一种HSP90抑制剂在制备防治主动脉疾病药物中的用途

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体是一种HSP90抑制剂的用途，用于制备预防或治疗主动脉夹层的药物或试剂。本发明还提供筛选预防或治疗主动脉疾病的潜在物质的方法，以及预防或治疗哺乳动物主动脉疾病的方法。本发明首次揭示了HSP90的抑制物可特异性地抑制主动脉夹层的破裂，并且首次揭示了HSP90的表达与主动脉疾病密切相关，从而为大血管疾病的防治提供了新的靶点。

权利要求

1.一种HSP90抑制剂的用途，所述的HSP90抑制剂用于制备预防或治疗主动脉夹层的药物或试剂；所述的主动脉夹层为胸主动脉夹层；所述的HSP90抑制剂为17-二甲氨基-17甲氧基格尔德霉素。

2.根据权利要求1所述的HSP90抑制剂的用途，其特征在于，所述的药物或试剂特异性用于主动脉血管壁平滑肌细胞。

3.根据权利要求2所述的HSP90抑制剂的用途，其特征在于，所述的药物或试剂用于抑制血管平滑肌细胞的表型转化。

4.根据权利要求1所述的HSP90抑制剂的用途，其特征在于，所述的药物或试剂特异性地抑制主动脉夹层的发生和破裂。

5.根据权利要求1所述的HSP90抑制剂的用途，其特征在于，所述的药物或试剂降低主动脉夹层的死亡率。

说明书

一种HSP90抑制剂在制备防治主动脉疾病药物中的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种HSP90抑制剂在制备防治主动脉疾病药物中的用途。

背景技术

[0002] 主动脉疾病是发生于主动脉的各类疾病的总称，包括主动脉瘤、主动脉夹层、先天性主动脉疾病等类。这些疾病通常通隐匿，一旦出现症状就极其凶险，手术难度大，死亡率居高不下，因此主动脉疾病正逐渐上升为危害人类健康的主要疾病之一。

[0003] 胸主动脉夹层(thoracic aortic dissection，TAD)是其中最为凶险的疾病，据报道，未经治疗的胸主动脉夹层破裂在24小时以内的死亡率高达50％以上。随着目前诊断准确性的提高和医疗水平的提高，更多的主动脉夹层的患者有机会入院接受手术治疗，但死亡率依旧很高。同时其发生机制也尚未明确，目前越来越多的研究表明血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的生物学性质的改变与胸主动脉夹层的发生有关。

[0004] 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)作为细胞中最丰富的蛋白质家族广泛存在于原核及真核生物中并且在生物进化过程中高度保守。作为HSPs家族重要的蛋白，有报道在应激状态下，热休克蛋白90(HSP90)的产物急剧增加从而参与多项信号转导和应激反应。其下游蛋白大多数是控制细胞分化生长包括肿瘤细胞转移的信号转导分子如表皮生长因子受体2、BCR/ABL融合基因、CDK 4、AKT、突变p53等，这些构象易变蛋白的功能有赖于HSP90来维持，从而抑制HSP90会导致下游蛋白构象发生异常，而形态和功能异常的蛋白会被细胞通过泛素-蛋白酶体通路快速排除。有研究认为HSP90在肿瘤细胞中主要处于活化态，在正常细胞中则主要处于静默态。在处于活化态时，HSP90与蛋白及分子伴侣HSP70、HSP40、Hop、p23、cdc37等偶联形成复合物，保护下游蛋白不被蛋白酶体所降解。

[0005] HSP90抑制剂的发现和研究起始于20世纪60年代，是一类能与HSP90调节位点相结合，具有抑制HSP90活性，引起HSP90构象改变,诱导其底物蛋白降解，阻断细胞生长、增殖和信号传递从而发挥抑制作用的化合物。它能够通过抑制HSP90的正常功能，诱发肿瘤细胞的凋亡。它的主要优点是其可以同时阻断癌细胞形成的多个通路，避免了单一抑制某一通路时肿瘤细胞易产生耐药性的弊端。同时因在肿瘤细胞内，HSP90与多种辅分子伴侣形成复合物以活化状态存在，使得HSP90抑制剂具有高度特异性和选择性。

