一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法

摘要

本发明提供了一种能有效预防和治疗鱼类炎症的抗鱼类IL‑1β卵黄抗体及其制备方法，将草鱼IL‑1β重组蛋白加入含有体积百分比2～6％的司班80和质量百分比1～4％的硬脂酸铝的灭菌医药级白油中，高速剪切乳化10min以上，制成抗原蛋白含量为0.5～2mg/ml的草鱼IL‑1β免疫抗原。将制备的草鱼IL‑1β重组蛋白免疫抗原接种蛋鸡，收获高免蛋后清洗、微包膜处理、巴氏消毒和喷雾干燥，制得抗鱼类IL‑1β的抗炎卵黄抗体。本发明方法制备的卵黄抗体具有抗体活性高、特异性强，易于保存，可直接口服的特点。该卵黄抗体，可靶向性的应用于预防和治疗鱼类炎症性疾病，部分替代抗菌药物；绿色环保，推动渔业的可持续发展。

权利要求

1.抗鱼类IL-1β卵黄抗体用作饲料添加剂的用途，以饲料添加剂的方式，以2.0～4.0g/kg的剂量口服改善草鱼和泥鳅的肠道微细结构从而增加食物的吸收面积，以及提高饲料回报率；抗鱼类IL-1β卵黄抗体制备方法包括以下步骤：(1)将草鱼炎症细胞因子IL-1β重组蛋白加入含有司班80和硬脂酸铝的白油中，制成草鱼IL-1β免疫抗原；

(2)将制备的草鱼IL-1β免疫抗原免疫接种蛋鸡，然后收集免疫鸡蛋；

(3)将免疫蛋进行清洗、微包膜处理、巴氏消毒和喷雾干燥，制备抗鱼类IL-1β卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述制备方法中，以原料白油的体积计，白油中司班80的体积百分比是2～6％，以原料白油的质量计，白油中硬脂酸铝的质量百分比是1～4％。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述制备方法中，纯化的草鱼IL-1β重组蛋白中吐温80的体积百分比为4～8％。

4.根据权利要求1～3之一所述的用途，其特征在于所述制备方法中，将IL-1β重组蛋白与白油佐剂按照体积份数1:1～2的比例充分高速剪切乳化，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

5.根据权利要求1～3之一所述的用途，其特征在于所述制备方法中，制备的油包水乳剂疫苗草鱼炎症细胞因子IL-1β重组蛋白含量为0.5～2mg/ml。

6.根据权利要求1～3之一所述的用途，其特征在于所述制备方法中，将重组IL-1β油包水乳剂疫苗免疫蛋鸡两次，收集第二次免疫两周后所产的鸡蛋。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制备方法的步骤(3)中，利用其蛋黄、蛋清或包括蛋壳在内的全蛋进行制备。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述制备方法中，在鸡蛋中加入微包膜壁材，经过均质乳化和喷雾干燥对鸡蛋活性物质进行微包膜。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述制备方法中，微包膜的壁材中所述包膜剂包含变性淀粉、β-环状糊精、海藻酸钠、明胶、壳聚糖、羧丙基甲基纤维素，所述包膜剂单独或复合使用，添加量为鲜鸡蛋重量的3～10％。

说明书

一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于动物饲料添加剂及其制备方法的技术领域，具体涉及一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

[0002] 在当今集约化高密度养殖模式下，养殖鱼类极易受到细菌、病毒和寄生虫的感染，普遍造成炎症反应，产生各种疾病，引起大量死亡，对我国渔业造成巨大经济损失。与此同时，在全民关注食品安全的今天，化学药剂、抗菌素等药物为主的病害防治手段导致的耐药菌株、药物残留、环境污染等诸多问题也越来越引起人们的重视。因此，寻求符合环境友好，水产品质量安全，可持续发展战略的病害防治措施成为水产养殖业发展的主要方向。

[0003] 卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)，是鸡血清IgG转移到卵黄中形成的特异性抗体，具有类似哺乳动物IgG的免疫活性，可有效防治特定疾病。IgY具有化学性质稳定、特异性强、制备简单、成本低、绿色安全等优点，并在食品、医药、生物品等方面得到了广泛应用。

[0004] 然而，在国内外的研究报道中，极大部分是以灭活的病毒、细菌、细胞等颗粒性抗原为免疫原制的抗体，在病因不明确的情况下特异性菌株或病毒的选择成为制约性问题，呈现很大的滞后性；且致病菌容易发生变异，容易使卵黄抗体的治疗和预防效果下降，这一现象在当今畜禽水产养殖实践中尤为明显。因此寻找引起养殖动物疾病发生的内源性因子或活性物质，并以此作为抗原生产卵黄抗体或复合制剂显得更有效。

