典型的紫外光感受器、绿光感受器、蓝光感受器三色系统(UV-G-B)，存在有3个光谱响应高峰，其中最高峰由波长530nm～560nm之间的绿偏黄光刺激产生的。付国需等(蚜虫对不同单色光趋性反应的测定.昆虫学报，2009，52(10)：1171-1176.)研究桃蚜对不同单色光的趋性反应，结果表明有翅蚜趋性最高峰的波长为538.9nm和549.9nm的绿偏黄色，而无翅蚜对光的趋性明显较弱。Hodgson等(Effect of colour and shape of‘target’hosts on the orientation of emigrating adult apterous Myzus persicae in the laboratory[J].Entomologia Experimentalis Et Applicata,1985,38(3):267-272)报道对蚜虫具有最强引诱作用的颜色所反射的波长为
520nm～580nm。而有的研究表明蚜虫对黄色趋向性更强，即使在同一黄色光区域内，深黄色对蚜虫的诱集能力比淡黄色高1.71倍(陈风英等.黄板诱杀蔬菜蚜虫初报.江西植保，2003，
26(4)：189-191.)。胡小敏等(蚜虫对不同色卡敏感性及对不同波长黄色粘虫板趋性.西北农业学报，2011，20(9)：190-193.)研究发现蚜虫对550nm～600nm的黄色光波最敏感，对银灰色等光色则有明显的忌避性。

[0008] 通过电生理方法，可以了解和认识昆虫复眼的结构和功能，以及辨别色彩的能力。昆虫视觉电生理研究表明，多数昆虫通过3～5种光感受器的相互作用来辨识不同颜色。桃蚜体型弱小，获得视觉电生理信号极为困难。电生理研究表明，桃蚜不仅具有绿光受体，最大灵敏度在530nm，还发现了320nm～330nm的紫外受体和440nm～480nm的蓝光受体(et al.Visual ecology of aphids—a critical review on the role of 
colours in host finding.Arthropod-Plant Interactions,2007,1(1):3-16.)。因此，生产中急需一种快速鉴定蚜虫趋光性的技术，传统的视觉电生理技术十分复杂，技术要求高，难以操作，无法满足一般实验室的要求。

[0009] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法，该检测方法根据目标蚜虫的CRY1蛋白(即蓝光受体视蛋白基因)序列的变异程度，能够简单、快速地检测出目标蚜虫的蓝光趋光性强弱。

[0011] 本发明的另一目的在于提供有上述方法在蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警中的应用。

[0012] 本发明的另一目的在于提供用于检测蚜虫蓝光趋光性的引物。

[0013] 本发明的另一目的在于提供用于检测蚜虫蓝光趋光性的试剂盒。

[0014] 本发明是这样实现的：

[0015] 一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其包括：

[0016] 序列比对，比对目标蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列；根据序列比对结果，判断该目标蚜虫的蓝光趋光性。

[0017] 上述的检测方法在蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警中的应用。

[0018] 一种用于检测蚜虫蓝光趋光性的引物，其包括用于扩增所述目标蚜虫的CRY1基因的引物对。

[0019] 一种用于检测油菜蚜虫蓝光趋光性的试剂盒，其包括上述用于检测蚜虫蓝光趋光性的引物。

[0020] 本发明的有益效果是：

[0021] 本发明的提供的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其通过比对目标蚜虫的蓝光受体视蛋白即CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列，根据序列比对结果，判断目标蚜虫的蓝光趋光性强弱；该检测方法时间短，准确性高，避免了传统测定趋光性方法所存在的工作量大、用时较长、易受环境因素影响等缺陷，是一项重大技术革新，效率显著提高，为蚜虫预警和绿色防控提供关键技术支撑，在蚜虫防治领域具有十分重要的应用价值，可应用于蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警等领域。

附图说明

[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0023] 图1为本发明实施例1提供的油菜蚜虫视蛋白基因的电泳图；