[0006] HSP90抑制剂主要分为两大类，第一类为天然抑制剂，一般是为从植物中提取的抗生素类化合物，主要包括格尔德霉素类和根赤壳菌素类化合物。第二类为人工设计合成的抑制剂。其中微生物来源的格尔德霉素(Geldanamycin，GA)抗肿瘤活性的发现使HSP90成为治疗癌症的重要靶标，这也使得临床上可行的小分子HSP90抑制剂成为研究的热点。

[0007] 格尔德霉素是最早发现的HSP90抑制剂，它的被发现使得研究HSP90的生物学功能，研究依赖HSP90的蛋白在癌症发展中的作用成为可能，其抗肿瘤作用的发挥主要依赖于通过蛋白水解的途径使那些癌基因蛋白、蛋白激酶失活，而不是直接抑制激酶的催化活性。免疫沉淀和亲和力实验揭示GA的主要作用机制是通过和HSP90的结合实现的。它通过竞争性结合HSP90的N-末端ATP/ADP结构域，从而抑制HSP90的内源性ATP酶的活性。当HSP90的ATP酶活性被抑制后，HSP90所作用的多肽蛋白便不能与HSP90结合而失去稳定性，从而被蛋白体酶水解。虽然GA有很强的抗肿瘤活性，但由于GA的结构中含有苯醌环，该环是肝脏毒性产生的部分原因，为增加GA水溶性降低毒性，可将17位C端上的非必需甲氧基基团取代成胺类基团。利用该位点的取代得到一系列衍生物，如17-烯丙基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)，17-二甲氨基-17甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)，IPI-504，目前这些衍生物已进入临床试验阶段。

[0008] 研究最广泛的HSP90抑制剂17-AAG是第一代格尔德霉素衍生物，早期的研究发现它对黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤有治疗活性。17-AAG的Ⅱ期、Ⅲ期临床试验正在进行，主要是对几种具有特定的HSP90底物蛋白的肿瘤，包括表达Bcr-Abl的白血病和Her-2阳性的乳腺癌。此外，GA的同功异质体17-DMAG由于具有更好的溶解度和口服生物利用率，现已进入I期临床试验阶段。近几年的亚临床和临床研究表明HSP90抑制剂和其它抗肿瘤试剂联合应用于癌症治疗产生了一定的疗效。如今，17-AAG与曲妥单抗的联用已完成临床Ⅱ期试验，试验结果显示两种药物联合应用于曲妥单抗难治型Her-2阳性乳腺癌患者有很好的耐受性并表现出较高的抗肿瘤活性。

[0009] 在心血管系统中，有研究证实HSP90通过调控平滑肌细胞的炎症反应、增殖和迁移参与动脉粥样硬化的病理过程，也有研究表明HSP90参与调控IL6参与的炎症反应从而参与动脉瘤的发病过程。因此HSP90在心血管领域的作用和巨大潜力不容小觑。

[0010] HSP90在大血管中的功能研究有助于我们更好的理解其发病机理，进一步找到大血管疾病相关的药物靶点，填补这一药物治疗的空白区，从而为这类疾病的预防或治疗提供行之有效的途径。

[0011] 中国专利文献CN105727297A公开了一种包含HSP90抑制剂和MTOR抑制剂的药物组合产品，以及使用所述组合产品来治疗或预防增殖性疾病的方法。中国专利文献CN106349180A公开了4,5-二苯基异噁唑衍生物，其具有热休克蛋白HSP90抑制活性，可用于治疗癌症、神经退行性疾病、炎症性疾病、自身免疫性疾病、缺血性脑损伤等用途。将HSP90抑制剂17-AAG应用于抑制平滑肌细胞的增殖及迁移从而缓解动脉粥样硬化等疾病也已有研究表明。但是关于HSP90抑制剂在防治主动脉夹层疾病中的用途目前还未见报道。

