β-谷甾醇的应用及制剂

摘要

本发明涉及农业生产技术领域，特别涉及β‑谷甾醇的应用及其制剂，尤其是涉及β‑谷甾醇在提高植物抗旱性中的应用。实验表明，β‑谷甾醇可有效延迟干旱胁迫下白三叶叶片的萎蔫，缓解由干旱引起的生长抑制，降低叶绿素的降解和过氧化伤害等，显著提高白三叶的抗旱性。并且，施用效果不受施用时间的限制，对干旱敏感型白三叶品种和耐旱型白三叶品种均具有较好的抗旱效果。另外，与ABA、SA、油菜素内酯等其它外源添加物相比，β‑谷甾醇价格便宜，生产成本低，适宜大面积推广应用。

权利要求

1.β-谷甾醇在提高植物抗旱性中的应用；所述植物为白三叶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-谷甾醇的施用方式为叶面喷施或根施。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述β-谷甾醇的根施浓度为25～100mg/L。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述β-谷甾醇的叶面喷施的浓度为10～

25mg/L。

说明书

β-谷甾醇的应用及制剂

技术领域

[0001] 本发明涉及农业生产技术领域，特别涉及β-谷甾醇的应用及其制剂。

背景技术

[0002] 随着全球极端气候频发，水资源分布不均，可利用灌溉水资源减少，干旱对全世界作物产量影响不断扩大，成为限制植物生长发育最主要的因子之一。上世纪中叶以来，我国农作物干旱受灾面积逐年增加。

[0003] 白三叶(Trifolium repens L.)为豆科(Leguminosae)车轴草属的一种多年生优良牧草，因其具有产量高、适口性好、牧草品质优良和生物固氮能力强等特点，成为世界各地栽培利用的主要豆科牧草之一，广泛应用于建植人工混播草地和改良天然草地。同时，由于白三叶匍匐生长特性强、再生速度快和叶型优美等特点，亦被应用于观赏性草坪，在城镇绿化、水土保持和生态建设等方面发挥着巨大作用。近年来，白三叶在各地栽培面积不断扩大。然而，白三叶喜冷凉湿润气候，属冷季型浅根型草种，抗旱耐热性差，植株生长需要大量的水分，加之其抗蒸腾能力弱，在亚热带和温带等广阔区域内，干旱成为限制其生产利用的主要逆境胁迫因子。因此，在白三叶栽培中，急需探寻提高白三叶抗旱性的栽培措施与方法。

[0004] 农业生产中，通过施用外源植物生长调节剂提高作物抗逆性具有操作简单、见效快和实用价值高等特点，在蔬菜、水稻和牧草等作物上已得到实际应用，而国内外通过外源添加物提高白三叶抗旱性的相关研究报道较少。研究报道显示，外源应用植物生长调节物质脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、油菜素内酯 (BR)、抗倒酯(TE)、多效唑(PP33 3)、矮壮素(CCC)等能够提高植物抗旱性。但这些激素或生长调节剂价格相对较高，且使用效果因植物物种不同而存在差异，若生产中大面积应用则会面临生产成本高等问题。因此，寻找一种新型、高效、低成本的外源添加物具有重要的实用价值。

[0005] β-谷甾醇(β-sitosterol)是植物甾醇类成分之一，属于四环三帖类化合物，其广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果、种子等中。目前β-谷甾醇以其特有的生物学特性和物理化学性质被广泛应用到医药行业中，研究显示β-谷甾醇的摄人量多少与人类慢性病的发生率有关，研究表明其具有明显降低血清胆固醇的功效，可以取代胆固醇作为脂质体膜材。但关于β-谷甾醇在植物抗旱中的作用，目前还未有研究。