[0005] 白细胞介素-1β(IL-1β)是一种促炎细胞因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生。IL-1β在机体内是一种内原性发热源，可通过触发和加强免疫和炎症反应从而调节很多炎症反应，在细胞的增殖、分化和一些特定免疫细胞的免疫过程中起到重要的作用(Smith DE,Renshaw BR,Ketchem  RR,et  al.Four new members expand the interleukin-1 superfamily[J].J Biol Chem,2000,275(2):1169-75.)。

[0006] 发明人所属课题组前期克隆并原核表达了草鱼IL-1β(Bo YX,Song XH,Wu K,et al.Characterization of interleukin-1βas a proinflammatory cytokine in grass carp(Ctenopharyngodon idella).Fish&Shellfish Immunology,2015,46(2):584-595.)。草鱼IL-1β基因的cDNA全长为1260bp(GenBank登录号：JN705663.2)，包含一个813bp的开放阅读框，编码长度为270个氨基酸的多肽，预测的分子量为30.1kDa，氨基酸序列具有IL-1家族特征性序列，但缺乏哺乳动物中保守的典型IL-1β转换酶裂解位点。IL-1β在草鱼体内呈组成型表达，病原菌诱导可导致其表达量升高；同时，原核表达IL-1β重组蛋白的分子量为
50kDa左右。IL-1β重组活性蛋白可诱导草鱼发生肠道炎症，其多克隆抗体可部分阻断由病原菌诱导引起的肠道炎症，可见IL-1β在草鱼肠道炎症的发生过程中发挥极其重要作用；将已克隆的草鱼IL-1β氨基酸序列通过NCBI蛋白库与其他脊椎动物IL-1β氨基酸序列比较发现，不同鱼类的IL-1β功能区的氨基酸序列有很高的相似度，其中与草鱼IL-1β氨基酸相似性最高的是斑马鱼(61％)，其次是鲤鱼(59％)，虹鳟(34％)；利用软件Clustal W 1.83和MEGA 5.2，将草鱼和部分鱼类、哺乳类、禽类和两栖类动物的IL-1β相互对比制作出系统发育树，结果显示较之其他鱼类，草鱼与斑马鱼、鲤鱼以及野鲮等鲤科鱼类亲缘关系最近，鱼类区别于两栖类、禽类和哺乳类成为单独一支。制备的抗草鱼IL-1β多抗可有效的抑制草鱼细菌性肠炎。因此推测，以草鱼IL-1β重组蛋白为抗原，制备抗IL-1β的卵黄抗体，并将其作为饲料添加剂应用到其他鱼类尤其是鲤科鱼类炎症反应的预防和治疗，将会有很好的应用和推广价值。而且在饲料添加剂领域中也未见抗IL-1β卵黄抗体的报道。

发明内容

[0007] 本发明针对养殖鱼类极易受到细菌、病毒和寄生虫等的感染，造成炎症反应，产生各种疾病，从而使鱼类生长性能和饲料报酬下降的现状，提供了一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体、其制备方法以及其用途。

[0008] 本发明选用的IL-1β重组蛋白，是将草鱼IL-1β基因(GenBank登录号：JN705663.2)开放阅读框813bp的核苷酸序列组装成pET32a(+)-IL-1β质粒表达于BL21菌株中，用IPTG诱导表达所得的蛋白。所用草鱼IL-1β开放阅读框序列表见图1。草鱼IL-1β重组蛋白的制备及纯化方法如下：

[0009] 取2uL pET32a(+)-IL-1β质粒转入大肠杆菌BL21表达菌中，37℃生化培养箱培养过夜，分别挑取单菌落至100mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素钠，MESGEN，CAS：69-52-3)；次日按照1:100的接种量转接入发酵罐中(含75μg/mL氨苄青霉素钠)，接种4h，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，MESGEN，CAS：367-93-1)至终浓度0.6mmol/L，在温度为28℃的条件下诱导过夜，诱导结束后离心收集菌液，并用PBS(pH7.4)洗涤2次，去掉细菌表面培养基；然后SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。用PBS将已诱导表达草鱼IL-1β重组蛋白的BL21菌体重悬，用高压细胞破碎仪将细胞破碎两遍(北京迪索仪器有限公司，破碎压力
800bar，温度4℃)，收集高压破碎后的液体，4℃条件下12000r/min离心30min，得沉淀。将沉淀溶于6mol/L尿素(生工，CAS：57-13-6，纯度大于99％)溶液中，冰浴1h，充分溶解变性。在4℃条件下12000r/min离心30min，收集上清液。使用蛋白质高压制备色谱仪(SPOT，法国)进行纯化。最后用超滤系统(Millipore Labscale，美国)将蛋白进行脱盐处理，得到纯化的草鱼IL-1β重组蛋白。

