用于生物传感器的石墨烯‑聚合物‑酶混杂纳米材料

摘要

本发明涉及用于合成生物相容性混杂纳米材料的通用化学方法，其可用于开发新型的基于酶的生物传感器。提出了一步式简便方法，其中聚乙烯亚胺(PEI)既充当将氧化石墨烯(GO)还原为还原型氧化石墨烯(RGO)的还原剂，又充当容纳酶的生物基质。

权利要求

1.用于制备包含还原型氧化石墨烯(RGO)、聚乙烯亚胺(PEI)和酶的混杂生物功能复合材料的方法，所述方法包括以下步骤：A)提供氧化石墨烯(GO)水溶液；

B)通过向所述GO水溶液添加PEI来还原GO，从而获得RGO-PEI水溶液；以及C)将所述RGO-PEI水溶液与酶混合，从而获得所述混杂生物功能复合材料，其中所述RGO与所述PEI形成共价键，并且PEI形成生物相容性基质，其将所述酶静电包封在所述基质内。

2.根据权利要求1所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中所述酶具有低于10的等电点。

3.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中所述酶选自：葡萄糖氧化酶(GOx)、胆固醇氧化酶(ChOx)、辣根过氧化物酶(HRP)、醇脱氢酶(ADH)和胆碱氧化酶。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中所述PEI聚合物具有至少60.000单体单元的平均聚合物长度。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中所述PEI聚合物具有以下分子式的单体单元：

6.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中在步骤B)中添加PEI后，在70至120℃、或80至110℃、或90至100℃的温度下、或者在95℃下，将所述获得的溶液搅拌30分钟至90分钟、或45分钟至75分钟、或60分钟。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中在步骤C)中将所述RGO-PEI水溶液与所述酶混合在1至10℃、或2至8℃、或3至6℃、或4至5℃的温度下、或者在4℃下进行6至24小时、或8至18小时、或10至14小时。

8.根据权利要求6所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其中将步骤C)中获得的混合物在1至10℃、或2至8℃、或3至6℃、或4至5℃的温度下、或者在4℃下混合6至24小时、或8至18小时、或10至14小时后，以8000rpm离心15分钟。

9.根据前述权利要求中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法，其还包括以下步骤：D)用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤在步骤C)中获得的溶液，以及

E)将所述溶液依次离心例如三次，以除去松散结合的酶。

10.混杂生物功能复合材料，其包含还原型氧化石墨烯(RGO)、聚乙烯亚胺(PEI)和酶，其中所述RGO与PEI形成共价键，并且其中PEI形成生物相容性基质，其将所述酶静电包封在所述基质内。

11.根据权利要求10所述的混杂生物功能复合材料，其中所述混杂生物功能复合材料通过根据权利要求1至9中任一项所述的用于制备混杂生物功能复合材料的方法制备。

12.根据权利要求10至11中任一项的混杂生物功能复合材料，其中所述酶具有低于10的等电点，和/或选自葡萄糖氧化酶(GOx)、胆固醇氧化酶(ChOx)、辣根过氧化物酶(HRP)、醇脱氢酶(ADH)和胆碱氧化酶。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的混杂生物功能复合材料，其中所述PEI具有至少60.000单体单元的平均聚合物长度。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的混杂生物功能复合材料，其中所述PEI聚合物具有以下分子式的单体单元：