[0024] 图2为本发明实施例3提供的油菜蚜虫视蛋白CRY1的结构功能域分析结果；

[0025] 图3为本发明实施例3提供的油菜蚜虫视蛋白CRY1跨膜结构预测及亚细胞定位结果图；

[0026] 图4为本发明实施例3提供的油菜蚜虫视蛋白CRY1的二级结构预测结果；

[0027] 图5为本发明实施例3提供的采用邻接法构建的油菜蚜虫视蛋白CRY1基因系统发育树。

具体实施方式

[0028] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0029] 下面对本发明实施例的一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法及引物和试剂盒进行具体说明。

[0030] 一方面，本发明提供了一种检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其包括：

[0031] 序列比对，比对目标蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列；

[0032] 根据序列比对结果，判断目标蚜虫的蓝光趋光性。

[0033] 本发明的研究结果显示，蚜虫的蓝光受体视蛋白CRY1的序列的变异与其蓝光趋光性存在相关关系。因此，通过比对目标蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜(对蓝光敏感、具有蓝光趋光性)的CRY1蛋白的序列，根据序列比对结果即相似度，可判断出目标蚜虫的蓝光趋光性。

[0034] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，若所述目标蚜虫的CRY1蛋白与所述豌豆蚜的CRY1蛋白序列之间的相似度低于或等于90％，则所述目标蚜虫缺失蓝光趋光性；若所述目标蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白序列之间的相似度高于90％，则目标蚜虫具有蓝光趋光性。

[0035] 需要说明的是，本发明的所指的蓝光的波长为440～480nm。

[0036] 本发明的研究显示豌豆蚜对蓝光敏感，趋光性强，豌豆蚜的CRY1蛋白序列(如Seq ID No.9所示)可作为参考序列，用于判断其他类型蚜虫的趋光性。

[0037] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，在序列比对之前，上述检测方法还包括：获取目标蚜虫的编码CRY1蛋白的CRY1基因序列。

[0038] 通过CRY1基因序列，得到相应的CRY1蛋白氨基序列。

[0039] 需要说明的是，该CRY1基因序列为cDNA序列，非结构基因序列。

[0040] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述检测方法包括：以目标蚜虫的cDNA为模板，用Seq ID No.5-6所示的引物进行PCR扩增，对得到的目标片段进行测序，得到目标蚜虫的CRY1基因序列，其中，目标蚜虫为油菜蚜虫例如桃蚜(Myzus persicae)。

[0041] 由于不同类别的蚜虫蓝光受体受体视蛋白基因序列具有较高的同源性，该检测也可以广泛应用到其他作物蚜虫的预报和防治。

[0042] 例如目标蚜虫还可以是甘蓝蚜(Brevicoryne Brassicae L)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)。

[0043] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，PCR扩增的退火温度为55℃。本发明的发明人通过优化，获得了可快速地扩增油菜蚜虫的引物对即Seq ID No.5-6所示的上游引物和下游引物。该引物对可直接以油菜蚜虫的cDNA为模板，扩增出用于序列对比的油菜蚜虫CRY1基因片段，测序后，进行序列比对。

[0044] 进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述检测方法还包括：提取目标蚜虫的RNA，反转录后得到cDNA。

[0045] 另一方面，本发明提供了上述检测蚜虫蓝光趋光性的方法在蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警中的应用。

[0046] 通过本发明提供的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，获得目标蚜虫的蓝光趋光性结果，根据结果，为及时进行蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警等工作提供科学、合理的依据，有助于提高对目标蚜虫的诱杀效果。例如，根据检测结果判断出目标蚜虫具有蓝光趋光性，则在进行诱杀时，及时安装蓝光灯或蓝色板等。若根据检测结果判断出目标蚜虫不具有蓝光趋光性，则在进行诱杀时，不安装蓝光灯或蓝色板等，避免无效的工作和不必要的设备安装。

[0047] 另一方面，本发明提供了用于检测蚜虫蓝光趋光性的引物，其包括用于扩增所述目标蚜虫的CRY1基因的引物对。

[0048] 另一方面，本发明还提供了用于检测蚜虫蓝光趋光性的试剂盒，其包括上述的用于检测蚜虫蓝光趋光性的引物。

[0049] 总之，本发明的提供的检测蚜虫蓝光趋光性的方法，其通过比对目标蚜虫的蓝光受体视蛋白即CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白的氨基酸序列，根据序列比对结果，判断目标蚜虫的蓝光趋光性强弱；该检测方法时间短，准确性高，避免了传统测定趋光性方法所存在的工作量大、用时较长、易受环境因素影响等缺陷，是一项重大技术革新，效率显著提高，为蚜虫预警和绿色防控提供关键技术支撑，在蚜虫防治领域具有十分重要的应用价值，可应用于蚜虫防治、蚜虫虫情预测或蚜虫预警等领域。且本发明提供的用于检测蚜虫蓝光趋光性的引物和试剂盒可以快速、简单、准确地扩增出目标蚜虫的CRY1基因片段。

