用于发酵富含碳水化合物的作物的方法

摘要

提供了一种用于发酵富含碳水化合物的作物的方法。甜菜、甘蔗、甜高粱、热带玉米杂交种和果实富含简单糖；土豆、甘薯、木薯和山药富含淀粉；并且洋姜富含菊粉。该方法使用真空灌注将酵母灌注到薄壁组织的胞间隙(质外体)中。简单糖扩散到该质外体中、与该酵母接触并产生乙醇。乙醇可以通过真空汽提或粉碎从作物中提取，或可以将其留在淀粉作物中以对其保存。在一些变体中，果胶酶降解薄壁细胞壁以加速简单糖向酵母的扩散，加速淀粉酶向淀粉颗粒的扩散，或加速菊粉酶向不溶性菊粉的扩散。

权利要求

1.一种用于从富含碳水化合物的植物薄壁组织生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供在作物温度下的包含质外体的富含碳水化合物的植物薄壁组织，其中所述作物温度是从5℃至40℃；

(b)在试剂温度下，将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织与含有酵母的水性试剂溶液结合，其中所述酵母是酿酒酵母并且其中所述试剂温度是从20℃至40℃；

(c)在步骤(b)之前或步骤(b)之后，将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织暴露于气相制备压力持续制备时间，其中所述气相制备压力小于大气压并且为在所述作物温度和所述试剂温度更高者下的水平衡压力的从105％至200％；

(d)将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织暴露于气相灌注压力持续灌注时间，其中所述含有所述酵母的水性试剂溶液被灌注至所述质外体中，并且其中所述气相灌注压力大于所述气相制备压力；

(e)排出未被拖入所述质外体中的游离液体；以及

(f)在步骤(e)之后，保持气相发酵压力持续发酵时间以在所述质外体内产生发酵产物，而不将所述水性试剂溶液重新引入返回至所述富含碳水化合物的植物薄壁组织，其中所述气相发酵压力大于所述气相制备压力，其中所述发酵产物通过选自由以下组成的组的碳水化合物的发酵来产生：存在于所述质外体中和/或存在于薄壁细胞中的简单糖、从淀粉水解的简单糖、从菊粉水解的简单糖、及其组合，其中至少25％的所述发酵产物的质量是乙醇，其中至少25％的所述发酵产物的质量是二氧化碳，并且其中所述二氧化碳在所述发酵期间不会把所述酵母从所述质外体中排出。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述富含碳水化合物的植物薄壁组织选自下组，该组由以下各项组成：甘蔗秸秆、甜高粱秸秆、热带玉米杂交种秸秆、甜菜块茎、苹果、葡萄、橙子、及其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述富含碳水化合物的植物薄壁组织选自下组，该组由以下各项组成：马铃薯块茎、甘薯块茎、木薯块茎、山药块茎、洋姜块茎及其组合。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述水性试剂溶液含有果胶酶。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述水性试剂溶液含有木聚糖酶。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述水性试剂溶液含有淀粉酶。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述水性试剂溶液含有菊粉酶。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述制备时间为从1分钟至1小时。

9.如权利要求1所述的方法，其中将所述水性试剂溶液均化。

10.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括使用在0.15W/kg至50W/kg范围内的湍流能量混合所述水性试剂溶液。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述灌注时间为从1分钟至1小时，并且其中所述灌注压力是大气压。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵时间为从6小时至7天。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵压力是大气压。

14.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织保持在无氧环境中持续所述发酵时间完成之后的作物保存时间。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括通过真空汽提回收所述发酵产物。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括通过粉碎回收所述发酵产物。

说明书

用于发酵富含碳水化合物的作物的方法

[0001] 优先权数据

[0002] 本国际专利申请要求于2015年12月11日提交的美国专利申请号14/966,650、2015年11月13日提交的美国专利申请号14/940,390、2015年3月30日提交的美国临时专利申请号62/139,881、和2015年3月3日提交的美国临时专利申请号62/127,637的优先权，这些专利各自特此通过引用并入本申请。发明领域

[0003] 本发明总体上涉及用于发酵富含碳水化合物的作物的方法。

[0004] 发明背景

[0005] 许多发酵微生物将碳水化合物转化为乙醇。最广泛使用的发酵微生物，啤酒酵母和面包酵母,是酿酒酵母的菌株。乙醇具有作为饮料、运输燃料和其他有机化合物的前体的显著的经济价值。

[0006] 发酵微生物可以将葡萄糖、果糖、麦芽糖(葡萄糖二聚体)和蔗糖(葡萄糖-果糖二聚体)直接转化为乙醇。在此，葡萄糖和果糖的单体和二聚体将被称为简单糖，并且将简单糖转化为乙醇的发酵微生物将被称为酵母。

[0007] 酵母在无氧(没有氧)环境中将简单糖发酵成乙醇。将1摩尔葡萄糖或果糖(或0.5摩尔蔗糖)发酵成2摩尔乙醇和2摩尔二氧化碳，并释放出118kJ的热量。这意味着发酵18％的糖溶液将导致34℃的温升，这意味着需要冷却发酵培养基。发酵1升18％的糖溶液(1摩尔葡萄糖)也将产生2摩尔的二氧化碳，其具有在20℃和大气压下的约48升的体积。典型的酵母在20℃-40℃之间最有效地发酵，但具有下降至5℃的显著的发酵活性(白葡萄酒在7℃-15℃之间发酵)。酵母细胞在高于42℃的温度下逐渐死亡。酿酒酵母对pH相对不敏感，并且将在从2.9至7.2的pH范围内发酵。这在Arroyo-López，“温度、pH以及糖浓度对酿酒酵母、非酿酒酵母及其种间杂种的生长参数的影响(Effects of temperature，pH and sugar concentration on the growth parameters of Saccharomyces cerevisiae，S.kudriavzevii and their interspecific hybrid)”，国际食品微生物学杂志(International journal of food microbiology)131.2(2009)：120-127(将其特此通过引用结合在此)中更详细地进行描述。

[0008] 大多数酿酒酵母菌株具有约10微米的直径。具有约5微米的细胞大小的酿酒酵母菌株是 Dry，可从美国乔治亚州德卢斯的Lallemand Biofuels&Distilled Spirits公司获得。它产生最高达按体积计20％(按重量计16％)的乙醇浓度，因此可以通过此酵母发酵具有最高达按重量计32％碳水化合物的富含碳水化合物的作物。这意味着可以在发酵前将作物脱水，使得所得到的乙醇浓度更高。

[0009] 在简单糖存在下，酵母细胞粘附于表面(如薄壁细胞)。这在Verstrepen和Klis，“酵母的絮凝、粘附和生物膜形成(Flocculation,adhesion and biofilm formation in yeasts)”，分子微生物学(Molecular microbiology)60.1(2006)：5-15(将其特此通过引用结合在此)中进行了描述。