15.根据权利要求10至14中任一项所述的混杂生物功能复合材料作为用于基于石墨烯之生物传感器的基于酶之生物传感材料的用途。

16.根据权利要求10至15中任一项所述的混杂生物功能复合材料用于以下的用途：●缀合毒性重金属离子，例如Pb2+、Hg2+和Cd2+；

●清洁环境和水技术；或

●药物递送，其中RGO-PEI捕获并释放特定药物。

17.电极复合材料结构，其包含根据权利要求10-14中任一项所述的混杂生物功能复合材料。

说明书

用于生物传感器的石墨烯-聚合物-酶混杂纳米材料

[0001] 本发明涉及用于合成生物相容性混杂纳米材料的通用化学方法，其可用于开发新型的基于酶的生物传感器。

背景技术

[0002] 石墨片(graphite flake)的完全化学剥离(complete chemical exfoliation)可生成单层且水溶性的个体氧化石墨烯(graphene oxide，GO)片。然而GO是电绝缘的，并且如果将该材料用于电子应用或用作电极材料，则因此需要恢复该材料的导电性。这可以通过将GO化学或热还原成其还原形式(RGO)来实现。已经尝试了数种还原剂(包括肼(N2H4)、1-二甲基肼、3-硼氢化钠和氢奎宁)来用于还原GO，这显示出具有不同效率的结果。

[0003] 在上述还原剂中，肼可以说是最常用的试剂。然而，肼并不是环境和生物友好的试剂。此外，根据实验条件，由肼制备的RGO悬浮液具有数小时至数天的有限稳定性。CN102850795公开了将肼用作还原剂以用于将GO还原为RGO之方法的实施例。通过肼将GO还原成RGO后，将RGO与二茂铁接枝的PEI(Ferrocene grafted PEI)混合，从而在PEI与RGO之间形成非共价键。

[0004] Shanli Yang等(Microchim Acta 2013，180，第127-135页)公开了用于将GO还原为RGO的替代方法，其中通过将玻璃碳电极浸入溶液中将含有GO溶液的生物传感器还原为RGO。

[0005] 因此，开发用于制备导电且生物相容性RGO的通用化学途径对于促进RGO在生物环境中的使用是特别期望的。

发明内容

[0006] 本发明公开了氧化石墨烯(GO)的一步式绿色还原和聚合物衍生化，这使得可生产稳定且生物相容性的还原型GO(reduced GO，RGO)纳米片。更具体地说，这里公开了在水性介质中通过聚合物聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)在聚合物与RGO之间同时形成共价键的一步式绿色还原氧化石墨烯的简便、环境友好且实用的方法。

[0007] 因此，本文中公开了用于制备包含还原型氧化石墨烯(reduced grapheme oxide，RGO)、聚乙烯亚胺(PEI)和酶的混杂生物功能复合材料(hybrid biofunctional composite)的方法。所述方法包括以下步骤：A)提供氧化石墨烯(GO)水溶液；B)通过向GO水溶液添加PEI来还原GO，从而获得RGO-PEI水溶液；以及C)将RGO-PEI水溶液与酶混合，从而获得混杂生物功能复合材料。

[0008] RGO与PEI形成共价键，并且PEI形成生物相容性基质，其将酶静电包封(electrostatically encapsulating)在基质内。因此，该酶与RGO支持的PEI非共价结合。

[0009] 通过上述方法获得了混杂生物功能复合材料，其包含导电元件(即RGO)、由与RGO共价结合的PEI聚合物限定的聚合物笼(polymer cage)/基质和酶形式之生物催化剂的组合。酶与混杂生物功能复合材料的其余部分(即RGO-PEI)之间的非共价键合确保了当酶被包含在PEI基质内时不发生改变，因为酶不与PEI基质材料或RGO形成任何键。相反，这允许酶在聚合物笼内部“自由地”移动，其程度由酶和聚合物基质袋的尺寸限定。

[0010] 酶良好地保留其结构和催化活性，因为其位于生物相容性基质或环境中。换言之，即使酶与RGO和PEI偶联，仍保持酶的催化特性。

[0011] 聚合物PEI也是环境相容且环境友好的，这使其成为在环境方面比肼更好的替代物。其能够与GO形成共价键，同时将GO还原成RGO，且后者是优良的导电材料。因此，使用PEI作为还原剂，则可以避免使用环境和生物不友好的试剂，例如肼。