[0010] 在此基础上，本发明进一步提供了一种能有效预防和治疗鱼类炎症的抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法，具体包括，

[0011] 本发明采用的技术方案如下：一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法，包括：

[0012] 优选地，本发明的抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法由以下步骤组成。(1)将草鱼炎症细胞因子IL-1β重组蛋白加入含有司班80和硬脂酸铝的医药级白油中，高速剪切乳化制成草鱼IL-1β免疫抗原。(2)将制备的草鱼IL-1β免疫抗原对蛋鸡进行免疫接种，然后收集鸡蛋。(3)将鸡蛋进行清洗、微包膜处理、巴氏消毒和喷雾干燥，制备抗鱼类IL-1β的抗炎卵黄抗体。

[0013] 进一步地，具体来说，本发明的能有效预防和治疗鱼类炎症的抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法包括：

[0014] 优选地，所述制备方法中，以原料白油的体积计，医药级白油中司班80(又称司盘80或span 80，为失水山梨醇脂肪酸酯)的体积百分比是2～6％，以原料白油的质量计，硬脂酸铝的质量百分比是1～4％。以及，优选地，所述制备方法中，以重组蛋白和吐温80的总体积计，纯化的草鱼IL-1β重组蛋白中吐温80的体积百分比为4～8％。

[0015] 优选地，所述制备方法中，将IL-1β重组蛋白与白油佐剂按照体积份数为1:1～2的比例充分高速剪切乳化，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

[0016] 优选地，所述制备方法中，制备的油包水乳剂草鱼IL-1β重组蛋白含量为0.5～2mg/ml。

[0017] 优选地，所述制备方法中，将重组IL-1β油包水乳剂疫苗免疫蛋鸡两次，收集第二次免疫两周后所产的鸡蛋。优选地，所述制备方法中，利用其蛋黄、蛋清或包括蛋壳在内的全蛋进行制备。

[0018] 优选地，所述制备方法中，在鸡蛋中加入微包膜壁材，经过均质乳化和喷雾干燥对鸡蛋活性物质进行微包膜。优选地，所述制备方法中，微包膜的壁材中所述包膜剂包含变性淀粉、β-环状糊精、海藻酸钠、明胶、壳聚糖、羧丙基甲基纤维素，所述包膜剂单独或复合使用，添加量为鲜鸡蛋重量的3～10％。

[0019] 优选地，所述制备方法中，微包膜包括以下7个步骤：(1)洗蛋：剔除已变质的坏蛋，将新鲜的合格鸡蛋放入洗蛋机上，用常温水清洗1～2min。(2)消毒：用常温自来水配制2.5-5×10 浓度的氯制剂，将洗净的鸡蛋消毒1～2min。(3)喷淋：将消毒过的鸡蛋用洁净的自来水喷淋1～2min，去除消毒液。(4)打蛋：用打蛋机打碎洗净的鸡蛋，将全蛋或包括碎蛋壳的蛋液放入洁净的不锈钢乳化罐中。(5)与包膜剂混合乳化：取鸡蛋鲜重量的3～10％的变性淀粉、或β-环状糊精、或海藻酸钠、或明胶、或壳聚糖、或羧丙基甲基纤维素，或为以上物质的复合物，缓缓放入40～60℃的洁净水中搅拌均质，所述洁净水重量为蛋液重量的10～
20％；继续加热至半透明，再将包膜液与蛋液充分混合，乳化5～20min。(6)巴氏消毒：将上述物料倒入巴氏消毒罐内，60℃～65℃消毒15～30min。(7)喷雾干燥：将巴氏消毒后的物料用泵吸入离心或压力喷雾干燥塔，设置进风温度为90～130℃，出风温度为60～75℃，喷雾干燥，即得到所述抗炎卵黄抗体，使所述抗炎卵黄抗体的颗粒规格≤100目，抗IL-1β抗体含量在1:6400以上。

[0020] 本发明还提供了所述抗鱼类IL-1β卵黄抗体的用途。发明人通过大量实验发现，本发明的抗鱼类IL-1β卵黄抗体可作为饲料添加剂，在饲喂鱼类后，抗体工作效力较高，以2.0～4.0g/kg的口服剂量，可靶向性的预防鱼类炎症性疾病，促进生长。