[0010] 酿酒酵母以冷冻干燥的形式出售，并且易于处理。它被归类为GRAS(通认安全的)，并且通常在日常饮食中消耗-例如，面包是用酿酒酵母酵母制成的。

[0011] 淀粉是葡萄糖的聚合物，并且菊粉是主要是果糖、在一端具有葡萄糖的聚合物。在淀粉和菊粉可以通过酵母转化成乙醇之前，它们必须首先通过对应地淀粉酶和菊粉酶、或通过酸转化成简单糖。淀粉在酵母是活性的温度范围内不溶于水，并且在此相同的温度范围内只有约5％的菊粉可溶。

[0012] 存在可供使用的淀粉酶，这些淀粉酶在酵母有效起作用的温度范围内有效地将淀粉转化成葡萄糖。一个实例是来自美国杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences,USA)的 002酶制剂。这含有在里氏木霉中表达的白曲霉α-淀粉酶和来自里氏木霉的葡糖淀粉酶，其协同作用以将颗粒淀粉底物水解成葡萄糖。内活性的α-淀粉酶和外活性的葡糖淀粉酶在各种乙醇发酵条件下催化了颗粒淀粉的完全水解。

[0013] 存在可供使用的菊粉酶，这些菊粉酶在酵母有效起作用的温度范围内有效地将菊粉转化成果糖。一个实例是可从丹麦诺维信公司(Novozymes A/S，Denmark)获得的果糖酶L酶配制品。

[0014] 许多作物在储存薄壁细胞内含有碳水化合物。这些富含碳水化合物的薄壁细胞通常在具有80％至90％水的单个大液泡中具有10％至20％的碳水化合物。这些碳水化合物通常包含简单糖和多糖。在此，含有大量的富含碳水化合物的薄壁细胞的这些富含碳水化合物的作物的部分将被称为富含碳水化合物的薄壁组织。具有富含碳水化合物的薄壁组织的所有作物在薄壁细胞中含有一定量的简单糖，并且一些含有大量的多糖。

[0015] 存在两种类型的具有富含碳水化合物的薄壁组织的作物，禾本科草(禾本科和薯蓣属)中的单子叶植物(monocotyledon)(单子叶植物((monocot))以及双子叶植物(dicotyledon)(双子叶植物(dicot))。它们差别在于薄壁细胞彼此粘附的方式。单子叶植物通过胞间层中的果胶和半纤维素二者粘附并且双子叶植物通过胞间层中的果胶粘附。

[0016] 最广泛种植的在秸秆中具有富含碳水化合物的薄壁组织的作物是甘蔗(sugar cane)(甘蔗(Saccharum officinarum))，甜高粱(双色高粱)和热带玉米杂交种(玉蜀黍)。这些都是禾本科草(禾本科)中的单子叶植物。甘蔗和热带玉米杂交种在储存薄壁细胞中含有简单糖，并且甜高粱在储存薄壁细胞中含有90％的简单糖和10％的淀粉。

[0017] 最广泛种植的在块茎中具有富含碳水化合物的薄壁组织的作物是马铃薯(potato)(马铃薯(Solanum tuberosum))，甘薯(sweet  potato)(甘薯(Ipomoea batatas))，木薯(木薯)(木薯(Manihot esculenta))，山药(yam)(薯蓣属(genus Dioscorea))和洋姜(菊芋(Helianthus tuberosus))。土豆、甘薯、木薯和洋姜是双子叶植物，而山药是单子叶植物。马铃薯、甘薯、木薯和山药在储存薄壁细胞中含有淀粉，并且洋姜在储存薄壁细胞中含有菊粉。

[0018] 最广泛种植的果实中具有富含碳水化合物的薄壁组织的作物是苹果、葡萄和橘子。这些都是双子叶植物，并且在储存薄壁细胞中含有葡萄糖和果糖。

[0019] 存在用于发酵具有富含碳水化合物的薄壁组织的作物的熟知的技术。通常将秸秆在一系列辊之间粉碎，以通过使薄壁细胞破裂来提取汁，并且然后将该汁与残留固体分离并发酵。通常将甜菜切成约4毫米厚的小薄片(甜菜丝)，并且糖用流动的热水提取，并且然后发酵。通常将果实挤压以提取富含糖的汁，然后将该汁发酵。淀粉作物通常通过将块茎加热到高于糊化温度并在糊化的淀粉下使用淀粉酶，随后发酵葡萄糖转化成乙醇。富含菊粉的作物通常通过以下方式发酵：加热直到菊粉溶解、提取汁、用酸水解转化成果糖并且然后发酵果糖。所有这些技术都是相当资本密集的。

[0020] 富含碳水化合物的薄壁组织中的储存薄壁细胞是薄壁多角细胞。甜菜薄壁细胞具有约100微米的直径，其中壁厚为约2微米。秸秆中的薄壁细胞为约360微米长并且直径为60微米，其中壁厚为约2微米。储存薄壁组织的特征在Gibson的“植物材料的层次结构和力学(The hierarchical structure and mechanics of plant materials)”，皇家学会界面(Journal of The Royal Society Interface)9.76(2012)：2749-2766(将其特此通过引用结合在此)中更详细地进行描述。

[0021] 薄壁细胞紧密堆积在一起，但由于堆积不完美，它们之间存在小的间隙。这些间隙被称为质外体或胞间隙。这些间隙相互连接，并且水可通过这些间隙流过薄壁组织。在Steudle的“在植物中的水运：质外体的作用(Water transport in plants:role of the apoplast)”，植物和土壤(Plant and Soil)187.1(1996)：67-79(将其特此通过引用结合在此)中有关于水流过质外体的更多细节。

[0022] 水在轴向方向(上/下)上流过甜菜薄壁组织中的质外体但通过在根部的凯氏带在径向方向(入/出)上受到限制。这在Amodeo的“甜菜储存根中的径向和轴向水运输(Radial and axial water transport in the sugar beet storage root)”，实验植物学杂志(Journal of Experimental Botany)50.333(1999)：509-516(将其特此通过引用结合在此)中更详细地进行描述。

[0023] 类似地，水在轴向方向上流过富含碳水化合物的秸秆的薄壁组织中的质外体，但受到节间长度(秸秆的连续部分)的限制。水不会在径向上流动，因为秸秆的外部是不透水的。大多数富含碳水化合物的秸秆的节间长度是在100mm与300mm之间。

[0024] 甘蔗的质外体(胞间隙)对于被各种细菌定殖是足够大的。这在Dong的“甘蔗茎的固氮内生菌(对于质外体的新作用)”，植物生理学(Plant Physiology)105.4(1994)：1139-1147和Tejera的“甘蔗茎的非原质体液中的氮化合物：与内生菌相关的一些影响(Nitrogen compounds in the apoplastic sap of sugarcane stem:Some implications in the association with endophytes)”，植物生理学杂志(Journal of plant physiology)
163.1(2006)：80-85中更详细地描述，两者都特此通过引用结合在此。类似地，其他物种的富含碳水化合物的薄壁组织的质外体对于被细菌定殖是足够大的。