[0012] 此外，根据实验条件，由肼制备的RGO悬浮液具有数小时至数天的有限稳定性。当使用PEI获得GO向RGO的还原时，避免了这种不稳定性问题。

[0013] 因此，通过上述方法获得了用于制备可用于生物环境的导电且生物相容性RGO的通用化学途径。

[0014] 本文中还公开了包含还原型氧化石墨烯(RGO)、聚乙烯亚胺(PEI)和酶的混杂生物功能复合材料，其中所述RGO与PEI形成共价键，并且其中PEI形成生物相容性基质，其将酶静电包封在基质内。因此，该酶与RGO支持的PEI非共价“结合”。

[0015] 本文中还公开了根据上述和通过本文中公开的方法制备的混杂生物功能复合材料。

[0016] 本文中还公开了包含如上所述的混杂生物功能复合材料的电极复合材料结构。

附图说明

[0017] 图1公开了用于制备RGO-PEI复合材料的方法。

[0018] 图2a示出了具有所制备的GO纳米片之溶液的吸收池(左侧)和溶液的相应UV光谱(右侧)。

[0019] 图2b示出了具有RGO-PEI纳米片之溶液的吸收池(左侧)和溶液的相应UV光谱(右侧)。

[0020] 图2c示出了具有由肼(N2H4)还原的RGO纳米片溶液的吸收池(左侧)和溶液的相应UV光谱(右侧)。

[0021] 图3a-3d示出了云母上的GO(图3a)、由N2H4还原的RGO(图3b)、RGO-PEI(图3c)和RGO-PEI/GOx复合材料(图3d)的AFM图像，其中GOx是葡萄糖氧化酶。

[0022] 图4a-4b示出了云母上RGO-PEI结构的具有不同分辨率的高分辨率AFM图像。

[0023] 图5a-5d示出了RGO-PEI的XPS谱。

[0024] 图6是概述了通过XPS对GO、RGO-N2H4和RGO-PEI中表面氧基团量之元素分析的表格。

[0025] 图7a示出了GO、RGO-N2H4(“标记的RGO”)和RGO-PEI的FTIR光谱。

[0026] 图7b是列出在图7a中观察到的GO和RGO-PEI的峰模式(以cm-1表示)的表格。

[0027] 图8是制备混杂生物功能复合材料的示意图。

[0028] 图9a示出了GOx在与RGO-PEI缀合之前和之后的UV-Vis吸收光谱。

[0029] 图9b示出了从图9a的数据获得的GOx与RGO-PEI的吸收质量比。

[0030] 图9c是概述图9a和9b所示结果的表格。

[0031] 图10a示出了吸收到RGO-PEI之前和之后的ChOx的UV-Vis吸收光谱。

[0032] 图10b示出了图10a中UV-VIS光谱中所示的ChOx与RGO-PEI的吸收质量比。

[0033] 图10c是基于图10a和10b所示结果的ChOx与RGO-PEI的质量比的数据分析列表。

[0034] 图11a示出了用RGO-PEI-ChOx复合材料涂覆的玻璃碳电极(glassy carbon electrode，GCE)表面处具有不同浓度的胆固醇的电催化氧化。

[0035] 图11b示出了基于图11a所示数据的ChOx生物传感器响应于胆固醇的校准图。

[0036] 图12a示出了在边缘平面石墨电极(edge plane graphite electrode，EPG)/RGO-PEI/GOx处的葡萄糖的电催化氧化。

[0037] 图12b示出了在0.35V下向含有0.8mM Fc-COOH的10mM PBS(pH 7.0)中连续添加葡萄糖的EPG/RGO-PEI/GOx的电流响应(amperometric response)。

[0038] 图12c示出了相比于葡萄糖浓度的电流响应。

[0039] 图12d示出了基于图12a所示结果的葡萄糖生物传感器的校准图。

[0040] 图13a-b示出了使用根据本发明的混杂生物功能复合材料传感器测量人血液样品中的葡萄糖水平。

[0041] 图14a-b示出了使用根据本发明的混杂生物功能复合材料传感器测量从丹麦Glostrup医院获得的人血液样品中的葡萄糖浓度。

[0042] 图15示出了根据本发明的混杂生物功能复合材料传感器的长期稳定性。

具体实施方式

[0043] 因此，本文中公开了用于制备包含还原型氧化石墨烯(RGO)、聚乙烯亚胺(PEI)和酶的混杂生物功能复合材料的通用化学方法。

[0044] 在一个或更多个实施方案中，酶具有低于10的等电点。

[0045] 在一个或更多个实施方案中，酶选自葡萄糖氧化酶(GOx)、胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase，ChOx)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)和胆碱氧化酶。

