本发明公开了一种通过接枝乙烯基单体制备丝素基仿生矿化材料的方法，通过碳二亚胺(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)先在丝素大分子上接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸，再借助辣根过氧化物酶催化改性丝素与丙烯酸单体接枝共聚，制备丝素基仿生矿化材料。具体步骤如下：(1)丝素蛋白溶液的制备；(2)EDC/NHS法接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸；(3)辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚；(4)丝素膜材料的成型；(5)丝素基仿生矿化材料制备。与采用化学法或紫外辐照法等传统方法引发丝素与丙烯酸单体接枝共聚相比，本发明述及的酶促丝素与丙烯酸接枝共聚效率高，处理条件缓和，制备的丝素基仿生矿化材料性能优良。
1.一种通过接枝乙烯基单体制备丝素基仿生矿化材料的方法，其特征是先借助碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行丝素改性，将含乙烯基和酚羟基的羧酸接枝到丝素大分子上，提高丝素蛋白的反应性；再借助辣根过氧化物酶催化改性丝素与丙烯酸单体接枝共聚，制备丝素基仿生矿化材料，具体工艺与步骤如下：(1)丝素蛋白溶液的制备：以溴化锂或氯化钙溶解脱胶后的蚕丝，制备丝素蛋白溶液；
处理工艺处方及条件：将脱胶后的蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的乙醇溶液中，在50～
80℃搅拌至溶解，然后以去离子水透析24～48小时，制得浓度为10～40g/L丝素溶液；
(2)EDC/NHS法接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸：在步骤(1)的丝素溶液中加入EDC、NHS、含乙烯基和酚羟基的羧酸处理，在丝素上引入乙烯基和酚羟基；
处理工艺处方及条件：EDC 1～10g/L，NHS 1～10g/L，含乙烯基和酚羟基的羧酸0.2～
5g/L，温度20～30℃，pH 4.5～7，处理时间0.5～24小时；
(3)辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚：在步骤(2)的丝素溶液中，添加辣根过氧化物酶、乙酰丙酮和丙烯酸，在氮气保护下加入双氧水，促进丝素与丙烯酸接枝共聚；
处理工艺处方及条件：辣根过氧化物酶2～20U/mL，乙酰丙酮5～10g/L，双氧水5～20g/L，丙烯酸5～25g/L，温度20～45℃，pH 6.0～8.0，处理时间0.5～15小时；
(4)丝素膜材料的成型：将步骤(3)反应后的丝素溶液在-50℃～-20℃条件下冷冻干燥成膜；然后将丝素膜在50～80％乙醇溶液中浸渍0.25～1小时，水洗后在30℃烘干；
(5)丝素基仿生矿化材料制备：将步骤(4)处理后丝素膜浸渍在10～50mmol/L氯化钙溶液中，在37℃处理0.5～24小时，进行预钙化；然后再将丝素膜浸渍在1.5倍SBF模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化1～7天，期间每天更换一次模拟体液；最后以去离子水清洗，在-50～-20℃条件下再次冷冻干燥，得到丝素基仿生矿化材料；所述含乙烯基和酚羟基的羧酸包括咖啡酸、阿魏酸、绿原酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶来源于动物、植物或微生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：
(1)丝素蛋白溶液的制备：将脱胶后的蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的乙醇溶液中，在70℃搅拌至溶解，然后以去离子水透析36小时，制得25g/L丝素蛋白溶液；
(2)EDC/NHS法接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸：在步骤(1)的丝素溶液中加入EDC、NHS和阿魏酸处理，其中EDC 5g/L，NHS 4g/L，阿魏酸4g/L，温度25℃，pH 5.75，处理时间18小时；
(3)辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚：在步骤(2)的丝素溶液中，添加辣根过氧化物酶、乙酰丙酮和丙烯酸，在氮气保护下加入双氧水，促进丝素与丙烯酸接枝共聚；
