一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法

摘要

一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，属于鱼类养殖技术领域，它的步骤如下：(1)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；(2)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；(3)将所获得的有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；(4)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼，挑选出来直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产；本发明证明了大菱鲆WW鱼可以成活和繁殖，为利用超雌鱼进行商业化生产大菱鲆全雌苗种奠定了基础；同时制备周期缩短了50％以上，成本则只有现有技术的几分之一至十几分之一。

权利要求

1.一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，其特征在于它的步骤如下：（1）采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；（2）对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；（3）将所获得的有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；（4）对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼，挑选出来直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产；

步骤（1）所述遗传失活鱼类异源精子选择的标准：1）遗传失活鱼类异源精子与大菱鲆卵人工授精的受精率高于70%；2）杂种仔鱼不能成活；

所述的苗种培育，雌核发育初孵仔鱼布池时水温与孵化水温相同，即均为13-15℃，每天升温1℃，水温上升至18℃时停止，在苗种全长达到50mm以前，苗种培育水温严格控制在

18±0.5℃；

所述步骤（4）所述对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，具体方法为雌核发育后备亲鱼年龄达到4龄以后，预定产卵期前3个月，开始进行促熟和产卵调控，控制条件为光照强度300-500lx，光照周期16h光照：8h黑暗，水温13±0.5℃；经过3个月的促熟和产卵调控培育，部分雌核发育雌鱼达到性成熟，将发育成熟和可以产卵的雌鱼挑选出来，就是超雌亲鱼。

2.根据权利要求1所述的一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，其特征在于步骤（1）所述的遗传失活鱼类异源精子为真鲷冷冻精子。

3.根据权利要求1所述的一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，其特征在于步骤（1）中遗传失活鱼类异源精子与大菱鲆卵子受精后85-90min，将受精卵置于静水压机的压力舱中，在

75MPa压力强度下进行休克处理，持续处理6min后泄压，取出受精卵，置于孵化器中继续孵化；压力处理过程中海水温度14.5±0.5℃。

4.根据权利要求1所述的一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，其特征在于步骤（3）中有丝分裂雌核发育后备亲鱼培育方法为大菱鲆有丝分裂雌核发育苗种全长达到100mm后，逐尾采用PIT和荧光双重标记后，与普通健康苗种同池混养。

说明书

一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法

技术领域

[0001] 本发明属于鱼类养殖技术领域，具体地涉及一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法。

背景技术

[0002] 作为我国北方重要的养殖鱼类，大菱鲆(Scophthalmus maximus)雌雄生长差异显著，养殖24个月雌鱼体重是雄鱼的1.8倍(Imsland et al.,1997，Aquaculture Research,28:101–114)，养殖全雌苗种成为提高大菱鲆养殖效率的一种重要技术手段而广受关注。

[0003] 根据推测，大菱鲆的性别决定机制为雌性异配的ZW型，生产全雌苗种可供选择的方法包括3种：(1)人工挑选雌性苗种；(2)性别分化期间采用雌激素处理诱导表型全雌的苗种；(3)制备超雌鱼亲鱼(WW雌鱼)，利用超雌鱼与普通ZZ雄鱼交配，生产基因型和表型都是雌性的全雌苗种。采用人工挑选雌性苗种的方法，需要淘汰一半左右的雄性苗种，会显著增加苗种生产成本，另外，大菱鲆外表无雌雄差异性特征，性别特异的分子标记成本高、准确率低，也无法大规模采用，因此人工挑选的方法不可取。雌性激素直接诱导的方法有污染环境和影响食品安全的可能性，已被许多国家禁用；而制备超雌亲鱼，利用超雌亲鱼与普通雄鱼交配生产全雌苗种的方法，可以避免上述两种方法的缺点，成为实现大菱鲆全雌苗种商业化生产的最佳途径之一。

[0004] 迄今为止，对ZW型性别遗传决定的鱼类研究较少，WW型超雌鱼本身不是一个自然存在的基因型，具备这种人为诱导产生的基因型鱼类是否可以正常发育和成熟尚未见报道。有关大菱鲆超雌亲鱼的制备，Baroiller和D'Cotta 2016年(Sex Dev 10:242-266,2016)提出一条通过激素诱导和测交筛选相结合的大菱鲆超雌亲鱼制种技术路线，也因为制种周期长和成本高，至今还没有得到完整实施。

发明内容

[0005] 本发明公布了一种制备大菱鲆超雌亲鱼的方法，以解决目前不能利用超雌鱼进行全雌苗种生产的难题。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，它的步骤如下：(1)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；(2)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；(3)将所获得的有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；(4)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼，挑选出来直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产；

[0008] 步骤(1)所述遗传失活鱼类异源精子选择的标准：1)遗传失活鱼类异源精子与大菱鲆卵人工授精的受精率高于70％，以保证有较高的诱导效率；2)杂种仔鱼不能成活，保证即使精子的遗传失活处理失败，所形成的杂种胚胎也不能培育出苗种，以节省后续苗种筛选工序。