[0046] 用于制备混杂生物功能复合材料的方法包括以下步骤：提供氧化石墨烯(GO)水溶液，通过向GO水溶液添加PEI来还原GO，从而获得RGO-PEI水溶液，并将RGO-PEI水溶液与酶混合，从而获得混杂生物功能复合材料。

[0047] RGO与PEI形成共价键，且PEI形成生物相容性基质，其将酶静电包封在基质内。更具体地说，PEI通常形成位于RGO纳米片的平面和边缘上的基质，其中PEI基质形成将酶静电包封在基质内的笼(cage)。因此，该酶与RGO支持的PEI非共价结合。

[0048] 在一个或更多个实施方案中，PEI聚合物具有至少60.000单体单元的平均聚合物长度。或者，PEI聚合物具有至少10.000单体单元或至少25.000单体单元的平均聚合物长度。

[0049] 在一个或更多个实施方案中，PEI聚合物具有以下分子式的单体单元：

[0050]

[0051] 在一个或更多个实施方案中，在添加PEI后，在70至120℃、或80至110℃、或90至100℃的温度下、或者在95℃下，将所获得的溶液搅拌30分钟至90分钟、或45分钟至75分钟、或60分钟。

[0052] 在一个或更多个实施方案中，在步骤中将RGO-PEI水溶液与酶混合在1至10℃、或2至8℃、或3至6℃、或4至5℃的温度下、或者在4℃下进行6至24小时、或8至18小时、或10至14小时。

[0053] 在一个或更多个实施方案中，将RGO-PEI水溶液与酶混合所获得的混合物在1至10℃、或2至8℃、或3至6℃、或4至5℃的温度下、或者在4℃下混合6至24小时、或8至18小时、或10至14小时后，以8000rpm离心15分钟。

[0054] 在一个或更多个实施方案中，用于制备混杂生物功能复合材料的方法还包括以下步骤：用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤将RGO-PEI水溶液与酶混合时所获得的溶液，并将溶液依次离心例如三次以除去松散结合的酶。

[0055] 通过上述方法产生的混杂生物功能复合材料可以在一个或更多个实施方案中用作用于基于石墨烯之生物传感器的基于酶的生物传感材料。

[0056] 或者，混杂生物功能复合材料可用于：

[0057] ●缀合毒性重金属离子，例如pb2+、Hg2+和Cd2+；

[0058] ●清洁环境和水技术；或

[0059] ●药物递送，其中RGO-PEI捕获并释放特定药物。

[0060] 使用聚乙烯亚胺(PEI)作为还原剂和功能性接头来获得RGO。PEI是具有丰富胺基团的聚合物，由作为重复单元的乙烯亚胺部分构成。PEI已知为高度支化、带正电且水溶性的聚合物。在过去几年中，由于PEI具有高胺密度和其支链上可接近的伯胺位点，其作为用于构建吸附剂的多功能合成砌块(building block)受到极大关注。

[0061] RGO-PEI材料表现出生物相容性的显著改善，这可以提供容纳不同种类酶的微环境。因此，该RGO-PEI-酶混杂材料的生物相容性和优异的电子传递性质为其在生物传感中的应用铺平了道路。

[0062] 类似地，GO在其基面(basal plane)和边缘上含有氧官能团。因此，GO可以显示出对胺或含胺分子的高亲和力。当PEI与GO纳米片连接时，PEI中的残留胺基可表现出对阴离子材料(例如聚阴离子和带负电荷的有机、无机和生物分子)的良好吸附能力。