发明内容

[0012] 本发明的目的在于提供一种HSP90抑制剂的用途，同时提供一种筛选预防或治疗主动脉夹层的潜在物质的方法，和一种预防或治疗哺乳动物主动脉疾病的方法。

[0013] 本发明的第一方面，提供一种HSP90抑制剂的用途，所述的HSP90抑制剂用于制备预防或治疗主动脉夹层的药物或试剂。

[0014] 在本发明的一个优选实施方式中，所述的主动脉夹层为胸主动脉夹层。

[0015] 在一个优选例中，所述的药物或试剂特异性用于主动脉血管壁平滑肌细胞。

[0016] 在另一优选例中，所述的药物或试剂用于抑制血管平滑肌细胞的表型转化。

[0017] 在另一优选例中，所述的药物或试剂特异性地抑制主动脉夹层的发生和破裂。

[0018] 在另一优选例中，所述的药物或试剂降低主动脉夹层的死亡率。

[0019] 在一个优选例中，所述的HSP90抑制剂选自特异结合并抑制HSP90功能的格尔德霉素(Geldanamycin，GA)及其衍生物。

[0020] 在另一优选例中，所述的格尔德霉素及其衍生物包括：17-二甲氨基-17甲氧基格尔德霉素(17-DMAG)、17-烯丙基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)、IPI-504等。

[0021] 在一个更优选实施方式中，所述的HSP90抑制剂为目前格尔德霉素最前沿的抑制剂17-DMAG。

[0022] 本发明的第二方面，提供一种预防或治疗主动脉夹层的药物或试剂，其包含：治疗有效量的HSP90抑制剂，以及药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。

[0023] 本发明的第三方面，提供一种筛选预防或治疗主动脉疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

[0024] (1)检测候选物质在主动脉疾病中的表达水平；

[0025] (2)用候选物质抑制剂处理主动脉血管平滑肌细胞；

[0026] (3)检测所述体系中平滑肌细胞相关生物活性指标的表达或活性；

[0027] 其中，若所述候选物质可降低平滑肌细胞分泌型标志物的表达并进一步降低候选疾病的发生，则表明该候选物质是预防或治疗主动脉疾病的潜在物质。

[0028] 在一个优选例中，

[0029] 步骤(1)包括：在测试组中，测试候选物质在体系中的表达水平；

[0030] 步骤(2)包括：在测试组中，首先诱导平滑肌细胞向分泌型转化，再将候选物质加入到血管壁平滑肌的培养体系中；

[0031] 步骤(3)包括：检测测试组的体系中平滑肌细胞分泌型标志物的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的培养体系；

[0032] 如果测试组中平滑肌细胞分泌型标志物的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。

[0033] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗主动脉疾病有用的物质。

[0034] 在一个更优选实施方式中，所述方法包括：

[0035] (1)检测所述疾病中HSP90的表达；和(2)用HSP90抑制剂处理表达HSP90的主动脉疾病中主动脉夹层体系；其中，若所述候选物质可降低HSP90的表达或活性并降低主动脉夹层的破裂，则表明该候选物质是预防或治疗主动脉夹层疾病的潜在物质。

[0036] 本发明的第四方面，提供一种预防或治疗哺乳动物主动脉疾病的方法，所述方法包括：通过特异性抑制剂对所述哺乳动物体内HSP90的表达水平进行下调以抑制主动脉夹层的发生。

[0037] 本发明优点在于：

[0038] 本发明首次揭示了HSP90的抑制物可特异性地抑制主动脉夹层的破裂，并且首次揭示了HSP90的表达与主动脉疾病密切相关，从而为大血管疾病的防治提供了新的靶点。

附图说明

[0039] 图1.定量PCR及免疫组化对人主动脉组织HSP90的表达进行分析，以期获得HSP90在正常主动脉及夹层组织中的差异表达。A，定量PCR结果显示，与正常组织相比，主动脉夹层患者的主动脉组织HSP90表达较对照组明显上升。B，免疫组织化学染色显示HSP90阳性主要表达在血管壁中膜层血管壁平滑肌细胞。

[0040] 图2.主动脉夹层疾病与主动脉血管壁平滑肌细胞表型转化相关。A，Western blot结果显示主动脉夹层组织中HSP90蛋白表达量也高于对照组，同时在主动脉夹层组织中平滑肌细胞收缩型标志物下降及分泌型标志物上升。B，对Western Blot结果进行Spearman相关性分析显示HSP90的表达量与分泌型标志物OPN呈正相关，而与收缩型标志物SM22呈负相关。

[0041] 图3.β-BAPN联合Ang II方法建立FVB小鼠主动脉夹层模型。对照组及主动脉夹层小鼠心脏及主动脉的大体照片，血管壁破裂出血表示假腔形成，进一步标志着建模成功，根据假腔出现的解剖位置将主动脉夹层分为胸主动脉夹层及腹主动脉夹层。