其中辣根过氧化物酶10U/mL，乙酰丙酮6g/L，双氧水7.5g/L，丙烯酸15g/L，温度30℃，pH
(4)丝素膜材料的成型：将步骤(3)反应后的溶液在-50℃冷冻干燥成膜；然后将丝素膜材料在75％乙醇溶液中浸渍1小时，水洗后在30℃烘干；
(5)丝素基仿生矿化材料制备：将步骤(4)处理后丝素膜浸渍在40mmol/L氯化钙溶液中，在37℃处理24小时，进行预钙化；然后再将丝素膜浸渍在1.5倍SBF模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化7天，期间每天更换一次模拟体液；最后以去离子水清洗，在-50℃条件下再次冷冻干燥，得到丝素基仿生矿化材料。
一种通过接枝乙烯基单体制备丝素基仿生矿化材料的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种通过接枝乙烯基单体制备丝素基仿生矿化材料的方法，其特征是先在丝素大分子上接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸，再借助辣根过氧化物酶催化改性丝素与丙烯酸单体接枝共聚，制备丝素基仿生矿化材料，属于纺织生物技术领域。
背景技术
[0002] 丝素蛋白是蚕丝的主要成分，由18种氨基酸组成，其中多数为极性较低的乙氨酸和丙氨酸链段，其余则主要由极性氨基酸残基组成。丝素蛋白具有良好的生物相容性和环境友好性，以丝素蛋白加工的再生材料具有无毒、无刺激性、吸湿性优良等特点。丝素纤维经钙盐或锂盐及其醇溶液处理后，丝素蛋白大分子发生溶解和部分水解，通过透析去除盐离子，可得到丝素蛋白溶液。丝素基生物材料的性能与其分子量有较大的相关性。分子量较大的丝素蛋白能显著增加材料的力学性能，但由于负电性羧基含量较少，在仿生矿化中丝素对钙离子络合能力下降，影响了羟基磷灰石的形成和丝素基仿生矿化材料的制备。与之相比，分子量较小的丝素分子中羧基含量多，在仿生矿化中对钙离子络合能力较强，有利于形成羟基磷灰石等磷酸钙盐结构，提升仿生矿化效果，其缺点是丝素分子量过低会影响丝素基再生材料的力学性能。研究表明，采用过硫酸盐或紫外光辐照等引发丝素蛋白与丙烯酸接枝共聚，或直接将聚丙烯酸与丝素蛋白共混，均能增加丝素基材料表面的负电性，进而能提高丝素蛋白的仿生矿化效果。
[0003] 辣根过氧化物酶(HRP)有很强的催化活性，在以双氧水(H2O2)为氧化剂，乙酰丙酮(ACAC)为引发剂的体系中，能催化丙烯酸(AA)聚合，形成聚丙烯酸(PAA)。此外，丝素蛋白(SF)中含一定数量的酪氨酸残基，HRP也可以催化酪氨酸的酚羟基产生酚氧自由基，引发丝素与丙烯酸接枝共聚，形成丝素/丙烯酸复合材料(SF-g-PAA)，这为基于酶法的丝素接枝丙烯酸改性加工提供了可能。通过HRP酶催化反应，可以在丝素表面引入较多负电性羧酸基团，增强仿生矿化中对钙离子的络合作用，提升丝素蛋白的仿生矿化效果。另一方面，尽管HRP能催化丝素中酪氨酸残基产生酚氧自由基，引发与丙烯酸单体进行接枝共聚，但由于丝素蛋白上酪氨酸残基数量较少或酶促反应中可及度较低，难与丙烯酸单体高效接枝共聚，使得反应后丝素表面的羧基数量增加较少，影响了丝素基仿生矿化材料的制备。
[0004] 为解决此问题，本发明首先采用二步法进行丝素蛋白改性，第一步：通过在丝素蛋白表面引入乙烯基和更多的酚羟基，提高丝素的酶催化反应性，具体做法是借助碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将含乙烯基和酚羟基的羧酸接枝到丝素蛋白上，与丝素分子形成酰胺键；第二步：以辣根过氧化物酶催化丝素蛋白表面引入的乙烯基，产生自由基，并与添加的丙烯酸单体发生接枝共聚；此过程中，辣根过氧化物酶还同时催化丝素中的酪氨酸残基和丝素表面引入的酚羟基，产生较活泼的酚氧自由基，也能与丙烯酸单体接枝共聚，增加丝素蛋白上丙烯酸的接枝率及羧酸基团数，提高丝素蛋白的仿生矿化性能。丝素蛋白经上述二步法改性后，再进行丝素膜成型，最后进行丝素基仿生矿化材料制备。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种通过接枝乙烯基单体制备丝素基仿生矿化材料的方法，旨在通过丝素与丙烯酸接枝共聚，增加丝素蛋白中负电性羧基数量，提高丝素的仿生矿化效果。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案：先借助EDC和NHS进行丝素改性，将含乙烯基和酚羟基的羧酸接枝到丝素大分子上，提高丝素蛋白的反应性；再借助辣根过氧化物酶催化改性丝素与丙烯酸单体接枝共聚，制备丝素基仿生矿化材料，具体工艺与步骤如下：