[0063] 基于PEI还原的RGO的湿化学合成如图1所示。制备RGO-PEI复合材料的典型方法是通过将400μl 0.1g/ml PEI与80ml H2O混合，然后添加20ml 0.1mg/ml GO来进行。通常在95℃下搅拌混合溶液1小时。颜色从棕色变为黑色表明通过PEI将GO还原成RGO。

[0064] 氧化石墨烯(GO)通常通过经修改的Hummer法制备，其中用作原料的石墨片＜20μm。氧化石墨烯(GO)的制备涉及两步式工艺，其中在第一步中制备预氧化石墨。在剧烈搅拌下，将石墨粉(5.0g)缓慢添加到保持在热水浴(80℃)中的含有P2O5(2.5g)和K2S2O8(2.5g)的浓H2SO4溶液(2.5ml)中，持续3小时。冷却至室温并用Milli-Q水稀释后，将深绿色混合物过滤并洗涤数次直到废液pH达到中性。随后收集预氧化的石墨粉，并在室温下在空气中干燥过夜。

[0065] 在第二步中，将预氧化石墨粉(1.0g)缓慢添加至在冰水浴(0℃)中的浓H2SO4溶液(23ml)中。然后将KMnO4(3.0g)在缓慢搅拌下添加到混合物中，保持整个过程低于20℃。除去冰水浴后，混合物在35℃下搅拌反应2小时，添加Milli-Q水(46ml)。几分钟后，进一步向混合物添加Milli-Q水(137.5ml)和2.5ml 30％H2O2溶液，导致溶液颜色迅速变为亮黄色。然后将混合物用1∶10HCl溶液(v/v，250ml)洗涤并过滤以除去残留的金属离子。将悬浮在Milli-Q水中的粗制GO以高转速(12000rpm min-1)离心。随后收集含有高度分散且稳定的GO纳米片的上清液。为了除去残留的盐和酸，通过定期更换水浴(每天2-3次)，使用透析管(截留分子量为12000-14000)进一步透析上清液至少一周。

[0066] 如上所述，在图1所示的RGO-PEI的合成期间，分散体的颜色在约60分钟的时间内从棕色逐渐变为黑色。图2a示出了具有所制备的GO纳米片之溶液的吸收池图片(左侧)和溶液的相应UV光谱(右侧)。GO的UV光谱在232nm(标记为102)和302nm(标记为104)显示两个吸收带，这对于GO是典型的。

[0067] 图2b示出了具有RGO-PEI纳米片溶液的吸收池图片(左侧)和溶液的相应UV光谱(右侧)。RGO-PEI的UV光谱在260nm处显示出一个吸收带(标记为106)。

[0068] 为了比较，图2c示出了具有由肼(N2H4)还原的RGO纳米片之溶液的吸收池图片(左侧)和溶液的相应UV光谱(右侧)。RGO-肼的UV光谱在266nm处显示出一个吸收带(标记为108)，其接近在图2b中观察到的RGO-PEI吸收带。

[0069] 通过原子力显微术(atomic force microscopy，AFM)、X射线光电子能谱法(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)、傅里叶变换红外(Fourier transform infrared，FTIR)光谱法、拉曼光谱法(Raman spectroscopy)和热重分析(thermo gravimetric analysis，TGA)系统地分析RGO-PEI复合材料。

[0070] 考虑到所获得的RGO-PEI纳米片在水中的优异分散性，可以使用AFM研究其单片性质。AFM图像的横截面图如图3a所示，图3b中为由N2H4还原的RGO，图3c中为RGO-PEI，并且图3d中为RGO-PEI/GOx复合物，其中GOx是葡萄糖氧化酶。

[0071] 图3a-3d中的尺度：在图3a和图3b中为5×5μm2，图3c中为2.5×2.5μm2，且在图3d中为1.8×1.8μm2。图3a和图3b中的GO和RGO的高度为约0.8nm。图3c中RGO-PEI纳米片的高度为2.1至2.5nm，且图3d中RGO-PEI/GOx复合物的高度约为7.6至8.3nm。