[0025] 有可能通过使用真空灌注(infusion)(也称为真空浸渍)填充富含碳水化合物的薄壁组织的质外体。这涉及用液体包围薄壁组织，施加真空，等待液体和气体从薄壁组织排出，释放真空并等待液体填充质外体。这在Gras的“一些蔬菜对真空浸渍的响应(The response of some vegetables to vacuum impregnation)”，创新食品科学和新兴技术(Innovative Food Science&Emerging Technologies)3.3(2002)：263-269(将其特此通过引用结合在此)中更详细地进行描述。

[0026] 富含碳水化合物的薄壁组织经常含有最高达20％(按质量计)的碳水化合物。薄壁细胞壁为薄壁细胞提供了强度，并且细胞膜保持细胞内容物不会从细胞中泄漏出来。细胞壁可渗透蔗糖和其他简单糖。细胞膜可以通过加热(通常高于70℃)变性，这增加了简单糖通过细胞膜的扩散系数。这是通常用于从甜菜提取蔗糖的技术-细胞膜通过加热变性，并且然后蔗糖从甜菜中扩散出来进入热水中。蔗糖通过变性的甜菜组织的扩散系数是比通过非变性的甜菜组织高约5倍，这在Bessadok-Jemaiet等人的“基于电导率测量模拟从甜菜颗粒的溶质扩散动力学(Modeling the kinetic of solute diffusion from sugarbeet particles based on electric conductivity measurements)”，国际物理科学杂志(International Journal of Physical Sciences)6.28(2011)：6464-6468(将其特此通过引用结合在此)中更详细地描述。

[0027] 薄壁细胞可通过或者热量或酶浸软(彼此分离)。当薄壁细胞被浸软时，细胞膜也被破坏，从机械作用和从细胞壁释放的酶二者。这导致液泡的内容物从薄壁细胞中泄漏出，并导致酶更容易扩散到液泡中。这也提供了一种浸解作用，其中薄壁细胞中的水可以通过挤压或蒸发更容易地去除。果胶裂解酶、果胶酸裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturanase)的任何组合浸软双子叶植物中的薄壁细胞，而果胶裂解酶和木聚糖酶浸软单子叶植物中的薄壁细胞。这在Ishii的“用于分离原生质体的酶(Enzymes for the isolation of protoplasts)”，植物原生质体和基因工程I(Plant Protoplasts and Genetic Engineering I)，施普林格柏林海德尔堡(Springer Berlin Heidelberg)，1989,23-33(将其特此通过引用结合在此)中进行描述。

[0028] 当果胶酸裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶降解果胶时，它们也产生甲醇，当生产乙醇时，甲醇经常是不希望的产物。果胶裂解酶降解果胶而不产生甲醇作为副产物，并且木聚糖酶不产生任何醇。存在可供使用的果胶裂解酶，这些果胶裂解酶在与酵母相同的pH和温度范围内起作用，特别是来自黑曲霉的果胶裂解酶，其中最适pH为5.5并且最适温度为35℃。这在Yadavet等人的“果胶裂解酶：综述(Pectin lyase:a review)”，加工生物化学(Process Biochemistry)44.1(2009)：1-10(将其特此通过引用结合在此)中进行描述。在酵母的相同pH和温度范围内起作用的果胶裂解酶的一个实例是“ Ultra Color”酶配制品，其可从丹麦诺维信公司获得。

[0029] 当发酵时，酵母产生大量的二氧化碳(CO2)。通过将CO2溶解在水中形成碳酸。当发酵时，CO2的分压为100kPa(1atm)，并且此溶液的pH为约3.92。酵母在此pH下良好发酵，来自黑曲霉的果胶裂解酶酶(例如Pectinex Ultra Color)在此pH下具有显著的活性，颗粒淀粉水解酶(例如STARGEN)在此pH下具有显著的活性，并且菊粉酶酶(例如果糖酶L)在此pH下具有显著的活性。类似地，所有这些酶在酵母的温度范围内(25℃至40℃)具有显著的活性。

[0030] 甜菜的收获温度可能相当冷，经常低于10℃，并且甘蔗、甜高粱和热带玉米杂交种的收获温度可以低于20℃。然而，通过富含碳水化合物的薄壁组织的质外体中的简单糖发酵释放的热量将迅速将该组织的温度升高到其中酶具有显著活性的温度范围。

[0031] 发酵速率严重地受到酵母细胞浓度的影响。在巴西，典型工厂的甘蔗发酵可能耗费6至10之间个小时，但这需要高浓度(10％w/w)的酵母和酵母细胞回收。这在Basso的“巴西的乙醇生产：工业过程及其对酵母发酵的影响(Ethanol production in Brazil:the industrial process and its impact on yeast fermentation)”，银特开架阅览出版社(INTECH Open Access Publisher)，2011(将其特此通过引用结合在此)中更详细地描述。葡萄酒或啤酒发酵(用较低的酵母浓度)可能需要一周时间。

[0032] 目前用于将糖发酵成乙醇的技术的一个重要问题是细菌污染，特别是乳酸杆菌的污染。不希望受任何特定理论的束缚，据信湍流混合在整个发酵培养基中传播细菌，并且由于污染细菌可能超过酵母，因此存在显著的污染。没有混合下，并且没有糖浓度梯度(由富含碳水化合物的薄壁组织中均匀分布酵母引起)下，任何可能的细菌污染仍然是局部的，并且不能遍及整个生物质体积超过酵母。这在Kundiyana等人的“温度、pH以及酵母对从未杀菌的甜高粱汁现场生产乙醇的影响(Influence of temperature，pH and yeast on in-field production of ethanol from unsterilized sweet sorghum juice)”，生物质与生物能源(biomass and bioenergy)34.10(2010)：1481-1486(将其特此通过引用结合在此)中进行描述。

[0033] 因为薄壁细胞如此小，所以耗费大量的能量粉碎它们，或用热水从它们中提取糖。从秸秆生产糖的资本和运营成本的几乎35％是由于粉碎的成本。类似地，由甜菜生产糖的大部分成本是由于热水提取的成本。粉碎甘蔗的经济学在Gbaboa的“切蔗机/榨汁机和辊型甘蔗汁提取系统的比较研究(Comparative study on cane cutter/juice expeller and roller model Sugarcane juice extraction systems)”，国际当前科学杂志(INT J CURR SCI)2013,7：E 55-60(将其特此通过引用结合在此)中更详细地描述。如果可以消除对粉碎或热水提取的需要，则可以降低提取糖的成本。

[0034] 甜菜的本体密度为约769kg/m3，并且甘蔗、甜高粱和热带玉米杂交种(即秸秆)的3
坯料(切片)的本体密度为约350kg/m。如果糖含量为约18％，则这导致每立方米甜莱138kg糖的糖密度，并且每立方米甘蔗、甜高粱和热带玉米杂交种为63kg糖的糖密度。由于运输成本主要是体积(并且不是重量)的函数，并且由于作物经常距离其被加工的地方显著距离收割，所以以如此低的密度运输糖是相当昂贵的，因为只有5％至10％的卡车体积被糖占据。
希望的是通过在(或接近)这些作物的收割地点制造乙醇(降低运输成本)来降低从富含碳水化合物的作物制造乙醇的成本。