[0050] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0051] 实施例1

[0052] 油菜蚜虫(主要为桃蚜Myzus persicae)视蛋白基因CRY1的克隆。

[0053] 1、蚜虫总RNA提取及cDNA反转录

[0054] 使用Trizol试剂提取油菜蚜虫总RNA，具体步骤如下：(1)在超低温冰箱取冻存样品50mg左右倒入研钵中，充分研磨。粉末转入加有1mL Trizol试剂的干净离心管中，剧烈震荡，然后室温放置10min，12000rpm4℃离心10min，取上清转移至新的离心管。(2)加入0.2mL氯仿，震荡30s，室温放置10min。12000rpm 4℃离心10min。(3)取上层水相至新的离心管，加入400μL的异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm 4℃离心10min，弃上清。(4)加入75％乙醇1mL洗涤沉淀，沉淀悬浮2min，12000rpm 4℃离心5min，弃上清。(5)重复步骤(4)。室温干燥10min。(6)加入40μL RNase-free ddH2O，完全溶解RNA。(7)通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，比较28S和18S的亮度判断RNA的质量。

[0055] 对RNA进行定量和纯度检测，测得OD260/OD280的比值为2.08，OD260/OD230比值为1.96，表明RNA的纯度较好。1.2％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，条带非常的清晰，没有出现拖尾现象，说明RNA完整性较好，可以进行反转录以及普通PCR扩增。

[0056] 反转录生成cDNA具体步骤如下：

[0057] (1)根据Nano-drop 2000c测得的RNA浓度，取部分RNA稀释成1μg/μL作模板准备反转录。

[0058] (2)取2μL模板RNA，依次加入6μL RNase free ddH2O，1μL Oligo dT Primer(50μM)，1μL dNTP Mixture(10mM)，使体积为10μL。混匀后短暂离心，在PCR仪中65℃加热5min，随后冰上冷却10min。

[0059] (3)在PCR管中再依次加入4.5μL RNase free ddH2O，4μl 5×Prime Script II Buffer，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)，1μL PrimeScript II RTase(200U/μL)，最终的总体积为20μL。轻弹混匀后短暂离心，在PCR仪中42℃温浴60min，再进行70℃加热15min的失活反应。随后生成的cDNA可保存在-20℃冰箱中备用。

[0060] 2、油菜蚜虫蓝光受体视蛋白基因CRY1的引物设计及中间片段扩增

[0061] 在NCBI上下载昆虫的视觉基因CRY1的cDNA序列进行比对，找到保守区，再设计扩增中间片段的简并引物Seq ID No.1-2(序列如表1所示)。

[0062] 表1油菜蚜虫视蛋白基因扩增的相关引物

[0063]Seq ID 引物名称 序列(5'-3')
Seq ID No.1 CRYF1 CGCYTNCAYGAYAAYCC
Seq ID No.2 CRYR1 CARTARAARAAYTCNCKCCA
Seq ID No.3 CRY13RAO GATTACGCCAAGCTTCGCTGGTAACTGGATTTGGGTGTC
Seq ID No.4 CRY15RAO AAATGAGTTGGCTGGTCACGCTGTGATTACGCCAAGCTT
Seq ID No.5 CRY1U CACTGATTACTCAACAGATG
Seq ID No.6 CRY1D ATGTTTTGTTAAATTATTAAAATC

[0064] CRY1基因中间片段的PCR克隆基因片段：

[0065] 以cDNA为模板，PCR反应体系和条件如下：

[0066]

[0067]

[0068] PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃30s，45℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。PCR结束后，吸取5μL PCR产物与6×loading buffer混合后，点入1.2％的琼脂糖凝胶孔内，120V，60mA，电泳检测检测目的条带，在DNA蛋白质凝胶成像系统中观察结果。