[0072] 发现单GO片的平均厚度为0.8nm，由肼还原的RGO的平均厚度为0.9nm，且RGO-PEI的平均厚度为2.1nm至2.5nm。与用肼还原的RGO相比，RGO-PEI的平均厚度提高可归因于其表面上的封端试剂PEI在还原和共价连接后代替了含氧官能团。

[0073] 图4示出了在云母上的RGO-PEI结构的AFM图像的横截面图，在图4a中分辨率为5×5μm2，且在图4b中为1×1μm2。

[0074] RGO-PEI的XPS谱如图5a-5d所示，其中图5a示出了高至1200eV的XPS谱，图5b是代表C1s的约285eV峰的特写(close-up)，图5c是代表N1s的约400eV峰的特写，且图5d是代表O1s的约532eV峰的特写。

[0075] 如图6所示，GO中的表面氧基团为约30.2％。RGO-N2H4的氧百分比降低至11.64％，这与RGO-PEI的14.44％相似。因此，RGO-PEI中的C/O比在还原反应后显著提高至与由肼制备的RGO中所观察到的水平相似的水平。

[0076] 与GO和RGO-N2H4相比，RGO-PEI的N峰出现表明PEI连接到RGO上。图5c所示的RGO-PEI的N1s XPS谱表明存在酰胺(399.1eV)和胺(400.2eV)。如所预期的，图5d所示的O1s核心水平谱可以拟合为531.5eV和532.7eV的两个峰。

[0077] 图7a示出了GO、RGO-N2H4(标记的RGO)和RGO-PEI的FTIR光谱，且图7b是列出了对GO和RGO-PEI所观察到的峰模式(以cm-1表示)的表格。在GO和RGO-PEI两者中，分别在3415cm-1和1386cm-1观察到O-H伸缩模式(stretching mode)和O-H弯曲模式(bending mode)。在纯GO中观察到O-H模式是相对强的峰，但在RGO-PEI复合材料中变得明显更弱。

[0078] 在GO中的1725cm-1处观察到羧酸和羰基中的C＝O伸缩，而在RGO-PEI中，其在N-C＝O基团的1647cm-1处被观察到。

[0079] 作为比较，RGO-N2H4的谱显示出或多或少的扁平线，其在1047cm-1处的指纹区域中具有弱峰，代表在环氧基中的C-O伸缩。在RGO-PEI中观察到的相同的峰为弱峰，而在GO中为强峰。GO中的878cm-1峰也归因于环氧基中的C-O基团。该峰在RGO-PEI和RGO-N2H4谱中不可见。仅在GO的1630cm-1处观察到石墨结构域的骨架振动。在RGO-PEI中，在1450cm-1处观察到弱C-N伸缩。

[0080] 上面结合前述图讨论的结构表征表明，PEI与RGO纳米片共价连接以形成生物相容性基质。因此，PEI基质提供生物相容性的微环境，以用于通过静电包封来容纳酶。RGO-PEI酶纳米复合材料可以在电极表面上铸成薄膜，由此酶保留其催化活性。因此，上述得到的RGO-PEI材料提供了大量的电化学活性表面以用于吸附大量酶，其可用于高度敏感和选择性的生物传感器。

[0081] 图8是包含还原型氧化石墨烯(RGO)、聚乙烯亚胺(PEI)和酶的混杂生物功能复合材料(这里称为RGO-PEI-酶混杂材料)的制备示意图。在上部的第一步中，示出了从石墨801开始的氧化石墨烯片802的初始合成。该过程可以使用如先前结合图1所述的经修改的Hummer法来进行。

[0082] 在图8下部所示的接下来的步骤中，氧化石墨烯被聚合物PEI 803同时还原并官能化，以获得RGO-PEI 805，也如结合图1所述。还原/官能化之后是在RGO-PEI基质805上加载酶806以获得RGO-PEI-酶混杂材料807。

[0083] RGO-PEI-酶混杂复合材料807可以通过在4℃下将800μl 0.05mg/ml的RGO-PEI与200μl 1mg/ml酶混合过夜得到，从而形成RGO-PEI-酶混杂复合材料。然后将混合物以
8000rpm下离心15分钟，并收集溶液的上清液以用于确定RGO-PEI基质上的酶负载能力。