发明内容

[0006] 本发明提供了β-谷甾醇在提高植物抗旱性中的应用。

[0007] 干旱胁迫又称水分亏缺胁迫或水分胁迫，通常是指由干旱、缺水引起的对植物正常生理功能的干扰。研究表明，干旱胁迫可抑制植物生长，使植物叶片发生萎蔫，同时伴随植物发生一系列的生理生化的变化，如电解质渗透率、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、CAT活性和APX活性，降低叶绿色含量。本发明研究发现，根施或叶面喷施β-谷甾醇可有效延迟干旱胁迫下白三叶叶片的萎蔫，缓解由干旱引起的白三叶生长抑制和叶绿素的降解；并显著降低电解质渗透率和丙二醛的积累，提高SOD、POD、CAT和APX等酶的活性，从而降低过氧化伤害，最终明显提高白三叶的抗旱性。因此，本发明提供了β-谷甾醇在植物抗旱中的应用。

[0008] 在本发明提供的一些具体实施例中，所述植物为白三叶。

[0009] 作为优选，所述β-谷甾醇的施用方式为叶面喷施或根施；优选地，β-谷甾醇的根施浓度为25～100mg/L；优选地，β-谷甾醇的叶面喷施的浓度为 25～50mg/L。

[0010] 在本发明提供的一些实施例中，进行叶面喷施或根施时，优选将β-谷甾醇溶于100％热乙醇溶解制成母液，再与溶剂混合后施用。在本发明提供的一个具体实施例中，将β-谷甾醇溶于100％热乙醇溶解制成0.2g/mL的母液，然后将母液与Hoagland营养液混合配制成β-谷甾醇处理溶液对白三叶进行根施处理。在本发明提供的另一具体实施例中，将β-谷甾醇溶于100％热乙醇溶解制成0.2 g/mL的母液，以1％Tween-80作为溶剂，配制成β-谷甾醇处理溶液对白三叶进行叶面喷施处理。

[0011] 本发明还提供了一种抗旱药物制剂，包括β-谷甾醇和农药学上可接受的辅料。作为优选，所述β-谷甾醇与所述农药学上可接受的辅料的重量比为0.01～0.1： 1～20。

[0012] 作为优选，所述农药学上可接受的辅料选自吐温-80、吐温-20、十二烷基苯磺酸钠、十八烷基磺琥珀酸钠、聚氧乙烯烷基酚和聚氧乙烯脂肪醇、苯乙基酚聚氧乙烯醚、烷基磺酸盐、烷基萘磺酸盐中的一种或两者以上的混合物。但本领域技术人员认可的农药学上可接受的辅料均在本发明的保护范围之内，本发明在此不作限定。

[0013] 在本发明提供的一些实施例中，农药学上可接受的辅料为吐温-80。

[0014] 本发明针对现有技术中大面积外源施用脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、油菜素内酯(BR)、抗倒酯(TE)、多效唑(PP333)、矮壮素(CCC)等外源添加物成本较高、效果因植物物种不同而存在差异等不足，开发了一种新型的提高植物抗旱性的外源添加物—β-谷甾醇。本发明以白三叶为研究对象，发现外源施用β-谷甾醇可有效延迟干旱胁迫下白三叶叶片的萎蔫，缓解由干旱引起的生长抑制，叶绿素的降解和过氧化伤害等，显著提高白三叶的抗旱性。另外，与其它外源添加物如ABA、SA、油菜素内酯等相比，价格便宜，生产成本低，适宜大面积推广应用。

具体实施方式

[0015] 本发明公开了β-谷甾醇的应用及其制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0016] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0017] 实施例1β-谷甾醇根施浓度的筛选

[0018] 试验材料：以广泛应用的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料

[0019] 材料培育：先将白三叶种子用0.1％的高锰酸钾溶液浸种10min消毒，去离子水清洗3次，按1g/m2的播量将种子播种在长20cm，宽15cm，高5cm且装满石英砂的塑料盆中，置于光照培养箱中进行发芽(温度白天/黑夜为 23/19℃；时长各为12h；相对湿度为70％；光照强度为700μmol m-2s-1)。待种子萌发7d后用Hoagland营养液继续培养幼苗至30d，选取长势一致的材料用于后续试验。