[0035] 富含碳水化合物的薄壁组织中的薄壁细胞是活组织，并且因此在收割后呼吸(respire)(呼吸(breathe))。呼吸涉及将薄壁细胞中的氧和糖转化为二氧化碳和能量以维持细胞。在收割甜菜后，通过呼吸消耗约200克糖/天/公吨甜菜，并且收割后的前5天中，通过呼吸消耗约600克至1500克糖/天/公吨甜菜。如果甜菜是按重量计约18％糖，则一公吨甜菜中存在约180kg糖，导致在前5天中的每天0.3％至0.8％之间的糖损失和在随后的日子里的每天0.1％的糖的损失。鉴于甜菜可以在加工前储存100天，它们可能由于呼吸而损失其糖含量的最高10％。甘蔗、甜高粱和热带玉米在被储存时失去相似量的糖。本领域对通过比目前的方法更快速地将碳水化合物转化成乙醇来减少呼吸中的糖损失存在需求。一旦将作物中的碳水化合物转化为乙醇，它们可以长时间储存，允许全年连续去除乙醇。希望的是通过全年，而不仅在收割季节期间使用这种设备，更有效地利用投资于辊提取、乙醇汽提和蒸馏的资本。

[0036] 如果将甜菜在无氧(没有氧)条件下储存，微生物会定殖甜菜，并且21天后将使这些甜菜中的所有糖完全发酵，主要发酵成乳酸和乙酸。由于甜菜的外层经常通过收割而磨损和损坏，所以微生物可以更容易地渗透甜菜的外层，导致由于发酵成乳酸和乙酸的糖损失。类似地，甘蔗、甜高粱和热带玉米杂交种更容易受到穿透髓的微生物影响，因为在收割期间甘蔗已经被切开成坯料。

[0037] 从富含碳水化合物的作物生产乙醇的大部分资本成本和运营成本是加热原料的成本。通过使用自发酵释放的能量的自身加热可以降低(或消除)这些成本。

[0038] 用于从富含碳水化合物的作物生产乙醇的一些技术需要在压力容器内进行预处理或发酵。因为压力容器具有爆炸的危险并且比非加压容器需要更大的强度，因此不需要压力容器将是有益的。

[0039] 从富含碳水化合物的作物生产乙醇的另一个重大资本成本和运营成本是冷却发酵反应器的成本。将希望的是使用低成本的被动冷却，例如在金属壁罐上吹送空气或将冷二氧化碳气体循环通过作物。

[0040] 发明概述

[0041] 本发明提供了一种用于从富含碳水化合物的植物薄壁组织生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

[0042] (a)提供在作物温度下的富含碳水化合物的植物薄壁组织；

[0043] (b)将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织与在试剂温度下的含有发酵微生物的水性试剂溶液组合；

[0044] (c)或者在步骤(b)之前或步骤(b)之后将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织暴露于气相制备压力持续制备时间，其中所述气相制备压力小于大气压；

[0045] (d)将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织暴露于气相灌注压力持续灌注时间，其中所述气相灌注压力大于所述气相制备压力；并且

[0046] (e)保持气相发酵压力持续发酵时间以在所述富含碳水化合物的植物薄壁组织内产生发酵产物，其中所述气相发酵压力大于所述气相制备压力，并且其中至少25％所述发酵产物的质量是乙醇。

[0047] 在优选的实施例中，所述富含碳水化合物的植物薄壁组织选自下组，该组由以下各项组成：甘蔗秸秆、甜高粱秸秆、热带玉米杂交种秸秆、甜菜块茎、苹果、葡萄和橙子。在一些实施例中，所述富含碳水化合物的植物薄壁组织选自下组，该组由以下各项组成：马铃薯块茎、甘薯块茎、木薯块茎、山药块茎和洋姜块茎。

[0048] 在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有果胶酶。在一些实施例中，所述该水性试剂溶液含有木聚糖酶。在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有淀粉酶。在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有菊粉酶。

[0049] 在优选的实施例中，所述作物温度为从约5℃至约40℃。

[0050] 在优选的实施例中，所述气相制备压力为在作物温度和试剂温度更高者下的水平衡压力的从约105％至约200％。

[0051] 在优选的实施例中，所述制备时间为从约1分钟至约1小时。

[0052] 在优选的实施例中，所述发酵微生物是酿酒酵母。

[0053] 在优选的实施例中，所述试剂温度为从约20℃至约40℃。

[0054] 在优选的实施例中，将所述水性试剂溶液均化。在一些实施例中，该方法还包括使用在约0.15W/kg至约50W/kg范围内的湍流能量混合所述水性试剂溶液。

[0055] 在优选的实施例中，所述灌注时间为从约1分钟至约1小时。

[0056] 在优选的实施例中，所述发酵时间为从约6小时至约7天。

[0057] 在优选实施例中，所述发酵压力为大气压。

[0058] 在一些实施例中，该方法还包括将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织保持在无氧环境中持续发酵时间完成后的作物保存时间。

[0059] 在优选的实施例中，该方法还包括通过真空汽提回收所述发酵产物。在一些实施例中，该方法还包括通过粉碎回收所述发酵产物。在一些实施例中，该方法进一步包括或者在步骤(e)之前或步骤(e)之后排出该水性试剂溶液。

[0060] 附图简要说明

[0061] 图1是在本发明的实施例和实例中使用的实验装置的示意图。

[0062] 本发明实施方式的详细说明

[0063] 本发明的方法、过程和系统将通过参考不同非限制性的实施例和一个或多个附图进行详细说明。

[0064] 本说明将使得本领域的技术人员能够制造和使用本发明，并且本说明描述了本发明的若干实施例、修改、变体、替代方案、以及用途。在结合附图参考本发明的以下详细描述时，本发明的这些和其他实施例、特征和优点对于本领域的技术人员而言将变得更清楚。

[0065] 如在本说明书和所附的权利要求书中所使用的，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”以及“该(the)”包括复数指示物。除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

[0066] 除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表达参数、条件、结果等等的所有数值应被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。因此，除非相反地指明，在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值是近似值，这些近似值可以根据具体算法和计算而不同。

[0067] 与“包括(including)”、“含有(containing)”、或“特征为”同义的术语“包含(comprising)”是包容性的或开放性的并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。“包含”是在权利要求语言中使用的专门术语，它是指指定的权利要求要素是必需的，但是其他权利要求要素可以添加并且仍构成在该权利要求范围内的概念。

[0068] 如在此所使用，短语“由……组成”不包括未在权利要求书中指明的任何要素、步骤或成分。当短语“由……组成”(或其变型)出现在一个权利要求的主体的条款中，而不是立即跟在前言之后时，它只限制该条款中阐述的要素；其他要素作为整体未被排除在该权利要求之外。如在此所使用，短语“主要由……组成”将权利要求的范围限制于指定的要素或方法步骤，加上不实质地影响所要求保护的主题的基础和一个或多个新颖特征的那些。