[0042] 图4.应用HSP90抑制剂17-DMAG干预主动脉夹层模型小鼠，发现显著降低模型死亡率。A，对比模型组，药物干预组的小鼠死亡率明显降低。B，对比模型组显著限制了了小鼠体重的增加，药物干预对小鼠体重的减少无明显改善。C，对比模型组对血压的影响，药物干预组的小鼠舒张压有明显改善，而收缩压变化无统计学差异。D，药物干预能显著降低胸主动脉夹层的发生率及破裂事件的发生率。

[0043] 图5.HSP90抑制剂17-DMAG微观上能显著改善主动脉血管壁的破坏程度，其可能是通过抑制平滑肌细胞的表型转化实现的。A，常规HE和VB染色显示对比模型组，药物干预组显著改善了主动脉血管壁的破坏程度。B，Western blot结果显示与模型组相比，药物干预组的HSP90表达明显减少，同时检测出平滑肌细胞收缩型标志物上升及分泌型标志物下降。

[0044] 图6.HSP90抑制剂17-DMAG可抑制由PDGF-bb诱导的平滑肌细胞表型转化。A，免疫荧光显示HSP90在PDGF-bb诱导下显著升高，而17-DMAG抑制了HSP90的表达。B，定量PCR显示17-DMAG能减轻由PDGF-bb诱导的平滑肌细胞收缩型标志物下降及分泌型标志物上升。C，Western blot确认HSP90抑制剂能减轻由PDGF-bb诱导的平滑肌细胞收缩型标志物下降及分泌型标志物上升。D，定量PCR显示HSP90抑制剂能减轻由PDGF-bb诱导产生的分泌蛋白。

[0045] 图7.HSP90抑制剂17-DMAG可抑制由PDGF-bb诱导的平滑肌细胞增殖、迁移及分泌等功能。A，CCK8结果显示17-DMAG可抑制PDGF-bb诱导的平滑肌细胞增殖功能。B，平板划线结果显示17-DMAG可抑制由PDGF-bb诱导的平滑肌细胞迁移。C，流氏细胞周期结果显示17-DMAG使细胞周期停滞在G1期。D，17-DMAG对PDGF-bb诱导的平滑肌细胞凋亡无显著影响。

具体实施方式

[0046] 本发明经过深入的研究，首次揭示了HSP90抑制剂可特异性地抑制主动脉血管平滑肌细胞的表型转化，并且首次揭示了HSP90的表达通过主动脉血管平滑肌细胞的表型转化与主动脉夹层疾病密切相关，其高表达促进主动脉夹层的发生发展。本发明为主动脉疾病的防治提供了新的靶点。

[0047] HSP90

[0048] 热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是遗传学家Ritossa在1962年首次发现。作为细胞中最丰富的蛋白质之一，热休克蛋白90(HSP90)又称为应激蛋白90(stress-90)，在生物进化过程中高度保守，广泛存在于原核和真核生物中，是细胞中存在最丰富的蛋白质之一。当细胞受到外界刺激时，其表达成倍增加，能够迅速保护细胞对抗内源性进攻，增强细胞修复功能及提高细胞对刺激的耐受力。HSP90除了可将新生肽链或非天然肽的蛋白质折叠成具有天然态的功能蛋白外，还参与信号传递分子构象的变化过程，通过对底物蛋白的作用，影响疾病的发生和发展。

[0049] HSP90的用途

[0050] HSP在多种细胞生理、生化变化及突变过程中作为一个重要的缓冲因子，调控着重要蛋白的空间结构和突变，当生物受到内外环境中的理化、生物、精神等刺激时发生应激反应时，HSP大量表达，以此维持信号转导蛋白的功能。

[0051] 其中HSP90作为一种分子伴侣参与了体内多种生物学过程，如信号转导、蛋白质折叠与成熟等。细胞在正常状态下并不表达HSP90，但在应激状态下，HSP90产物急剧增加，与效应蛋白作用帮助细胞恢复正常并提高其生存能力。它的结合底物主要是信号传导系统的蛋白激酶和一些突变蛋白质，如跨膜酪氨酸激酶(EGFR、Her2)、嵌合信号蛋白(Ab1、Bc1)、亚稳态信号蛋白(Rafl、Akt和IKK)、细胞周期调节蛋白(Cdk4、Cdk6)、突变信号蛋白(p53、Src)以及类固醇激素受体等，这些信号传导分子的过表达或过度激活是肿瘤发生、发展中的重要分子事件。