[0007] (1)丝素蛋白溶液的制备：以溴化锂或氯化钙溶解脱胶后的蚕丝，制备丝素蛋白溶液；
[0008] 处理工艺处方及条件：将脱胶后的蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的乙醇溶液中，在50～80℃搅拌至溶解，然后以去离子水透析24～48小时，制得浓度为10～40g/L丝素溶液；
[0009] (2)EDC/NHS法接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸：在步骤(1)的丝素溶液中加入EDC、NHS、含乙烯基和酚羟基的羧酸处理，在丝素上引入乙烯基和酚羟基；
[0010] 处理工艺处方及条件：EDC 1～10g/L，NHS 1～10g/L，含乙烯基和酚羟基的羧酸0.2～5g/L，温度20～30℃，pH 4.5～7，处理时间0.5～24小时；
[0011] (3)辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚：在步骤(2)的丝素溶液中，添加辣根过氧化物酶、乙酰丙酮和丙烯酸，在氮气保护下加入双氧水，促进丝素与丙烯酸接枝共聚；
[0012] 处理工艺处方及条件：辣根过氧化物酶2～20U/mL，乙酰丙酮5～10g/L，双氧水5～20g/L，丙烯酸5～25g/L，温度20～45℃，pH 6.0～8.0，处理时间0.5～15小时；
[0013] (4)丝素膜材料的成型：将步骤(3)反应后的丝素溶液在-50℃～-20℃条件下冷冻干燥成膜；然后将丝素膜在50～80％乙醇溶液中浸渍0.25～1小时，水洗后在30℃烘干；
[0014] (5)丝素基仿生矿化材料制备：将步骤(4)处理后丝素膜浸渍在10～50mmol/L氯化钙溶液中，在37℃处理0.5～24小时，进行预钙化；然后再将丝素膜浸渍在1.5倍SBF模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化1～7天，期间每天更换一次模拟体液；最后以去离子水清洗，在-50～-20℃条件下再次冷冻干燥，得到丝素基仿生矿化材料。
[0015] 一种通过接枝乙烯基单体制备丝素基仿生矿化材料的方法，所述含乙烯基和酚羟基的羧酸包括咖啡酸、阿魏酸、绿原酸；所述辣根过氧化物酶来源于动物、植物或微生物。
[0016] 本发明借助于EDC/NHS法在丝素蛋白表面接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸，再加入丙烯酸单体，通过辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚，制备丝素基仿生矿化材料。与采用化学法或紫外辐照法等传统方法引发丝素与乙烯类单体接枝共聚相比，本发明有以下优点：
[0017] (1)接枝共聚效率高，采用EDC/NHS法在丝素上引入乙烯基和酚羟基，提高了辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸进行接枝共聚反应的效率；
[0018] (2)酶处理条件缓和，在低温和近中性条件下，借助于辣根过氧化物酶催化接枝共聚，具有能耗低、处理工艺安全的优点，避免了化学法或紫外辐照法接枝共聚易产生丝素变性等缺陷；
[0019] (3)仿生矿化材料性能优良，以本发明述及方法催化丝素接枝丙烯酸，增加了对钙离子络合能力，增强了丝素仿生矿化效果；EDC/NHS处理还能促进丝素蛋白大分子间交联，也提升了丝素基仿生矿化材料的力学性能。
具体实施方式
[0020] 采用EDC/NHS活化体系，在丝素上接枝含乙烯基的羧酸，再利用辣根过氧化物酶/双氧水/乙酰丙酮体系催化丝素与丙烯酸接枝共聚，制备丝素基仿生矿化材料，具体实施例如下：
[0021] 实施例1
[0022] 以本发明述及的方法制备丝素基仿生矿化材料，具体工艺步骤如下：
[0023] (1)丝素蛋白溶液的制备：将脱胶后的蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的乙醇溶液中，在70℃搅拌至溶解，然后以去离子水透析24小时，制得20g/L丝素蛋白溶液；
[0024] (2)EDC/NHS法接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸：在步骤(1)的丝素溶液中加入EDC、NHS和咖啡酸处理，其中EDC 3g/L，NHS 2g/L，咖啡酸2g/L，温度25℃，pH 5.5，处理时间12小时；