[0084] 收集沉淀物，并通常用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并依次离心三次以从RGO-PEI基质中除去松散结合的酶。不同酶的固定效率可以通过UV吸收光谱，通过测量上清液中游离量的酶的吸收和之前添加的实际量的酶的吸收来间接确定。

[0085] 如图8所示，PEI在RGO-PEI材料中的GO片的平面上和在边缘处形成基质样的笼/基质804。当添加酶806时，这些PEI笼804有助于酶806的容纳，使得酶806被静电包封在PEI形成的基质804内。由此，酶806不与PEI基质804中的RGO材料802或PEI聚合物803形成任何共价键。

[0086] 图9-12示出了容纳在RGO-PEI基质中的酶的两个代表性实例的其他实验数据；葡萄糖氧化酶(GOx)和胆固醇氧化酶(ChOx)酶。葡萄糖和胆固醇是所有人细胞的两种关键成分，并且确定血液中的葡萄糖和胆固醇水平是控制和早期诊断许多危及生命的疾病(例如糖尿病和肥胖)的关键步骤。

[0087] 图9a示出了在吸附至RGO-PEI基质之前和之后的GOx的UV-Vis吸收光谱。线901和902显示在不存在RGO-PEI的情况下，离心之前(线901)和之后(第902行)之后的纯GOx的UV-Vis吸收光谱。如图所示，显然这些线或多或少彼此完全重叠，表明仅离心不会降低溶液中的酶量，因此这是一个很好的对照实验。线903、904和905示出了用三个独立样品测量的RGO-PEI/GOx在离心后的GOx的UV-Vis吸收光谱，这些互相重叠的线表明其具有良好的重复性。

[0088] 图9b示出了离心后图9a中UV-VIS光谱中所示的GOx与RGO-PEI/GOx溶液的吸收质量比，并与原始的GOx溶液进行比较，其中A和A0是277nm处溶液的吸收。可以看出，代表GOx的前两个样品901、902显示出在GOx离心之前和之后的吸收之间1∶1的比例，而对于RGO-PEI/GOx样品903、904和905观察到与GOx相比降低至60％的吸收。

[0089] 图9c是总结图9a和9b所示结果的表格。实现了质量比为约2的酶GOx的高负荷。

[0090] 图10a示出了在线1001中的ChOx的UV-Vis吸收光谱、在线1002中的离心后的RGO-PEI/ChOx谱和在线1003和1004中的离心后12小时的RGO-PEI/ChOx谱。

[0091] 图10b示出了离心后图10a中UV-VIS光谱中所示的ChOx和RGO-PEI/ChOx溶液的吸收比，并与原始ChOx溶液进行比较，其中A和A0是277nm处溶液的吸收。可以看出，代表ChOx的前两个样品1001、1002显示在ChOx离心之前和之后的吸收之间1∶1的比例，而对于RGO-PEI/ChOx样品1003和1004，观察到与ChOx相比降低至60％的吸收。

[0092] 图10c：基于图10a和10b所示结果的ChOx与RGO-PEI的质量比的数据分析列表。与GOx类似，对于ChOx也可实现质量比约为2的高负荷。

[0093] 图11a显示了在作为电化学介体的0.8mM二茂铁甲酸(Fc-COOH)存在下，在10mM PBS(pH 7.0)中用RGO(GCE/RGO/ChOx)修饰的玻璃碳电极(GCE)表面上的胆固醇电催化氧化。在所有实验中使用50mV/s的扫描速率，其中胆固醇的浓度从0mM变化到7mM，如图11a所示。

[0094] 图11b示出了基于图11a所示结果(正方形)的胆固醇生物传感器的校准图(线)。

[0095] 图12a示出了在作为电化学介体的0.8mM Fc-COOH存在下，在10mM PBS(pH 7.0)中的边缘平面石墨电极(EPG)/RGO-PEI/GOx处的葡萄糖的电催化氧化。在所有实验中使用10mV/s的扫描速率，其中葡萄糖的浓度从0mM变化到7mM，如图12a所示。

