一种适用于艰难梭菌的培养基及其制备方法

摘要

本发明涉及一种适用于艰难梭菌的培养基及其制备方法，属于微生物培养技术领域。为了克服现有的培养基对于艰难梭菌的培养效果不佳的技术不足，本发明目的在于提供一种适用于艰难梭菌的培养基及其制备方法，该培养基中不仅包括蛋白胨和脱水牛心浸粉等复合组分，还包括甘氨酸以及昆布氨酸等补充组分，实验结果表明，该培养基对于艰难梭菌的培养效果佳，这对于研究其生物学特性以及对于探寻其引发的感染的治疗具有重要的意义。

权利要求

1.一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨 10-15份，脱水小牛脑浸粉 6-8份，脱水牛心浸粉 10-15份，葡萄糖1.0-1.5份，硫酸镁0.1-0.5份，昆布氨酸1.5-2.5份，纳他霉素0.01-0.03份，磷酸二氢钠 0.5-0.9份，甘氨酸 0.5-0.9份，维生素B1 0.3-0.5份，纯化水800-1000份，pH调整为7.2-7.4。

2.根据权利要求1所述的适用于艰难梭菌的培养基，其特征在于，所述培养基如下重量份的组分制备得到：蛋白胨 12.5份，脱水小牛脑浸粉7份，脱水牛心浸粉 12.5份，葡萄糖

1.25份，硫酸镁0.3份，昆布氨酸2份，纳他霉素0.02份，磷酸二氢钠 0.7份，甘氨酸 0.7份，维生素B1 0.4份，纯化水900份，pH调整为7.3。

3.一种权利要求1或2所述适用于艰难梭菌的培养基的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括下述步骤：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.2-7.4，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中加入纳他霉素、甘氨酸、昆布氨酸以及维生素B1，即得适用于艰难梭菌的培养基。

4.权利要求1或2所述的适用于艰难梭菌的培养基在其菌株的保藏，活化以及分离中的用途。

5.据权利要求4所述的用途，其特征在于，用于艰难梭菌保藏时，所述培养基中还包括

1.5%-2%的琼脂，琼脂的添加时间在灭菌之前。

说明书

一种适用于艰难梭菌的培养基及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种适用于艰难梭菌的培养基及其制备方法，属于微生物培养技术领域。

背景技术

[0002] 艰难梭菌(Clostridium difficile)是梭菌属的一种专性厌氧菌，对氧十分敏感，很难分离培养，故得名。发现于1935年，但直到1977年发现本菌与临床长期使用某些抗生素(氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等)引起的伪膜性肠炎有关，方被重视。艰难梭菌广泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、一些大型动物(牛、驴和马)的粪便，及狗、猫、啮齿动物和人的粪便，除此之外还大量存在于水和动物的肠道中婴儿的粪便中常含有艰难梭菌，为新生儿肠道中正常菌群，大约50％的12月龄婴儿的肠道中有艰难梭菌，2岁以上儿童的带菌率大约为3％，但此菌在健康成人中出现频率较低，无症状带菌的成人在瑞典是1.9％，在日本为15.4％。

[0003] 艰难梭菌可以引发下列疾病：1.伪膜性肠炎(pseudomenbranous colitis，PMC)：临床表现为腹泻、腹痛、伴有全身中毒症状，症状突然开始，并伴随血压低，严重时能致死。
通常还伴有发烧，白细胞增多，之后可导致死亡，是很严重的一类疾病。2.抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhoea)：在体内的潜伏期为5-10天，之后导致大量的棕色或水状腹泻，持续1周左右。除上述疾病外，艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等。近年来该菌已成为医院内感染的病原菌之一，日益被人们所重视。如何选择合适的培养基培养该菌株对于研究其生物学特性以及对于探寻其引发的感染的治疗具有重要的意义。

[0004] 现有技术显示，本菌为严格的专性厌氧菌，用常规的厌氧培养法不易生长。生长温度为25℃～45℃，而最适温度为30℃～37℃。在血琼脂、牛心脑浸液琼脂及CCFA等平板，经48小时培养后，菌落的直径3～5mm，圆形，略凸起，白色或淡黄色、不透明、边缘不整齐、表面粗糙。在血平板上不溶血，在卵黄琼脂平板上不形成乳浊环。CCFA平板上生长的菌落在紫外线照射下可见黄绿色荧光。本菌经肉汤培养2天以上，菌体有溶融现象。