[0009] 进一步，步骤(1)所述的遗传失活鱼类异源精子为真鲷冷冻精子。

[0010] 进一步，步骤(1)中遗传失活鱼类异源精子与大菱鲆卵子受精后85-90min，将受精卵置于静水压机的压力舱中，在75MPa压力强度下进行休克处理，持续处理6min后泄压，取出受精卵，置于孵化器中继续孵化；压力处理过程中海水温度14.5±0.5℃。

[0011] 进一步，步骤(2)所述的苗种培育，在大菱鲆苗种全长20-50mm期间，培育水温严格控制在18±0.5℃，以抑制WW苗种表型雄性化。

[0012] 进一步，步骤(3)中有丝分裂雌核发育后备亲鱼培育方法为大菱鲆有丝分裂雌核发育苗种全长达到100mm后，逐尾采用PIT和荧光双重标记后，与普通健康苗种同池混养。上述有丝分裂雌核发育后备亲鱼生长速度慢，人工养殖条件下，普通雌鱼3龄就能达到性成熟，而有丝分裂雌核发育雌鱼成熟年龄比普通雌鱼晚1年，至少需要达到4龄才能达到性成熟。

[0013] 进一步，步骤(4)所述对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，具体方法为雌核发育后备亲鱼年龄达到4龄以后，预定产卵期前3个月，开始进行促熟和产卵调控，控制条件为光照强度300-500lx，光照周期16h光照：8h黑暗，水温13±0.5℃。经过3个月的促熟和产卵调控培育，部分雌核发育雌鱼达到性成熟，将发育成熟和可以产卵的雌鱼挑选出来，就是超雌亲鱼，可以直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产。

[0014] 本发明与现有技术相比的有益效果：

[0015] (1)本发明证明大菱鲆WW超雌鱼可以成活和繁殖。WW超雌鱼不是一个自然存在的基因型，目前尽管对性别决定机制为雌性异配的ZW型鱼类研究比较少，但是已经发现个别拥有该类型性别决定机制的鱼类，如半滑舌鳎，WW超雌鱼苗种不能成活。本发明证明了大菱鲆WW超雌鱼可以成活和繁殖，为利用超雌鱼进行商业化生产大菱鲆全雌苗种奠定了基础。

[0016] (2)本发明对有丝分裂雌核发育苗种与普通健康苗种进行同池混养的方法，是因为严重近交，大菱鲆有丝分裂雌核发育苗种成活率低、体质弱，单独长期养殖，会因苗种数量较少，养殖水槽面积小了环境不稳定，面积大了会因密度太小难于管理，标记后与普通健康苗种混养，这样既可以保证养殖环境的相对稳定，同时又方便了投喂和换水等正常管理，可以提高雌核发育苗种的养殖成活率。

[0017] (3)Baroiller和D'Cotta 2016年提出的通过激素诱导和测交筛选相结合的大菱鲆超雌亲鱼制备方案，包括两代亲鱼培育和两次测交筛选，从开始制种到获得可以成熟繁殖的超雌亲鱼，时间至少需要8年时间(每代亲鱼培育需要4年时间：亲鱼成熟3年+测交筛选1年，2代亲鱼培育和测交合计8年)，工作量上制备10尾WW雌鱼至少需要建立32个测交家系(2个ZW/ZZ雄鱼+30个ZW/WW雌鱼)。本发明提出的超雌鱼制种技术，从相同的起点开始，只需
4年时间，而且中间不需要任何激素诱导处理和测交验证，制备周期缩短了50％以上，成本则只有前者的几分之一至十几分之一。

附图说明

[0018] 图1为本发明实施例操作流程图。

具体实施方式

[0019] 以下结合图1具体说明大菱鲆超雌鱼制种方法，具体按以下步骤实施，其中没有交代的技术细节为本领域的普通技术常识。

[0020] 实施例1

[0021] 一种大菱鲆超雌亲鱼的制种方法，它包括如下步骤：(1)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵；(2)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种；(3)将所获得的有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼；(4)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼，挑选出来直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产；具体步骤如下：

[0022] (一)采用遗传失活鱼类异源精子诱导有丝分裂雌核发育的方法获得大菱鲆有丝分裂雌核发育卵。

[0023] (1)鱼卵采集：人工养殖大菱鲆亲鱼经过2个月左右的光温调控促熟培育后，性腺开始发育成熟，采用人工挤卵的方法定期对排卵亲鱼进行人工采卵，从获得的卵子中选择卵质好、每尾单次排卵量超过250mL的卵，置于干燥洁净的器皿内，于14.5±0.5的室温下避光保存备用。