[0069] 关于术语“包含”、“由……组成”以及“主要由……组成”，当在此使用这三个术语之一时，目前披露的且要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任何一个。因而，在一些未另外明确陈述的实施例中，“包含”的任何实例可以替换成“由……组成”，或可替代地替换成“主要由……组成”。

[0070] 在此所述的实施例均不应受到关于反应机理、传质机理的任何理论或推测或原料或产品说明的限制。

[0071] 本发明的前提是以下问题的技术解决方案：由于有效地粉碎或以扩散到热水中提取所需的大量的能量和资本，从富含碳水化合物的植物薄壁组织生产发酵产物是昂贵的。本发明使用在真空下将发酵试剂灌注入富含碳水化合物的植物薄壁组织的质外体的替代方法，允许发酵并且然后使用低成本技术如真空汽提来分离所得的乙醇溶液。在此的实例中证明了本发明的原理。

[0072] 本发明的前提还是以下问题的技术解决方案：在收割后并且在加工或消耗之前的富含淀粉和富含菊粉的作物的降解。本发明使用在真空下将发酵微生物灌注入薄壁组织的质外体的方法来将简单糖发酵成乙醇，从而剥夺定植和消耗淀粉或菊粉所需的其他微生物的简单糖。这导致典型的0.1％的富含碳水化合物的组织的质量损失和保护淀粉或菊粉免于降解的益处。一旦简单糖被发酵，可以降解这些薄壁组织的唯一微生物是在果胶上生长的真菌，在乙醇上生长的微生物和在淀粉或菊粉上生长的微生物。

[0073] 在果胶上生长的大多数真菌是需氧的，因此保持环境无氧防止这些真菌定殖于薄壁组织。在果胶上生长的厌氧真菌、尤其是米根霉也需要葡萄糖在果胶上生长，因此保持环境不含葡萄糖以及无氧防止这些真菌定殖于薄壁组织。

[0074] 在乙醇上生长的微生物、尤其是醋杆菌也是需氧的，因此保持环境无氧防止这些微生物将乙醇转化为乙酸。

[0075] 在淀粉上生长的微生物、尤其是枯草芽孢杆菌需要进入薄壁组织内的淀粉颗粒。不希望受任何特定理论的束缚，据信去除质外体中和薄壁细胞内的葡萄糖引起微生物像枯草芽孢杆菌不具有在薄壁组织内运动的足够的能量。

[0076] 酵母在发酵时产生大量的二氧化碳，并将酵母灌注入富含碳水化合物的植物薄壁组织中在发酵期间在该组织的外部上形成泡沫并通过该组织内的气泡形成的作用从该组织排出液体。出人意料地，酵母不会被这些气泡排出，并且酵母可以继续发酵直到所有简单糖被发酵。

[0077] 不希望受任何特定理论的束缚，据信在葡萄糖存在下，酵母细胞对薄壁细胞的粘附性比用于将酵母从薄壁组织中排出的二氧化碳气泡的力更强。

[0078] 本发明的前提还在于以下事实：简单糖通过富含碳水化合物的作物的薄壁细胞的细胞膜的扩散速率足以使得质外体内的发酵微生物以高速率发酵在这些薄壁细胞内的简单糖。然后乙醇扩散到薄壁细胞中。在一些变体中，薄壁细胞壁不降解，保持作物的结构强度，这使得能够使用低成本真空汽提。在其他变体中，果胶酶降解薄壁细胞壁，提高发酵速率，并减少去除乙醇后对组织脱水所需的能量。

[0079] 在一些变体中，本发明提供了一种用于从富含碳水化合物的植物薄壁组织生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

[0080] (a)提供在作物温度下的富含碳水化合物的植物薄壁组织；

[0081] (b)将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织与在试剂温度下的含有发酵微生物的水性试剂溶液组合；

[0082] (c)或者在步骤(b)之前或步骤(b)之后将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织暴露于气相制备压力持续制备时间，其中所述气相制备压力小于大气压；

[0083] (d)将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织暴露于气相灌注压力持续灌注时间，其中所述气相灌注压力大于所述气相制备压力；并且

[0084] (e)保持气相发酵压力持续发酵时间以在所述富含碳水化合物的植物薄壁组织内产生发酵产物，其中所述气相发酵压力大于所述气相制备压力，并且其中至少25％所述发酵产物的质量是乙醇。

[0085] 本领域技术人员将认识到，可以在将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织与水性试剂溶液组合之前亦或之后施加所述气相制备压力。Gras描述了在施加真空之前进行组合，并且下面的实例描述了在施加真空之后组合。如Gras所描述的，在施加真空之前进行组合具有更快的抽空时间的优点，因为较少的体积需要被抽空。然而，它具有在较大的容器的底部具有更高的静水压的缺点。对于只有1米深的容器，这个缺点并不重要，但是对于更深的容器，这个缺点可能是重要的。

[0086] 本领域技术人员将认识到存在生产乙醇的各种发酵微生物，并且这些发酵微生物在葡萄糖存在下粘附于表面。

[0087] 真空灌注可以用适度强度的容器完成，该容器被用块茎或秸秆填充到顶部并且在顶部具有橡胶囊-当施加真空时，作物本身的强度支持该容器外部上的100kPa的大气压。这导致非常低成本的真空灌注容器，并且将空气抽出该真空灌注容器的能量成本也相当低。在一些实施例中，该真空灌注容器可以是例如从田地带来作物的卡车，具有顶部上插入的橡胶囊。

[0088] 一旦灌注了水性试剂溶液，可将作物转移到甚至更低成本的发酵容器中。这种更低成本的发酵容器不需要是气密的，刚紧密到足以保持通过发酵产生的二氧化碳以保持发酵无氧，从而防止醋酸杆菌细菌对乙醇的降解。

[0089] 在优选的实施例中，所述富含碳水化合物的植物薄壁组织选自下组，该组由以下各项组成：甘蔗秸秆、甜高粱秸秆，热带玉米杂交种秸秆、甜菜块茎、苹果、葡萄和橙子。这些都主要在薄壁组织中含有简单糖，并且可以用酵母发酵，而不需要灌注果胶酶。任选地，果胶酶加速发酵，尽管以复杂性和酶的额外成本为代价。

[0090] 在一些实施例中，所述富含碳水化合物的植物薄壁组织选自下组，该组由以下各项组成：马铃薯块茎、甘薯块茎、木薯块茎、山药块茎和洋姜块茎。这些作物含有按重量计在0.01％至2％之间的少量的简单糖，并且剩余的碳水化合物作为多糖。为了保存这些作物，灌注酵母会将少量的简单糖转化成乙醇。为了将这些作物中的多糖转化为乙醇，需要另外灌注果胶酶和淀粉酶或菊粉酶。

[0091] 在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有果胶酶。在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有木聚糖酶。在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有淀粉酶。在一些实施例中，所述水性试剂溶液含有菊粉酶。优选的果胶酶是在需要最少生产甲醇作为副产物的实施例中的果胶裂解酶。需要果胶酶和木聚糖酶的组合以便分解双子叶植物中的薄壁细胞壁。