[0069] 对CRY1基因的cDNA中间片段进行测序，获得序列后进一步设计用于扩增3′cDNA的引物Seq ID No.3，以及扩增5′cDNA的引物Seq ID No.4(序列如表1所示)。

[0070] 3、蚜虫视蛋白基因序列全长扩增

[0071] cDNA末端快速扩增(RACE)技术是采用PCR技术由已知的部分序列来扩增出完整的5′/3′cDNA的末端，从而得到cDNA的全长。

[0072] 5′/3′RACE操作步骤按照RACE试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：

[0073] (1)取部分RNA稀释成1μg/μL作模板准备反转录。

[0074] (2)在干净的PCR管中加入4μL 5X First-Strand Buffer，0.5μL DTT(100mM)，1μL dNTPs(20mM)，体积为5.5μl，混匀后短暂离心，放置冰上备用。

[0075] (3)取两个干净的PCR管，分别标记5′RACE和3′RACE。在5′RACE管中依次加入8μL Sterile H2O，2μL RNA，1μL 5′-CDS-Primer A(试剂盒提供的通用引物)，体积为11μL。在3′RACE管中依次加入9μL Sterile H2O，2μL RNA，1μL 3′-CDS-Primer A，体积为12μL。混匀后短暂离心，在PCR仪中72℃加热3min，42℃温浴2min，然后14000rpm离心10s，立即置于冰上。

[0076] (4)在5′RACE管的反应液中加入1μL SMARTer II A Oligonucleotide。

[0077] (5)分别在步骤(1)的混合液中加入0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和2μL SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)，体积为8μL，混匀后短暂离心，置于冰上。

[0078] (6)将8μL的混合液分别加入到5′RACE管和3′RACE管，总体积为20μL，混匀后短暂离心。

[0079] (7)在PCR仪中42℃温浴90min，70℃加热10min。

[0080] (8)根据RNA的浓度加入适量的Tricine-EDTA Buffer(总RNA的浓度>200ng，加入90μL Tricine-EDTA Buffer)，即分别制得5′/3′RACE的cDNA模板，可保存在-20℃冰箱。

[0081] 根据之前扩增得到的中间片段序列，使用Primer Premier 5.0分别设计5′/3′RACE的引物Seq ID No.3-4(序列如表2所示)。RACE PCR反应体系如下：

[0082]

[0083] 其中，GSP为基因特异引物，具体地，为表1所述的Seq ID No.3-4。

[0084] 采用touchdown PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃2min，25个循环；72℃延伸10min。由于扩增的片段大小在0.2-2kb的范围，故延伸时间设为2min。PCR结束后，产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测检测目的条带，在DNA蛋白质凝胶成像系统中观察结果。

[0085] 使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR或RACE产物，具体操作步骤按照产品说明书进行，在1.2％的琼脂糖凝胶中切取目的DNA条带，将离心、洗脱得到的目的DNA产物连接到pEASY-T1Cloning Vector上，再转入至感受态细胞Trans 5a中，均匀涂平板风干后，放入恒温培养箱中37℃过夜培养(12-16h)，直至长出菌落。在超净工作台中挑选单克隆菌落，再使用通用引物M13Forward Primer和M13Reverse Primer做菌落PCR鉴定阳性克隆。挑选鉴定后条带清晰、大小合适的阳性菌液送往武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

[0086] 4、油菜蚜虫视蛋白基因CRY1的序列分析与比对

[0087] 通过分段进行PCR扩增的策略，获得了油菜蚜虫CRY1基因中间片段序列，其长度为1300bp；通过RACE扩增的获得了CRY1基因下游的1000bp片段，基因上游的750bp的片段(如图1所示，图中：A：cry1基因PCR扩增结果；B：cry1基因菌液检测结果；C：cry1 3′RACE扩增结果；D:cry13′RACE菌液检测结果；E：cry1 5′RACE扩增结果；F：cry1 5′RACE菌液检测结果)。
通过序列拼接显示，油菜蚜虫CRY1基因序列全长为2445bp，序列如Seq No.7所示。通过DNAMAN软件翻译，发现油菜蚜虫CRY1视蛋白基因序列的开放阅读框长1665bp，共编码554个氨基酸(SEQ ID NO.8)。起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。编码区两侧分别为439bp的5′非翻译区和341bp的3′非翻译区。