[0024] (2)真鲷冷冻精子遗传失活处理：装有真鲷冷冻精液的冻存管从液氮中取出后，采用快速水浴解冻(水温37-40℃)，解冻过程中轻轻摇动冷存管，至冷存管中样品溶解，取出。用4℃预冷的Hank’s保护液将解冻后的精液稀释至原始精液浓度的20倍(原始精液:保护液＝1:19)。取稀释后的精液20μL置于干净的载玻片上，用吸管滴加2滴海水，镜检精子活力，取同一视野下快速直线运动精子比例高于70％的稀释精液备用。将稀释的真鲷精液平铺在直径12-15cm的细胞培养皿中(厚度0.4mm)，采用紫外交联仪(型号SCIENT Z03-Ⅱ，宁波新芝生物科技有限公司)进行照射处理，照射剂量为7200erg·mm-2，照射后的精液迅速避光转移至干燥洁净的黑色玻璃杯中，镜检精子活力，并于4℃避光保存备用。

[0025] (3)人工授精：灭活精液与卵子体积比按1:20-30比例混合均匀，添加精卵体积2倍体积的新鲜海水进行授精，受精后2min，加入5倍体积的新鲜海水静置，受精后7-10min，以160目网袋收集上浮卵并用10-20倍体积新鲜海水冲洗受精卵，将网袋置于微流水的孵化缸中孵化。新鲜海水盐度28‰-32‰，受精和孵化水温保持在14.5±0.5℃。

[0026] (4)静水压处理：受精后85-90min，将受精卵置于静水压机的压力舱中，在75MPa压力强度下进行休克处理，持续处理6min后泄压，取出受精卵，置于孵化器中继续孵化。压力处理过程中海水温度14.5±0.5℃。

[0027] (二)对所获有丝分裂雌核发育卵进行孵化和苗种培育，得到有丝分裂雌核发育苗种。

[0028] (1)雌核发育卵的孵化：静水压处理完毕后将鱼卵取出放入14.5±0.5℃的海水中流水孵化。

[0029] (2)苗种培育：雌核发育初孵仔鱼布池时水温与孵化水温相同(13-15℃)，每天升温1℃，水温上升至18℃时停止，本实施例通过研究确定大菱鲆的性别分化时期为20.1-43.0mm，因此在苗种全长达到50mm以前，苗种培育水温严格控制在18±0.5℃。苗种培育其他操作为大菱鲆苗种培育常规操作。

[0030] 表1为大菱鲆有丝分裂雌核发育诱导和苗种培育结果。其中，遗传失活的真鲷精液与大菱鲆卵的受精率为84.6％，孵化后1-40日龄的成活率为2.46％，40-60日龄的成活率为51.1％。最终获得150日龄有丝分裂雌核发育苗种94尾，其中雌鱼47尾。培育水温严格控制在18±0.5℃，以便抑制WW苗种性别表型雄性化。

[0031] 表1大菱鲆有丝分裂型雌核发育诱导和苗种培育结果

[0032]

[0033] (三)将所获得的有丝分裂雌核发育苗种养殖成为有丝分裂雌核发育后备亲鱼。

[0034] 雌核发育苗种全长超过10cm后，分别用荧光和PIT双重标记对雌核发育苗种进行标记，其中，荧光标记选择红色荧光，标记位置选择大菱鲆下颌部肌肉，注射剂量10μL/尾，PIT标记选择规格为1.4mm×8mm的小型电子芯片，注射到大菱鲆背鳍最高点下方肌肉，以PIT射频扫码仪扫描，记录个体编号。标记后的大菱鲆有丝分裂型雌核发育幼鱼放入原养殖池中暂养1周时间，检查荧光标记是否脱落、PIT标记能否正常读取，对于荧光标记脱落或者PIT标记无法读取的个体，重新进行标记，确保每尾苗种均保有双重标记，这样，有丝分裂雌核发育幼鱼与普通苗种可通过荧光标记直观的区分，有丝分裂雌核发育幼鱼个体间则可以通过PIT标记逐尾区分。

[0035] 标记后的94尾雌核发育幼鱼与200尾同规格的普通健康苗种同池养殖，养殖水槽的面积为16m2，此后按照正常的养殖方法，将雌核发育幼鱼培育成大菱鲆后备亲鱼，1龄后，随鱼个体增加，将雌核发育苗种和普通苗种分池培育。

[0036] (四)对有丝分裂雌核发育后备亲鱼进行促熟培育和产卵调控，能够正常成熟和采卵的雌鱼即为超雌亲鱼，挑选出来直接用于大菱鲆全雌苗种的商业化生产。

[0037] 有丝分裂雌核发育后备亲鱼达4龄后进行产卵调控，调控的条件为光照强度500-800lx，光周期16h光照:8h黑暗，温度13±0.5℃，经3个月光温调控，将卵巢发育成熟且可以进行采卵操作的有丝分裂雌核发育亲鱼挑选出来，即为大菱鲆超雌亲鱼，可直接与普通ZZ雄鱼交配，生产大菱鲆全雌苗种。