[0092] 在优选的实施例中，作物温度为从约5℃至约40℃。需要这个温度范围，因为发酵微生物在这个范围内是活性的。

[0093] 在优选的实施例中，所述气相制备压力为在所述作物温度和所述试剂温度更高者下的水平衡压力的从约105％至约200％。压力需要尽可能低，同时还防止作物或试剂沸腾。

[0094] 在优选的实施例中，所述制备时间为从约1分钟至约1小时。有些作物耗费比其他作物更长的时间来从质外体排空气体，特别是甘蔗和甜高粱。

[0095] 在优选的实施例中，所述发酵微生物是酿酒酵母。所述微生物具有任何发酵微生物的最高的乙醇耐受性，并且许多杂交种可供使用。

[0096] 在优选的实施例中，所述试剂温度为从约20℃至约40℃。发酵微生物在这个温度范围内蓬勃发展。

[0097] 试剂温度应足够低，这样水性试剂溶液中的水不会在制备压力下沸腾，其中沸腾引起以大气泡快速释放蒸气。由于水通常是水性试剂溶液的主要成分，因此可以使用水平衡数据来确定在给定制备压力下的试剂温度，反之亦然。例如，如果试剂温度为约38℃，则制备压力应大于约7kPa。

[0098] 在优选的实施例中，将所述水性试剂溶液均化。在一些实施例中，该方法还包括使用在约0.15W/kg至约50W/kg范围内的湍流能量混合该水性试剂溶液。

[0099] 使用足够的湍流能量，这样使得Kolmogorov长度尺度在小于质外体自由长度(例如约10微米)的等级上。使用Kolmogorov长度尺度，并且知道20℃水的运动粘度为约10-6m2/s，将试剂混合和加工水至10微米尺度所需的能量为约50W/kg。类似地，混合至20微米尺度需要约5W/kg，并且混合至50微米尺度需要约0.15W/kg。

[0100] 本领域普通技术人员将认识到，存在可以用这类能量混合的许多简单的混合装置。一种这样的简单的混合装置是25-mm直径的塑料管，该塑料管长度为8米、具有0.0014的管粗糙度，从大气压(100kPa)到20kPa的真空度灌注，在灌注过程中用2.8升/秒(6CFM)真空泵保持该真空度。由于压降在该管中消耗的功率为226.4W。管中的液体总量为4.05kg，因此每kg消耗的功率为约56W/kg，这足以以10微米尺度混合(该示例性流量足以在1.8小时内灌注18m3)。

[0101] 在优选的实施例中，所述灌注时间为从约1分钟至约1小时。实验已经示出，糖的转化效率对灌注时间相对不敏感。

[0102] 在优选的实施例中，所述发酵时间为从约6小时至约7天。实验已经示出，取决于富含碳水化合物的植物薄壁组织的类型，用每个薄壁细胞约2个细胞的酵母浓度的发酵时间导致约6小时至20小时的发酵时间。

[0103] 在优选实施例中，所述发酵压力为大气压。由于持续生产CO2，并且由于压力容器是昂贵和危险的，所以在大气压下排放CO2是较便宜的。

[0104] 在一些实施例中，该方法还包括将所述富含碳水化合物的植物薄壁组织保持在无氧环境中持续发酵时间完成后的作物保存时间。当环境是无氧的并且在质外体或薄壁细胞中不存在简单糖时，真菌和细菌不能在果胶或乙醇上生长。

[0105] 在优选的实施例中，该方法还包括通过真空汽提回收发酵产物。在一些实施例中，该方法还包括通过粉碎回收发酵产物。在一些实施例中，该方法进一步包括或者在步骤(e)之前或步骤(e)之后排出所述水性试剂溶液。

[0106] 真空汽提是优选的，因为它是用于回收发酵产物的有效并且成本有效的技术。乙醇的真空汽提可以用类似的容器进行，如真空灌注，但具有增加的加热作物的能力。排出水性试剂溶液导致汽提蒸气中较高百分比的乙醇。

[0107] 本领域普通技术人员将认识到，用各种低成本技术可以将发酵期间的温升限制到约38℃，尤其是如果发酵在大约20小时内发生。

[0108] 本领域普通技术人员将认识到，已知的装置可用于在此披露的过程、系统和方法。在此的过程可以是分批的、连续的、半连续的或准连续的。在此对“容器”或“反应器”的任何提及应被解释为指一种或多种这样的装置(例如串联或并联)。可能希望或观察到各种流动模式。在化学反应和同时的传质过程涉及多个相的情况下，流体动力学可能是相当复杂的。
取决于具体设计，流动模式可以接近塞式流动或充分混合的流动。

[0109] 生产量或加工能力可能从小型实验室规模单元到完全商业规模的生物精炼厂，包括任何试点、示范或半商业规模，广泛地变化。在不同实施例中，加工能力为至少约1kg/天、10kg/天、100kg/天，1吨/天(所有吨为公吨)、10吨/天、100吨/天、500吨/天、1000吨/天，
2000吨/天、或更高。

[0110] 整个系统可以在固定的位置，或者它可以被制成便携式的。可以使用对于实际按比例放大可以简单地复制的模块来构造该系统。

[0111] 不同的探针可以允许跨越过程的不同阶段进行精确的过程监测和控制，直到并潜在地包括过程的所有阶段。当可以利用操作历史来调整工艺条件(包括压力循环程序)时，将预期精确的过程监测导致产量和效率的提高，在动态以及在一段时间内两种情况下。在一些实施例中，将反应探针布置成与处理区域可操作地连通。这样的反应探针可用于提取液体样品并分析它们，以便确定水解程度或糖轮廓等。过程调整可以基于，如果认为是必要的或希望的，使用公知的过程控制原理(反馈，前馈，比例-积分-导数逻辑等)的测量。

[0112] 在过程中产生或存在的固体、液体和气体流可以独立地循环，传递到后续步骤，或者在任何点从该过程中去除/清除。

[0113] 实例

[0114] 以下实例证明了本发明的原理。通过实验证据已经示出上述酵母和酶的真空灌注可用于发酵富含碳水化合物的作物。

[0115] 图1的实验装置被设计为就工业单元的温度、压力和流量控制而言再现工业过程功能。它与工业单元的不同在于装载和卸载作物(样品)。该实验装置用于以下所有实例。

[0116] 参考图1，实验装置100由主灌注容器102组成，该容器在操作中保持几乎完全浸入恒温槽101内，该恒温槽可在宽温度范围内操作并且其精确的温度控制通过温度控制器114确保。灌注容器102用可移除且密封的盖118封闭。灌注容器102和密封的盖118被设计成能够保持并且维持如工艺条件所要求的真空条件。所希望量的样品材料117可以放置在灌注容器102的内部。灌注容器102可以经CO2钢瓶106和CO2管线107供应CO2。在CO2管线107上，使用流量/压力调节器108来设定将CO2输送到灌注容器102的压力。真空泵103用于抽空并保持灌注容器102内的真空。压力指示器116和温度指示器119安装在灌注容器102上。灌注容器102通过闸阀109与具有制备的水性试剂溶液的容器105连接。真空泵103通过其中安装压力调节器110的管线连接到灌注容器102。压力调节器110允许灌注容器102压力在宽范围的真空水平上被调节，同时真空泵103以恒定的速度运行。压力调节器110上的通风孔112连接到气体计数器。在灌注容器102的气体出口上的四通阀104允许从样品端口111去除样品，隔离灌注容器102，使压力116循环，并将样品的一部分再循环回到灌注容器102中而不改变其内部的压力和气帽组成。