[0025] (3)辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚：在步骤(2)的丝素溶液中，添加辣根过氧化物酶、乙酰丙酮和丙烯酸，在氮气保护下加入双氧水，促进丝素与丙烯酸接枝共聚；其中辣根过氧化物酶5.5U/mL，乙酰丙酮5g/L，双氧水6g/L，丙烯酸10g/L，温度30℃，pH 7.0，处理时间8小时；
[0026] (4)丝素膜材料的成型：将步骤(3)反应后的溶液在-50℃冷冻干燥成膜；然后将丝素膜材料在70％乙醇溶液中浸渍0.5小时，水洗后在30℃烘干；
[0027] (5)丝素基仿生矿化材料制备：将步骤(4)处理后丝素膜浸渍在20mmol/L氯化钙溶液中，在37℃处理6小时，进行预钙化；然后再将丝素膜浸渍在1.5倍SBF模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化6天，期间每天更换一次模拟体液；最后以去离子水清洗，在-50℃条件下再次冷冻干燥，得到丝素基仿生矿化材料。
[0028] 试样1：经步骤(1)、(4)、(5)处理，不经过步骤(2)、(3)处理；
[0029] 试样2：经步骤(1)、(3)、(4)和(5)处理，不经过步骤(2)处理；
[0030] 试样3：经步骤(1)、(2)、(3)、(4)和(5)处理；
[0031] 经上述工艺处理后，试样1表面钙、磷含量分别为13.5％和9.8％，弹性模量为8.3MPa；试样2表面钙、磷含量分别为15.1％和11.6％，弹性模量为9.0MPa；试样3表面钙、磷含量分别为18.9％和14.2％，弹性模量为12.1MPa。
[0032] 实施例2
[0033] 以本发明述及的方法制备丝素基仿生矿化材料，具体工艺步骤如下：
[0034] (1)丝素蛋白溶液的制备：将脱胶后的蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的乙醇溶液中，在70℃搅拌至溶解，然后以去离子水透析36小时，制得25g/L丝素蛋白溶液；
[0035] (2)EDC/NHS法接枝含乙烯基和酚羟基的羧酸：在步骤(1)的丝素溶液中加入EDC、NHS和阿魏酸处理，其中EDC 5g/L，NHS 4g/L，阿魏酸4g/L，温度25℃，pH 5.75，处理时间18小时；
[0036] (3)辣根过氧化物酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚：在步骤(2)的丝素溶液中，添加辣根过氧化物酶、乙酰丙酮和丙烯酸，在氮气保护下加入双氧水，促进丝素与丙烯酸接枝共聚；其中辣根过氧化物酶10U/mL，乙酰丙酮6g/L，双氧水7.5g/L，丙烯酸15g/L，温度30℃，pH 7.5，处理时间12小时；
[0037] (4)丝素膜材料的成型：将步骤(3)反应后的溶液在-50℃冷冻干燥成膜；然后将丝素膜材料在75％乙醇溶液中浸渍1小时，水洗后在30℃烘干；
[0038] (5)丝素基仿生矿化材料制备：将步骤(4)处理后丝素膜浸渍在40mmol/L氯化钙溶液中，在37℃处理24小时，进行预钙化；然后再将丝素膜浸渍在1.5倍SBF模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化7天，期间每天更换一次模拟体液；最后以去离子水清洗，在-50℃条件下再次冷冻干燥，得到丝素基仿生矿化材料。
[0039] 试样4：经步骤(1)、(4)、(5)处理，不经过步骤(2)、(3)处理；
[0040] 试样5：经步骤(1)、(3)、(4)和(5)处理，不经过步骤(2)处理；
[0041] 试样6：经步骤(1)、(2)、(3)、(4)和(5)处理；
[0042] 经上述工艺处理后，试样4表面钙、磷含量分别为12.1％和10.1％，弹性模量为9.5MPa；试样5表面钙、磷含量分别为14.7％和11.6％，弹性模量为10.9MPa；试样6表面钙、磷含量分别为19.7％和15.2％，弹性模量为15.6MPa。
[0043] 通过对实施例数据分析：与未经丝素接枝改性、直接进行丝素膜制备和仿生矿化的材料(试样1、试样4)相比，以本发明述及的方法制备的丝素基仿生矿化材料(试样3、试样6)弹性模量明显增加，材料表面钙和磷含量较高，表明获得了较好矿化效果。与不经过步骤(2)EDC/NHS法处理、直接进行酶催化丝素与丙烯酸接枝共聚后制得的丝素基仿生矿化材料(试样2、试样5)相比，以本发明述及的方法制备的丝素基仿生矿化材料(试样3、试样6)弹性模量增加更多，力学性能明显提高，且仿生矿化效果更好。由此可见，以本发明述及的方法制备丝素基仿生矿化材料具有较好的性能。
[0044] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