[0052] HSP90抑制剂及其用途

[0053] HSP90抑制剂可以同时阻断多种信号传导途径，另一方面，由于肿瘤细胞中HSP90蛋白构象与正常细胞中的HSP90蛋白构象有明显差异，HSP90抑制剂对肿瘤细胞的HSP90有很高的亲和力，而对正常细胞的杀伤力较小，副作用相对较低，对肿瘤组织具有一定的靶向性。研究表明，HSP90抑制剂单用或者与其他药物或治疗方法联合使用都具有一定的抗肿瘤效果，因此，HSP90抑制剂被广泛运用于抗肿瘤治疗中。同时，也已有研究将HSP90抑制剂17-AAG应用于抑制平滑肌细胞的增殖及迁移从而缓解动脉粥样硬化等疾病，有研究通过抑制氧化应激从而抑制心梗后缺血再灌注损伤，但是，针对HSP90抑制剂17-DMAG这个靶点进行功能干预能否能运用于主动脉夹层疾病的治疗，目前国内外文献尚未见报导。

[0054] 在得知了HSP90对于主动脉疾病的作用后，本领域人员可以方便地得知可以通过HSP90抑制剂来防治主动脉疾病的发生或发展。因此，任何HSP90的抑制剂都可用于本发明。根据HSP90的特性，本领域人员可以获得多种HSP90的抑制剂。

[0055] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0056] I.材料和方法

[0057] RNA制备

[0058] 将离体的主动脉组织除去内膜及外膜，用PBS清洗3遍后迅速放入液氮进行储存；人主动脉总RNA、小鼠组织以及培养细胞的总RNA用TRIzol(Invitrogen)抽提。

[0059] 实时荧光定量PCR

[0060] 常规方法抽提RNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，以双标准曲线方法定量，分析各样本的RNA浓度，进行常规PCR扩增。

[0061] SD大鼠血管平滑肌细胞培养和表型转化模型

[0062] 取成年SD大鼠，无菌条件下取胸主动脉，除去内膜及外膜，PBS充分清洗后将组织剪碎为0.2*0.2mm小块，0.2％胰蛋白酶37℃消化8小时后离心、收集下层细胞、计数并接种。以20％血清DMEM培养液培养2天后，观察细胞表型并进行鉴定、传代等。

[0063] 小鼠主动脉夹层模型

[0064] 选取重量为16-18克FVB成年雄鼠，随机分为空白对照组，模型组及药物治疗组。对模型组及药物治疗组进行β-BAPN喂养28天；28天后将血管紧张素II微泵埋藏在小鼠皮下48小时，期间进行小鼠每日体重测量，不限制饮食量；对实验过程中死亡的小鼠及时进行解剖并留取胸主动脉组织，28天及48小时模型建立结束后即进行解剖及标本留取。

[0065] 组织学常规染色分析

[0066] 取空白组、模型组及药物干预组小鼠胸主动脉，用4％多聚甲醛固定过夜，脱水，石蜡包埋。石蜡切片(4μm)用苏木精&伊红染色(H&E)及维多利亚兰染色(VB)，封片储存，观察分析。

[0067] 组织免疫组化及分析

[0068] 采用链霉素抗生素蛋白-过氧化酶法。对石蜡切片进行常规脱蜡水化，柠檬酸盐缓冲液热修复抗原，依次滴加过氧化物酶阻断液(37℃封闭10min)、10％非免疫性动物血清(37℃孵育30min)、一抗(1:100稀释，4℃过夜)、生物素标记的二抗(37℃孵育1h)，DAB显色后行苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。结果判定标准：切片均采用双盲法由2位病理科医生独立阅片，细胞质内出现黄褐色颗粒者为阳性结果。

[0069] 细胞免疫荧光

[0070] 4％多聚甲醛细胞固定15分钟后用0.1％Triton X-100通透15min，5％山羊血清室温封闭1小时，以1:500稀释度加入anti-α-actinin抗体(Sigma)4℃孵育过夜。用PBS洗三遍后加入Alexa-555(Molecular Probes)标记的二抗，室温孵育1小时。细胞核用4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)标记，最后封片，避光保存，48小时内观察分析。