[0096] 图12b示出了在0.35V下含有0.8mM Fc-COOH的10mM PBS(pH 7.0)中连续添加葡萄糖的EPG/RGO-PEI/GOx的典型电流响应。电流响应与葡萄糖浓度的关系如图12c所示，且基于图12a所示结果(正方形)的葡萄糖生物传感器的校准图如图12d所示。

[0097] 图13a示出了使用根据本发明的混杂生物功能复合材料传感器进行的人血液样品中葡萄糖水平的测量。圆点对应于从不同浓度的标准葡萄糖溶液测量获得的数据点，且血滴对应于通过使用混杂生物功能复合材料传感器测量两种不同血液样品的葡萄糖水平而获得的数据点。

[0098] 在图13b中示出了使用本发明的混杂生物功能复合材料传感器和市售的血糖监测装置的血糖检测方法的比较。

[0099] 图14a显示了通过使用根据本发明的混杂生物功能复合材料传感器进行的从丹麦Glostrup医院获得的人血液样品中葡萄糖浓度的测量。圆点对应于从不同浓度的标准葡萄糖溶液测量获得的数据点，且血滴对应于通过使用混杂生物功能复合材料传感器测量11种不同血液样品(由丹麦Glostrup医院提供)的葡萄糖水平获得的数据点。

[0100] 在图14b中，示出了使用本发明的混杂生物功能复合材料传感器和市售的血糖监测装置的血糖检测方法的比较。

[0101] 图15示出了本发明的混杂生物功能复合材料传感器在35℃下长达30天的长期稳定性。使用生物传感器进行电流测量30天的时间，其间传感器储存在35℃下。这些条件模拟了一些国家的实际夏季条件，例如印度和中国的一些南部地区。图15中的图表示即使在非常温暖和潮湿的天气条件下，其稳定性也很高。

[0102] 化学品和材料。

[0103] 石墨片(＜20μm，合成的)、D-(+)-葡萄糖(≥99％)和葡萄糖氧化酶(GOx，来自黑曲霉(Aspergillus niger)，100,000-250,000单位/g固体)购自Sigma-Aldrich。二茂铁甲酸(≥97.0％(Fe))、聚(乙烯亚胺)溶液(50％(w/v)水溶液，Mw＝750,000)、K2HPO4和KH2PO4购自Fluka。使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为支持电解质，用K2HPO4和KH2PO4将pH值调节至7.0。所有化学品都原样使用。所有溶液用Milli-Q水(18.2MΩ)制备。

[0104] 仪器

[0105] 使用单光束分光光度计(HP8453，Hewlett Packard)记录UV-vis光谱。

[0106] 使用5500AFM系统(Agilent Technologies，Chandler，美国)在敲击模式(tapping mode)下进行原子力显微术(AFM)成像。

[0107] 通过ESCALABMKII X射线光电子能谱仪进行X射线光电子能谱(XPS)分析。

[0108] 通过Perkin Elmer Spectrum使用含有靶材料的KBr基质，以固态记录傅里叶变换红外光谱(FTIR)。

[0109] 在N2气氛中以5℃min-1的加热速率报告热重量分析(TGA，Netzsch STA 409PC)。使用CHI 760C(美国)和Autolab(Eco Chemie，荷兰)与三电极系统组合的仪器进行电化学实验。将边缘平面石墨(EPG，d＝5mm)、亮Pt丝(bright Pt wire)和饱和甘汞电极(saturated calomel electrode，SCE)分别用作工作电极、对电极和参比电极。通过Chrompack(氧＜50ppb)由纯化Ar将电解质溶液脱氧30分钟。在测量过程中，所有系统都用Ar气氛覆盖。

[0110] 通过在1.0μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3浆料(Electron Microscopy Science，PA，USA)上打磨，然后在Millipore水中超声处理来新鲜地清洗EPG。然后将RGO-PEI-酶混杂材料滴铸在电极表面上用于进一步的电化学表征。