[0117] 以下实例的实验程序如下。根据实验的具体需要分别制备预混合的水性试剂溶液；任选地，水性试剂溶液可以预热到感兴趣的温度。将作物样品放置在灌注容器102内。灌注容器102中不存在液体。将灌注容器102放置在恒温槽101中，该恒温槽在为实验设定的温度下运行。一旦将盖118放置在灌注容器102的顶部上，使用真空泵103和来自管线107的CO2，冲洗任何空气并在样品的顶部上形成CO2气氛。一旦确保了任何残留空气的冲洗，通过在流量控制器115上操作来中断来自管线107的新鲜CO2的流动。通过经由压力调节器110控制它，允许灌注容器102中的压力下降到实验中限定的水平。

[0118] 一旦压力和温度稳定在所希望的水平，当压力下降时从作物中排出的游离液体任选地使用样品端口111从容器中排出并被保存用于进一步的分析。然后打开闸阀109，并允许预混合的水性试剂溶液进入进行其中发生灌注的灌注容器102。样品材料的量被按以下的方式设定，即，使得取决于材料的本体密度，一旦液体的进料被中断，样品就被完全浸没。通过准确地选择的温度和压力，可以避免液体的沸腾(沸腾引起气泡的大量释放)。在完成灌注并且关闭闸阀109之后，通过打开和调节流量和压力控制器108建立1.0atm的CO2分压。

[0119] 一旦液体以1.0atm的压力灌注到作物中持续所希望的时间，使用样品端口111任选地将游离液体从容器中排出。

[0120] 然后，实验可以进行持续所希望的持续时间。如果在实验期间需要液体样品，则可以将注射器连接到四通阀104样品端口111，其被设置为允许注射器充满液体。一旦将注射器移除并且样品端口111关闭，任何残留的液体通过四通阀歧管流回到容器中。

[0121] 发酵的进程通过在通风孔112产生的气体用来自德国波鸿的Dr.-Ing.Ritter Apparatebau GmbH&Co.Kg公司的MGC-1型的MilliGascounter来测量。在发酵期间内以毫升分辨率测量产生的气体量。3.35g糖(通常是蔗糖)的发酵产生1L的气体(CO2)，因此发酵糖的量、发酵速率和发酵糖的总量可以通过随时间推移产生的气体图来推断。

[0122] 以下实例使用北部的明尼苏达州的甜菜，来自佛罗里达州的甘蔗和来自田纳西州的甜高粱。榨出来自每一种的汁并且用数字折射计测量以白利糖度计的糖含量。每一种的样品完全干燥以确定干固体百分比。将这些合并以计算出这些作物中糖的百分比(w/w)。

[0123] 注意，甜高粱汁的白利糖度测量通过乘以约0.8调整以得到总糖的重量百分比。这是因为甜高粱汁具有比甜菜或甘蔗汁更多的葡萄糖和果糖，并且葡萄糖和果糖的折射率与蔗糖的折射率不同。这在Liu等人的“通过固定的酵母发酵从甜高粱的秸秆汁精炼生物乙醇(Refining bioethanol from stalk juice of sweet sorghum by immobilized yeast fermentation)”，再生能源(Renewable Energy)33.5(2008)：1130-1135(将其特此通过引用结合在此)中进行了描述。

[0124] 甜菜计算为具有按重量计18％的糖，甘蔗为按重量计14％的糖，并且甜高粱为按重量计10％的糖。

[0125] 实例1：将水灌注入甜菜薄壁组织中

[0126] 将甜菜切片径向切成三种不同的厚度，6mm、12mm和18mm。然后将这些切片切成25mm正方形切片，并将三个厚度中的每一个的所有25mm正方形切片称重，并放入上述三个装置(图1)中。这个实例的气帽是空气。

[0127] 在阶段1中，施加13kPa的真空持续30分钟，除去游离水，压力恢复至100kPa，并称重每个立方体。

[0128] 在阶段2中，施加13kPa的真空持续30分钟，在真空下灌注水直到立方体被覆盖，压力恢复到100kPa，水灌注入薄壁组织持续30分钟，除去游离水，并且然后称重每个立方体。

[0129] 在阶段3中，施加13kPa的真空持续30分钟，除去游离水，压力恢复至100kPa，并称重每个立方体。

[0130] 该测试的结果示于下表1中，并且该结果示出当施加真空持续30分钟时，薄壁组织的质量的约10％从该组织渗出。它还示出薄壁组织的质量的约6％可以在真空下灌注有水，并且当再次施加真空时，其中约一半从该组织渗出。更重要的是，该实例示出在6mm厚的组织和18mm组织中，灌注几乎相同。

[0131] 表1：甜菜切片的质量

[0132]厚度 初始质量 阶段1质量 阶段2质量 阶段3质量
6mm 5.985g 5.389g 5.695g 5.604g
12mm 8.987g 8.358g 8.761g 8.312g
18mm 14.782g 13.194g 14.32g 13.557g

[0133] 实例2：甘蔗的发酵

[0134] 用富含富氮营养素(来自BSG公司的Fermax)的微酸性酵母溶液灌注切碎的甘蔗。两种不同的溶液一式两份地进行测试，一份使用Thermosacc酵母，并且一份使用Distillamax酵母。两种酵母均可从Lallemand Biofuels&Distilled Spirits公司商购，并且细胞体的平均尺寸不同。Thermosacc酵母具有5微米的平均细胞直径并且Distillamax具有10微米的平均细胞直径。灌注完成后，通过气体计数器监测二氧化碳生成量，以估计发酵进程。使用以下程序：

[0135] 1.开始加热恒温槽至38℃。

[0136] 2.称量大约50g的甘蔗，然后切碎成大约一英寸的块，在切碎之后再次称量甘蔗的总量。

[0137] 3.制备两种酵母溶液，一种具有5g/L Distillamax酵母、1g/L Fermax营养素并且一种具有5g/L Thermosacc(C6)酵母，1g/L Fermax营养物，用磷酸缓冲二者至3.5的pH。

[0138] 4.将密封烧杯中的甘蔗放在恒温槽中，并施加真空持续30分钟，以确保从生物质中完全排出气体。

[0139] 5.向每个烧杯灌注大约200g的溶液。

[0140] 6.缓慢恢复大气压力，在烧杯内容物顶部产生惰性气帽。

[0141] 7.打开排气阀，以便使气体流过气体流量计。

[0142] 8.使发酵试验到完成，同时记录气体流量。

[0143] 具有Thermosacc酵母和Distillamax酵母的样品一式两份地试验，并且具有最高气体产率的结果呈现于表2中。两种发酵都耗费稍小于8个小时才能完成。