[0071] 统计学分析

[0072] 数据以平均值±标准误表示。对于相对基因表达分析，对照组的平均值定义为1。配对数据进行T test；用非配对Student’s t test进行数据统计分析。Sigma plot程序用于数据分析。P<0.05为显著差异。

[0073] II.实施例

[0074] 实施例1、主动脉夹层患者标本收集及HSP90表达水平

[0075] 采用2014年9月起至2015年12月，20例胸主动脉组织取自长海医院胸心外科因急性Stanford A型胸主动脉夹层手术的患者术中切除的病变血管标本，8例正常对照组取自尸检病人，无心血管疾病病史，查阅心超结果证实主动脉不扩张。取材后置于液氮中保存，提取组织样本RNA行定量PCR、提取组织蛋白行Western blot。取1cm大小的组织进行4％多聚甲醛固定，包埋蜡块，行组织化学染色及免疫组织化学染色，结果显示主动脉夹层组HSP90在RNA及蛋白水平显著高于正常对照组(图1及图2A)。说明在胸主动脉夹层病程中，主动脉组织中HSP90明显高于正常，说明HSP90可能参与夹层的发生发展过程中。进一步检测关于平滑肌细胞表型相关标志物，Spearman相关性分析结果显示HSP90的蛋白表达水平与分泌型标志物的蛋白表达水平呈现正相关，而与收缩型标志物的表达呈现负相关(P＜0.05)，因此进一步分析，HSP90可能通过参与平滑肌细胞的表型转化过程从而参与主动脉夹层的发生发展。

[0076] 实施例2、主动脉夹层模型建立及验证

[0077] 选取重量为16-18克FVB成年雄鼠60只，随机分为空白对照组，模型组及药物干预组，每组20只，随机分为4笼，每笼5只，通过剪脚趾分别标记每只小鼠。首先通过无限制喂养1周计算出每笼老鼠每天饮水量，接下来以1克每公斤体重每天对模型组及药物干预组将β-BAPN溶解于纯净水中喂养小鼠，时间为28天；28天后行剪尾法行血压测定，继而将血管紧张素II以1微克每分钟每公斤体重将微泵埋藏在小鼠皮下48小时。实验全程期间每日对小鼠体重进行测量，不限制饮食量；对实验过程中死亡的小鼠及时进行解剖并留取胸主动脉组织，行病理切片及常规染色(图3及图5A)。其余存活小鼠在模型建立结束后即进行解剖，标本分别行液氮保存及甲醛固定。

[0078] 实施例3、HSP90抑制剂17-DMAG对主动脉夹层模型干预

[0079] 在建模过程中，对药物干预组小鼠以10毫克每千克每2天进行给药，药物以无水乙醇溶解，皮下注射，每次药物总量不超过200微升。实验结果显示，药物干预组小鼠未出现死亡事件(图4A)，进而在组织学检测发现未破裂的主动脉组织的形态学也有了明显的改善(图5A)。将胸腹主动脉分别进行统计分析，发现胸主动脉夹层的形成及进一步破裂有明显的减少，而药物干预对腹主动脉夹层的形成无明显效果。

[0080] 实施例4、模型组及药物干预后HSP90及表型转化标志物表达对比[0081] 在组织学水平，我们首先通过Western blot进行了人主动脉组织中平滑肌细胞表型相关标志物的检测，发现在主动脉夹层的疾病过程中，主动脉平滑肌细胞会向着分泌型细胞转化，伴随着分泌型标志物的升高及收缩型标志物的降低，进而我们通过Spearman相关性分析发现HSP90的表达量与平滑肌的表型转化程度呈现正相关(图2)。而后，在模型的干预部分，我们也进行了表型转化相关标志物的检测，发现17-DMAG能在组织学水平抑制表型转化(图5B)，最后在细胞学上我们再次进行了相关的分析及验证，得到了同组织学相同的结论(图6B、C)。