[0020] 试验设计：共设置7个β-谷甾醇浓度梯度，分别为：0mg/L(对照，直接干旱胁迫)、5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L，共计7个处理，每处理设置4次独立重复。用18％聚乙二醇6000(PEG-6000) 进行干旱胁迫处理。

[0021] 外源添加及干旱胁迫处理：将β-谷甾醇用100％热乙醇溶解(0.2g/mL)，自然冷却至室温后作为母液备用。营养液作为溶剂，用β-谷甾醇母液分别配制不同浓度的β-谷甾醇处理溶液，将材料用β-谷甾醇处理溶液预处理6天后，更换为含有18％(W/V)PEG-6000的Hoagland全营养液进行干旱胁迫处理。处理期间，每3d更换一次处理液，每次300mL。所有材料置于智能光照培养箱中，条件同材料培育。从更换为含有18％(W/V)PEG-6000的处理液时开始计时，调查白三叶叶片萎蔫症状和严重萎蔫出现的时间，结果见表,。

[0022] 表1根施不同浓度的β-谷甾醇提高白三叶抗旱性效应

[0023]

[0024] 由表1可以看出，根施25～100mg/L的β-谷甾醇时，均能显著提高白三叶抗旱性，提高白三叶抗寒性的效果较好，与对照相比，在同等干旱胁迫强度下可延迟白三叶叶片萎蔫3-5天。

[0025] 实施例2叶面喷施β-谷甾醇浓度的筛选

[0026] 试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。

[0027] 材料培育：将田园土与营养土按1:1的比例混合，并加入杀虫剂和杀菌剂混合均匀，室外放置3天后备用。采用直径为20cm、深度为25cm的盆钵种植白三叶，向盆钵中填满等量的混合土，按1g/m2的播种量播散白三叶种子，覆浅土后浇水。材料放置于温室中培育3个月，每周每盆浇250mL Hoagland 全营养液，统一进行施肥、除草、浇水和病虫害等常规管理。温室平均温度为 23℃，相对湿度65％，光照时间12h，光照强度为500μmol m-2s-1。待种子萌发7d后用Hoagland营养液继续培养幼苗至30d，选取长势一致的材料用于后续试验。

[0028] 试验设计：共设置7个β-谷甾醇浓度梯度，分别为：0mg/L(对照，直接干旱胁迫)、5mg/L、10mg/L、15mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L，共计8个处理，每处理设置4次独立重复。

[0029] 外源喷施及干旱胁迫处理：将β-谷甾醇用100％热乙醇充分溶解(0.2g/mL) 作为母液备用，用1％Tween-80作为溶剂稀释母液配制不同浓度的β-谷甾醇溶液，对照喷施不含β-谷甾醇的相应溶剂。每次上午9:00进行叶面喷施，喷施量为 150mL，连续喷施3次，每次间隔1天。喷施外源添加物期间，正常浇水，处理完毕后，所有材料停止浇水，置于温室中进行自然干旱胁迫。从自然干旱胁迫 (即停止浇水)开始计时，调查白三叶叶片萎蔫症状和严重萎蔫出现的时间。结果见表2。

[0030] 表2叶面喷施不同浓度β-谷甾醇提高白三叶抗旱性效应

[0031]

[0032] 由表2可以看出，叶面喷施10-25mg/L的β-谷甾醇时，均能显著提高白三叶抗旱性，与对照组相比，在自然干旱胁迫下白三叶严重萎蔫可推迟5-7天。

[0033] 实施例3叶面喷施β-谷甾醇对白三叶抗旱生理指标的影响

[0034] 试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料

[0035] 材料培育：同实施例2

[0036] 试验设计：根据实验例2筛选出的最佳叶片喷施浓度15mg/L为本实验喷施浓度，试验共设4个处理，每处理设置4次独立重复，分别为：①正常条件对照(CK)：叶面喷施不含β-谷甾醇的溶剂后于温室中正常培养18天作为对照；②CK+β-谷甾醇：叶面喷施15mg/L的β-谷甾醇后于温室中正常培养18天；③直接干旱胁迫：叶面喷施不含β-谷甾醇的溶剂后于温室中自然干旱18天；④干旱+β-谷甾醇：叶面喷施15mg/L的β-谷甾醇后于温室中自然干旱18天。