[0144] 在这两种情况下，灌注允许发酵在甘蔗的主体内发生，具有对基材进行最少的预处理(除了粗破碎之外)。出人意料地，较小的酵母细胞似乎更有效，确保了较大的糖转化率，如通过较大的气体产量所证明的。这个结果与较小的酵母能够更深地扩散到甘蔗质外体内部是一致的。在这两种情况下，真空灌注允许活性原位发酵，如表2中所示。

[0145] 表2：甘蔗发酵的效率

[0146]

[0147] 实例3：甜菜的发酵

[0148] 用由Lallemand Biofuels&Distilled Spirits公司的Distillamax酵母制成的微酸性酵母溶液灌注粗切碎的甜菜块。每个样品使用不同的灌注时间。灌注完成后，通过气体计数器监测二氧化碳生成量，以估计发酵进程。使用以下程序：

[0149] 1.确保恒温槽在38℃。

[0150] 2.称量约100g甜菜，然后切碎成大约一英寸立方体的块，切碎后再次称量总甜菜。

[0151] 3.制备具有5g/L Distillamax酵母的酵母溶液，用磷酸缓冲至3.5的pH。

[0152] 4.在样品2和4的溶液中，以约5g/kg干燥生物质的荷载加入具有果胶酶活性的酶。

[0153] 5.将密封烧杯中的甜菜样品放入恒温槽中，并施加真空持续30分钟。

[0154] 6.灌注足够的溶液以淹没所有甜菜块。

[0155] 7.样品1和2立即释放压力，并且样品3和4缓慢释放压力(约5分钟)。

[0156] 8.连接气体计数器。

[0157] 9.使发酵试验到完成。

[0158] 样本量和通过发酵这4个甜菜样品的每个产生的气体量呈现于表3中。所有发酵耗费13与15之间个小时才能完成。灌注时间对整体糖转化产率没有显著影响，因为对于快速灌注情况(样品1和2)，该产量高于约90％。慢灌注似乎稍微不利。添加分解细胞壁的果胶酶似乎改善发酵，并进一步阐明在没有机械混合和最少预处理生物质的情况下给予原位酶和微生物活性的真空灌注能力。

[0159] 表3：甜菜发酵的效率

[0160]

[0161] 实例4：甜高粱的发酵

[0162] 使用与以上实例2一样的用于发酵甜高粱的相同程序。代替改变酵母的类型，将Thermosacc酵母用于两个样品。一个样品在灌注后从秸秆中排出液体，并且另一个没有排出液体。

[0163] 这些发酵的结果呈现于表4中。两种发酵都耗费稍小于20个小时才能完成。

[0164] 出人意料地，其中从秸秆排出液体的发酵效率高于将液体留在秸秆周围的效率。然而，在两种情况下，真空灌注都允许活性原位发酵。

[0165] 表4：甜高粱发酵的效率

[0166]

[0167] 实例5：马铃薯发酵

[0168] 用由Lallemand Biofuels&Distilled Spirits公司的Thermosacc酵母制成的微酸性酵母溶液灌注粗切碎的马铃薯块。一个样品用来自美国明尼苏达州的Shakopee的BSG Handcraft公司的α-淀粉酶另外灌注。该α-淀粉酶在66℃具有最大活性，并且在38℃下具有约20％的活性。灌注完成后，通过气体计数器监测二氧化碳生成量，以估计发酵进程。使用以下程序：

[0169] 1.确保恒温槽在38℃。

[0170] 2.称量约70g马铃薯，然后切碎成大约一英寸立方体的块，切碎后称量总马铃薯。

[0171] 3.制备具有5g/L Thermosacc酵母的酵母溶液，用磷酸缓冲至3.5的pH。

[0172] 4.在样品2的溶液中，以5g/kg干物质的荷载加入具有α-淀粉酶活性的酶。

[0173] 5.将密封烧杯中的马铃薯样品放入恒温槽中，并施加真空持续30分钟。

[0174] 6.灌注足够的溶液以淹没所有马铃薯块。

[0175] 7.立即释放压力。

[0176] 8.连接气体计数器。

[0177] 9.使发酵试验持续约120小时。

[0178] 样本量和通过发酵这2个马铃薯样品的每个产生的气体量呈现于表5中。本领域技术人员将认识到，在薄壁细胞中存在约0.5％至2％的简单糖(蔗糖+葡萄糖)，并且马铃薯中存在约18％的淀粉，其中该淀粉的约80％可以通过α-淀粉酶分解成葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。两种样品的发酵在产生可测量的气体前耗费14.5小时。

[0179] 不希望受任何特定理论的束缚，据信此长的诱导时间部分是由马铃薯中的水中吸收初始的CO2产生而引起的，并且当马铃薯中的水被CO2饱和时，气体产生开始。本领域技术人员将认识到，在38℃下，CO2在水中的溶解度为约1.6g/L，0.076L马铃薯组织含有约0.608L的水，并且第一个气泡将出现之前约0.042L的CO2将溶解在0.076L的马铃薯。

[0180] 发酵120小时后，样品1产生0.155L气体，并且样品2产生1.27L气体。样品1在72小时与120小时之间不产生可测量的气体，显示出质外体和薄壁细胞中的所有简单糖都被发酵，并且没有另外的简单糖从淀粉颗粒中释放出来。这示出灌注酵母将保留富含淀粉的薄壁组织。

[0181] 样品2中显著更高的气体产量示出α-淀粉酶扩散到薄壁细胞中，并将约40％的淀粉颗粒水解成酵母可以发酵的糖。气体生产在整个120小时发酵是连续的，其中缓慢下降。该实例证明这种技术可以通过简单地灌注酵母和淀粉酶而不灌注果胶酶来发酵薄壁细胞内的淀粉颗粒。它还示出薄壁细胞膜对淀粉酶是可渗透的。

[0182] 表5：马铃薯发酵的效率

[0183]

[0184] 在本详细说明中，已参考多个实施例和附图，在附图中通过图示方式示出了本发明的具体示例性实施例。对这些实施例进行了说明以使本领域的技术人员能够实践本发明，并且应理解，可以由熟练的技术人员对所披露的不同实施例作出修改。

[0185] 当上述方法和步骤表明某些事件以某种顺序发生时，本领域普通技术人员将认识到可以修改某些步骤的顺序并且此类修改是根据本发明的变体。另外，在可能时可以在并行过程中同时执行某些步骤，也可顺序执行某些步骤。

[0186] 本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其全部内容结合在此，就如同每个出版物、专利或专利申请已经在此明确地且单独地阐述。

[0187] 上述实施例、变型和附图应当提供本发明的实用性和通用性的指示。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以利用未提供在此阐明的所有特征和优点的其他实施例。这类修改和变体被认为在由权利要求书限定的本发明的范围内。在本披露内容与词典或其他参考文献之间的定义中有冲突的情况下，将以本披露内容为准。