[0088] 实施例2

[0089] 为了便于检测和应用，本实施例提供了一种检测油菜蚜虫蓝光趋光性的引物，其包括Seq ID No.5-6所示的引物。

[0090] 利用实施例1提供的油菜蚜虫的cDNA为模板，序列Seq ID No.5-6为引物，可一次性PCR扩增获得了油菜蚜虫视蛋白基因CRY1的全长序列，PCR反应体系如下：

[0091]ddH2O 13.6μL
10×Buffer 2.0μL
dNTP(2.5mM) 1.6μL
cDNA 1.0μL
上游引物Seq ID No.5(10μM) 0.8μL
下游引物Seq ID No.6(10μM) 0.8μL
Taq酶 0.2μL
总体系 20.0μL

[0092] PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。

[0093] 经测序及比对分析发现，其核苷酸序列与RACE结果完全相同(Seq ID No.7)。

[0094] 因此，在后续检测中仅仅使用序列Seq ID No.5-6为引物，以便提高效率。

[0095] 实施例3

[0096] 油菜蚜虫视蛋白CRI的生物信息学分析与判别

[0097] 1、油菜蚜虫CRY1视蛋白的保守结构域分析

[0098] 油菜蚜虫视蛋白序列保守结构分析通过SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)完成。利用Smart分析，结果显示，CRY1视蛋白有DNA光解酶蛋白家族和DNA光解酶FAD结合蛋白家族保守结构域，但是没有结合位点(图2)。

[0099] 2、油菜蚜虫CRY1视蛋白跨膜结构预测及亚细胞定位

[0100] 利用TMHMM Server v.2.0进行蛋白序列跨膜区分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测油菜蚜虫视蛋白跨膜结构。分析表明：油菜蚜虫CRY1视蛋白没有发现跨膜结构，亚细胞定位在细胞质上(如图3所示，图中：A:油菜蚜虫CRY1视蛋白跨膜结构；B：油菜蚜虫CRY1视蛋白亚细胞定位)。而CRY1视蛋白定位在细胞质上，与相似性较高的麦双尾蚜定位在细胞核、豌豆蚜定位在高尔基体上不同，因此蓝光受体蛋白可能已经失去。

[0101] 3、油菜蚜虫CRY1视蛋白二级结构预测

[0102] 利用在线工具PBIL LYON-GERLAND(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_hnn.html)对油菜蚜虫CRY1视蛋白进行二级结构预测。结果表明：CRY1视蛋白二级结构主要以随机卷曲结构(Cc)为主，约占50.18％；α螺旋(Hh)约占33.94％，延伸链(Ee)约占15.88％(图4)。

[0103] 4、油菜蚜虫CRY1视蛋白聚类分析

[0104] 运用Mega 6.0软件和ClustalX软件对从NCBI数据中获得的其它昆虫视蛋白氨基酸序列和本发明获得的油菜蚜虫视蛋白序列进行比对，然后运用Mega 6.0软件应用N-J法(邻接法)构建系统发育树。采用邻接法构建油菜蚜虫CRY1视蛋白氨基酸序列的系统发育树。

[0105] 结果表明：油菜蚜虫(主要为桃蚜M.persicae)CRY1视蛋白与麦双尾蚜(Diuraphis noxia)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)亲缘关系最近，为一族；褐飞虱(Nilaparvata lugens)为一族；果蝇(Drosophila melanogaster)为一族；黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)为一族；二化螟(Chilo suppressalis)为一族；粘虫(Mythimna separate)和柞蚕(Antheraea pernyi)为一族；其中与柞蚕的遗传距离较远(如图5所示，图中：CRY1氨基酸序列来源于GeneBank登录号：麦双尾蚜(D.noxia CRY1)(XP_015369276.1)、豌豆蚜(A.pisum CRY1)(CAY26038.1)、褐飞虱(N.lugens CRY1)(AJY53623.1)、二化螟(C.suppressalis CRY1)(CDK02014.2)、黑脉金斑蝶(D.plexippus CRY1)(AAX58599.1)、柞蚕(A.pernyi CRY1)(AAK11644.1)、粘虫(M.separata CRY1)(AFR54426.1)、果蝇(D.melanogaster CRY1)(NP_732407.1))。