[0037] 干旱胁迫处理：每次喷施时于上午9:00进行叶面喷施，每个处理叶面均匀喷施100mL等量的液体，直至所有叶面挂满水珠，连续喷施三次，每次间隔1 天。处理完毕后，对照组(CK和CK+β-谷甾醇)正常浇水，干旱胁迫组(干旱和干旱+β-谷甾醇)停止浇水并放置于温室中进行自然干旱胁迫。温室条件同实施例2。

[0038] 观测指标：干旱胁迫18天时，测定反映白三叶生长状况的单株干重和相对生长量；反映叶片水分状况的相对含水量；以及反映受胁迫程度的叶绿素含量、电解质渗透率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性。结果见表3。

[0039] 表3叶面喷施β-谷甾醇(15mg/L)提高白三叶抗旱性相关生理生化指标变化[0040]

[0041] 从表3可以看出，正常条件下，喷施外源β-谷甾醇预处理后能够促进白三叶植株生长和叶绿素合成；干旱胁迫下，喷施外源β-谷甾醇预处理后能够显著缓解由干旱引起的生长抑制，减少叶绿素的降解，并通过提高多种抗氧化酶活性缓减由干旱引起的过氧化伤害，显著降低电解质渗透率和膜脂过氧化产物丙二醛的积累。这些生长和生理生化指标进一步证明了叶面喷施β-谷甾醇预处理能够有效提高白三叶的抗旱性。

[0042] 实施例4：叶面喷施β-谷甾醇施用时间对施用效果的影响

[0043] (1)试验材料：以干旱敏感型的‘拉丁诺’白三叶作为供试材料。

[0044] (2)材料培育：同实施例2

[0045] (3)试验设计及处理：根据实验例2筛选出的最佳叶片喷施浓度15mg/L为本实验喷施浓度。分别于上午9:00、上午11:00、下午14:00、傍晚17:00和夜晚 20:00进行叶面喷施处理，每处理4次独立的重复。材料干旱处理及温室条件同实施例2。从自然干旱胁迫(即停止浇水)开始计时，调查白三叶叶片萎蔫症状和严重萎蔫出现的时间。结果见表4。

[0046] 表4叶面喷施β-谷甾醇(15mg/L)不同施用时间提高白三叶抗旱性效应[0047]

[0048] 由表4可知，不同叶面喷施时间对β-谷甾醇提高白三叶抗旱性效应无明显影响。

[0049] 实施例5：叶面喷施β-谷甾醇在不同白三叶品种上的应用效果

[0050] (1)试验材料：‘拉丁诺’(干旱敏感型)和‘海法’(耐旱型)2个白三叶品种。

[0051] (2)材料培育：同实施例2。

[0052] (3)试验设计与处理：根据实验例2筛选出的最佳叶片喷施浓度15mg/L为本实验喷施浓度。于上午9:00进行叶面喷施处理，每个处理设置4次独立的重复。材料干旱处理及温室条件同实施例2。从自然干旱胁迫(即停止浇水)开始计时，调查白三叶叶片萎蔫症状和严重萎蔫出现的时间。

[0053] 表5叶面喷施β-谷甾醇(15mg/L)提高不同白三叶品种抗旱性效应

[0054]

[0055] 由表5可以看出，在相同培育和干旱胁迫条件下，未进行预处理时，‘海发’品种的抗旱性较‘拉丁诺’强；外源喷施β-谷甾醇预处理后，两个品种的抗旱性较对照组处理都明显提高。就两品种比较，外源喷施β-谷甾醇预处理对干旱敏感型的‘拉丁诺’品种的抗旱效果比‘海发’更为显著。

[0056] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。