[0082] 实施例5、细胞水平药物干预后对平滑肌细胞其他生物学功能的影响[0083] 在前期预实验及文献报道，HSP90抑制剂对平滑肌细胞的生物学功能有显著影响，包括对增殖、迁移、周期及凋亡的影响。在PDGF-bb的诱导下，平滑肌细胞的增殖、迁移均有明显增加，而17-DMAG抑制了平滑肌的增殖和迁移；其次，17-DMAG能显著抑制平滑肌细胞周期使其停滞在G1期。而PDGF-bb本身对平滑肌细胞的凋亡无明显影响，17-DMAG干预后凋亡的改变也没有统计学意义(图7)。

[0084] III.讨论

[0085] 本项发明的工作中，我们首先通过定量PCR检测到，HSP90在急性主动脉夹层撕裂组织中表达上调，同时通过western blot进行了进一步验证。同时通过免疫组织化学染色，我们将HSP90的表达定为于血管壁中膜层的平滑肌细胞，通过对HSP90表达变化检测及既往对主动脉夹层可能涉及的病理机制研究中，旨在将HSP90的表达异常与主动脉夹层的病理进程联系起来，得出HSP90的过度表达可能与主动脉夹层病理过程有着重要的联系。

[0086] 我们首先猜测作为近几年研究的热门问题，平滑肌细胞作为有潜在分化机制的一类细胞，其在受到病理生理过程的刺激下，会出现向着幼稚细胞分化的潜能；此时成熟的平滑肌细胞就会由收缩功能为主的收缩型细胞向着具有增殖及分泌等功能为主的分泌型细胞转化，目前已证实平滑肌细胞表型转化与多种心血管疾病密切相关，尤其是动脉粥样硬化及动脉瘤。而近年来越来越多的证据指出其与主动脉夹层的发生发展可能有关，于是我们针对这一问题，首先在主动脉夹层组织标本的蛋白表达水平上，确定了主动脉夹层患者的血管壁组织分泌型标志物的表达明显升高而收缩型标志物的表达明显降低，因此我们确证了主动脉夹层的发病机制中伴随着平滑肌细胞的表型转化，进而我们通过对20例主动脉夹层患者组织学蛋白表达量进行了Spearman相关性分析，结果显示HSP90的表达量与平滑肌细胞的表型转化程度呈现正相关，即与分泌型标志物的表达呈正相关，因此我们有理由相信HSP90参与了平滑肌细胞的表型转化过程从而进一步在主动脉夹层疾病的过程中起到了重要的作用。

[0087] 接下来为了进行干预HSP90是否能影响主动脉夹层的发生发展，我们通过β-BAPN联合Ang II的方式成功建立了主动脉夹层的小鼠模型并且对模型进行了HSP90抑制剂17-DMAG的药物干预，在模型水平，成功得出HSP90能有效缓解主动脉夹层血管壁结构的破坏并显著减少模型死亡率。同时通过蛋白表达定量分析，在组织学得出结论，17-DMAG能有效减少分泌型平滑肌细胞，从而可能通过抑制平滑肌细胞表型转化而减少夹层的发生发展。而进一步在分别分析胸主动脉及腹主动脉夹层形成的过程中发现，17-DMAG主要作用于胸主动脉的形成及进一步破裂，这与人主动脉组织的取材部分及疾病类型相一致，也进一步验证了表型转化过程与主动脉夹层疾病的相关性。曾有研究表明，在胚胎发育过程中胸腹主动脉来源于不同胚层，因此胸、腹主动脉夹层的发生机制可能有所不同，因此本发明中涉及的组织学标本及细胞均来源于胸主动脉部分，不再涉及腹主动脉夹层。

[0088] 目前许多HSP90抑制剂已经成熟开发并进行了临床试验。格尔德霉素(Geldanamycin GA)，作为一种HSP90的天然抑制剂，可以通过绑定ATP的N-端从而抑制ATP酶循环，但因其肝毒性较大及溶解度较差而限制了其临床应用。因此，毒性较低的GA衍生物也孕育而生，包括17-AAG，17-DMAG，IPI-504等。最近，许多特异性的HSP90小分子抑制剂也已经被证明具有抗肿瘤活性，如STA-9090，PF-4470296和PF-3823863。我们的前期实验及发明部分，证实了17-DMAG具有对缓解主动脉夹层的相关作用，而更新的抑制剂是否具有类似的治疗价值有待进一步的研究证实。

[0089] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。