[0106] 通过油菜蚜虫(即桃蚜M.persicae)CRY1蛋白和豌豆蚜(A.pisum)的CRY1蛋白的氨基酸序列比对，发现二者的相似性仅为84％，已经发生明显的功能分化，油菜蚜虫CRY1视蛋白很可能已经不具备蓝光受体的功能；而麦双尾蚜(D.noxia)与豌豆蚜(A.pisum)的相似性为91％，且两者均具有蓝光趋光性，因此，可以将豌豆蚜(A.pisum)的CRY1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.9，GenBank序列公开号：CAY26038.1)作为参考序列，与其序列的相似性为90％设置为判断蓝光趋光性的阈值。

[0107] 实施例4

[0108] 本实施例以油菜蚜虫为目标蚜虫，对本发明提供的检测油菜蚜虫蓝光趋光性的方法进行说明，其包括：

[0109] 运用ClustalX软件比对由实施例1得到的油菜蚜虫的CRY1视蛋白的氨基酸序列(Seq ID No.8)与豌豆蚜的CRY1蛋白的序列；

[0110] 根据序列比对结果，判断油菜蚜虫的蓝光趋光性；

[0111] 若油菜蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的CRY1蛋白序列之间的相似度低于或等于90％，则油菜蚜虫缺失蓝光趋光性；若油菜蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白序列之间的相似度高于90％，则油菜目标蚜虫具有蓝光趋光性。

[0112] 结果显示：油菜蚜虫的CRY1蛋白与豌豆蚜的CRY1蛋白序列之间的相似度为84％。由此判断该油菜蚜虫不具有蓝光趋光性

[0113] 实施例5

[0114] 油菜蚜虫蓝光受体视蛋白受损，不具备蓝光趋光性的验证

[0115] 油菜蚜虫即桃蚜(M.persicae)对不同波长光的趋性已被实践所证实，并成功应用于测报和防治。Kirchner等(Evidence for trichromacy in the green peach aphid,Myzus persicae,(Sulz.)(Hemiptera:Aphididae).Journal of Insect Physiology,2005,51(11):1255-1260.)的室内电生理测定表明，桃蚜的视觉系统由紫外光感受器、蓝光感受器和绿光感受器组成，分别对320～330，440～480和530～560nm的色光敏感。不同来源的蚜虫其蓝光感受器可能存在较大差异。

[0116] 按照实施例1描述的方法在相同地块采集油菜蚜虫，带回室内进行440～480nm(蓝光)趋光性测定试验，以便明确油菜蚜虫是否缺失蓝光感受器。

[0117] 蚜虫的趋光性测定方法参照文献(付国需等，桃蚜对不同单色光趋性反应的测定，昆虫学报，2009，52(10)：1171-1176)。简单地，趋光性生物测定装置为单臂套管结构，由光源和光路、滤光片和硅橡胶接口、生物测定套管3部分组成。每处理15头蚜虫，重复5次。每组试验先进行无光对照测定，不开启光源让蚜虫自由扩散；然后不安装滤光片，进行溴钨灯全光谱反应测定；最后选取440～480nm滤光片进行单色光反应测定。每次测定时，用软毛笔收集15头蚜虫同时释放入内衬管的释放区，30min后，分别记录每头供试蚜虫的位移距离。计算各处理的平均位移，以平均位移作为评价指标，可以从行为学角度分析桃蚜的趋光性。试验对象为油菜蚜虫和豌豆蚜虫。

[0118] 试验结果表明，具有典型三色视觉系统的豌豆蚜虫在蓝光条件下的平均迁移量为14.21cm，说明对蓝光十分敏感，趋光性强；而油菜蚜虫在相同条件下的平均位移量仅为
4.16cm，t测验发现两者差异达到极显著水平(P<0.001)，从而确认了被测油菜蚜虫确实缺失了蓝光受体视蛋白，与实施例4的基因检测结果相符。

[0119] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。