发明内容

[0005] 本发明目的在于提供一种适用于艰难梭菌的培养基及其制备方法，其对于研究其生物学特性以及对于探寻其引发的感染的治疗具有重要的意义。

[0006] 本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

[0007] 一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨10-15份，脱水小牛脑浸粉6-8份，脱水牛心浸粉10-15份，葡萄糖1.0-1.5份，硫酸镁0.1-0.5份，昆布氨酸1.5-2.5份，纳他霉素0.01-0.03份，磷酸二氢钠0.5-0.9份，甘氨酸0.5-0.9份，维生素B10.3-0.5份，纯化水800-1000份，pH调整为7.2-7.4。

[0008] 作为本发明所优选的一种实施方式，所述的培养基如下重量份的组分制备得到：蛋白胨12.5份，脱水小牛脑浸粉7份，脱水牛心浸粉12.5份，葡萄糖1.25份，硫酸镁0.3份，昆布氨酸2份，纳他霉素0.02份，磷酸二氢钠0.7份，甘氨酸0.7份，维生素B10.4份，纯化水900份，pH调整为7.3。

[0009] 本发明上述培养基的制备方法为：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.2-7.4，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中甘氨酸、昆布氨酸以及维生素，即得适用于艰难梭菌的培养基。

[0010] 本发明上述培养基可以作为艰难梭菌的培养基可以用于其菌株的保藏，活化以及分离。用于保藏时，其培养基中还包括1.5％-2％的琼脂，琼脂的添加时间在灭菌之前添加。

[0011] 本发明与现有技术相比有益效果在于：

[0012] 本发明克服了现有技术中艰难梭菌难以培养的技术不足，所述的培养基非常适合艰难梭菌的生长，适合作为保藏培养基或者用于优势菌株筛选中。这对于研究艰难梭菌的生物学特性以及对于探寻其引发的感染的治疗具有重要的意义。

具体实施方式

[0013] 以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。

[0014] 实施例1本发明适用于艰难梭菌的培养基

[0015] 一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨10份，脱水小牛脑浸粉6份，脱水牛心浸粉10份，葡萄糖1.0份，硫酸镁0.1份，昆布氨酸1.5份，纳他霉素0.01份，磷酸二氢钠0.5份，甘氨酸0.5份，维生素B10.3份，纯化水800份，pH调整为7.2。

[0016] 培养基的制备方法为：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.2，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中甘氨酸、昆布氨酸以及维生素，即得适用于艰难梭菌的培养基。

[0017] 实施例2本发明适用于艰难梭菌的培养基

[0018] 一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨15份，脱水小牛脑浸粉8份，脱水牛心浸粉15份，葡萄糖1.5份，硫酸镁0.5份，昆布氨酸2.5份，纳他霉素0.03份，磷酸二氢钠0.9份，甘氨酸0.9份，维生素B10.5份，纯化水1000份，pH调整为7.4。

[0019] 培养基的制备方法为：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.4，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中甘氨酸、昆布氨酸以及维生素，即得适用于艰难梭菌的培养基。

[0020] 实施例3本发明适用于艰难梭菌的培养基

[0021] 一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨12.5份，脱水小牛脑浸粉7份，脱水牛心浸粉12.5份，葡萄糖1.25份，硫酸镁0.3份，昆布氨酸2份，纳他霉素0.02份，磷酸二氢钠0.7份，甘氨酸0.7份，维生素B10.4份，纯化水900份，pH调整为7.3。

[0022] 培养基的制备方法为：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.3，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中甘氨酸、昆布氨酸以及维生素，即得适用于艰难梭菌的培养基。

[0023] 实施例4本发明适用于艰难梭菌的培养基

[0024] 一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨10份，脱水小牛脑浸粉8份，脱水牛心浸粉10份，葡萄糖1.5份，硫酸镁0.1份，昆布氨酸2.5份，纳他霉素0.01份，磷酸二氢钠0.9份，甘氨酸0.5份，维生素B10.5份，纯化水800份，pH调整为7.2。

[0025] 培养基的制备方法为：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.2，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中甘氨酸、昆布氨酸以及维生素，即得适用于艰难梭菌的培养基。

[0026] 实施例5本发明适用于艰难梭菌的培养基

[0027] 一种适用于艰难梭菌的培养基，其由如下重量份的组分制备得到：蛋白胨15份，脱水小牛脑浸粉6份，脱水牛心浸粉15份，葡萄糖1.0份，硫酸镁0.5份，昆布氨酸1.5份，纳他霉素0.03份，磷酸二氢钠0.5份，甘氨酸0.9份，维生素B10.3份，纯化水1000份，pH调整为7.4。

[0028] 培养基的制备方法为：量取处方量二分之一量的纯化水，向其中加入蛋白胨、脱水小牛脑浸粉、脱水牛心浸粉以及葡萄糖，搅拌使其溶解，加入余量纯化水，向其中加入硫酸镁和磷酸二氢钠，调节其pH至7.4，121℃灭菌20min，培养基冷却至室温后向其中甘氨酸、昆布氨酸以及维生素，即得适用于艰难梭菌的培养基。

[0029] 参比实施例1

[0030] 除处方中不包括昆布氨酸外，其他处方以及培养基制备方法同实施例3。

[0031] 参比实施例2

[0032] 除处方中不包括纳他霉素外，其他处方以及培养基制备方法同实施例3。

[0033] 参比实施例3

[0034] 除处方中不包括甘氨酸和维生素B1外，其他处方以及培养基制备方法同实施例3。

[0035] 实验例6本发明适用于艰难梭菌的培养基的培养效果观察

[0036] 粪便标本采集：选择上海医科大学就诊患者的粪便作为标本采集对象，患者年龄26岁，应用抗生素治疗两周后，突然出现腹泻，大便为水样便。取其大便标本，将标本保存于
20％的甘油肉汤小管中制备成样本，取5mL样本用于粪便菌群观察，另取2mL样本用于培养基培养，培养基分别使用本发明实施例1-实施例5所述的培养基，参比实施例1-3所述的培养基。同时设定对照培养基，对照培养基使用CDMN选择培养基，购自北京朋利驰科技有限公司。

[0037] 经检验，患者粪便中主要菌群以及比例为艰难梭菌：大肠杆菌：粪链球菌：沙门氏菌＝1:50:10:8，总菌落数目为5.2×108cfu/mL，经过培养基培养之后不同菌属比例以及菌落数目如表1所示。

[0038] 表1不同培养基培养粪便样本之后不同菌属比例以及菌落数目

[0039]

[0040] 由表1可以看出，本发明中的培养基经过培养之后，艰难梭菌由弱势菌株转变为优势菌株，且培养后菌落数目与之前相比具有大幅度的提升。这表明本发明所述的培养基相对于对照培养基更适合于艰难梭菌的优势菌株筛选，其中以实施例3对应的培养基的培养效果最好。参比实施例1-参比实施例3除部分组分与实施例3不同外，其余与实施例3相同，但使用参比实施例1-参比实施例3的培养基培养后，不仅整体的培养菌落数下降，而且艰难梭菌的优势地位显著下降，这表明本发明组分中的昆布氨酸、纳他霉素，甘氨酸以及维生素B1在培养艰难梭菌并确立其优势地位中具有关键作用，并在其中体现了显著的协同作用。

[0041] 使用本发明所述的培养基以及对照培养基进行传代培养，传代培养为固体培养基，其中包括1.8％的琼脂粉。传代不同代数测定进入对数期的时间变化，芽孢形成时间变化以及毒素产生量的变化。

[0042] 表2不同次数传代后艰难梭菌活力改变

[0043]

[0044] 由表2可以看出，随着传代次数的增加，艰难梭菌的活力逐渐下降，主要表现在进入对数生长期的时间延长，芽孢形成时间延长，以及毒素产生量降低。但本发明所述的培养基的活力下降率较对照培养基显著降低，也就是说，使用本发明培养基相对于现有的培养基可以大幅度降低休眠期的时间，并能维持艰难梭菌的毒素生产量以及阻止芽孢形成时间的延长，其中实施例3对应的培养基的效果最佳。参比实施例1-参比实施例3仅在实施例3基础上改变了部分组分，但其休眠时间、毒素产生量以及芽孢形成时间却大大延长，这表明本发明组分中的昆布氨酸、纳他霉素，甘氨酸以及维生素B1在艰难梭菌保藏过程维持其活力中具有关键作用，并在其中体现了显著的协同作用。