[0021] 本发明的技术优势：

[0022] (1)本发明所提供的一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体，可靶向性抑制鱼类因各种刺激(细菌等病原生物、有毒有害物质、环境因子等)引起的炎症，有效提升鱼类的免疫和抗病能力、提高饲料回报率。采用纯生物材料制备的炎症抑制剂，可部分替代化学抗菌药，绿色、环保，有利于渔业的可持续发展。

[0023] (2)本发明所提供的一种抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法，能够产生活性很高的抗IL-1β抗体，抗体效价高，产量大。和血清抗体制备方法相比，本发明的抗体产量高，且在常温下长时间的保持其抗体活性，实现了现有技术难以实现的效果。同时，本发明的制备方法简单，成本低，所制备的抗体流动性好；且充分利用了全蛋包括蛋壳中的营养成分和活性物质，所得卵黄抗体营养全面；生产全过程无废弃物产生，清洁环保。

[0024] (3)本发明所用的微包膜技术，即添加壁材、均质乳化、喷雾干燥所得的卵黄抗体，不仅保持了鸡蛋原有的风味，具有一定的诱食作用，克服了传统的口服抗体往往具有特殊口感的风味不佳的问题；微包膜卵黄抗体从口腔通过胃再进入小肠，起到缓释作用，保护了抗体及鸡蛋中其他成分的活性，克服了现有技术中其他抗体必须通过特殊方式给药的局限；与现有的卵黄抗体相比，本发明克服了抗体被胃肠道损耗的技术难题，口服抗体的效率显著提高。

[0025] (4)本发明所采用的微包膜壁材是食品级壁材，它们本身具有营养和促进动物免疫功能的作用。

[0026] (5)本发明采用微包膜并通过喷雾干燥制得的抗鱼类IL-1β卵黄抗体，抗体蛋白包裹在膜内，水分含量只有2～5％。这可有效避免与空气及其它组分直接接触而引起的各种反应，从而解决了抗体及鸡蛋中自身营养及活性物质易氧化、变质和失活的缺陷，延长了保质期。

附图说明

[0027] 图1为草鱼IL-1β基因的开放阅读框序列，开放阅读框为813个碱基序例。

[0028] 图2为抗鱼类IL-1β卵黄抗体的效价测定结果。其中第A-H列为卵黄抗体组，抗体稀释倍数依次为：1:800,1:1600,1:3200,1:6400,1:12800,1:25600，1:51200和1:102400；第I列为空白对照组；第J-L组为普通蛋粉组，稀释倍数依次为：1:80,1:40和1:20。

[0029] 图3为Western blot鉴定抗草鱼IL-1β卵黄抗体的特异性及其草鱼与泥鳅IL-1β基因的同源性。

[0030] 其中，A.只用抗草鱼IL-1β卵黄抗体处理；B.用重组草鱼IL-1β蛋白与抗草鱼IL-1β卵黄抗体预结合后处理。泳道1与3为泥鳅肠道细胞裂解液，泳道2与4为草鱼肠道细胞裂解液。①为泥鳅与草鱼IL-1β的1个剪接体；②为泥鳅与草鱼IL-1β另一个剪接体；③为泥鳅与草鱼的β-actin。)。

[0031] 图4-11为使用本发明的抗鱼类IL-1β卵黄抗体饲喂草鱼后，通过扫描电镜观察到的草鱼肠道结构，其中，图4-5为空白对照组，分别显示×100倍和×20000倍的肠道结构电镜图；图6-7为阴性对照组，分别显示×100倍和×20000倍的肠道结构电镜图；图8-9为0.15％添加组，分别显示×100倍和×20000倍的肠道结构电镜图；图10-11为0.3％添加组，分别显示×100倍和×20000倍的肠道结构电镜图。

[0032] 图12-21显示了使用本发明的抗鱼类IL-1β卵黄抗体饲喂大鳞副泥鳅后，通过扫描电镜观察到的大鳞副泥鳅的肠道微绒毛的结构，其中，图12-13为对照组，分别显示×20000倍、×30000倍的结构电镜图；图14-15为1.0g/kg添加组，分别显示×20000倍、×30000倍的结构电镜图；图16-17为2.0g/kg添加组，分别显示×20000倍、×30000倍的结构电镜图；图18-19为4.0g/kg添加组，分别显示×20000倍、×30000倍的结构电镜图；图20-21为6.0g/kg添加组，分别显示×20000倍、×30000倍的结构电镜图。

具体实施方式

[0033] 对于本发明的抗鱼类IL-1β卵黄抗体及其制备方法，以及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0034] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0035] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0036] 实施例1制备草鱼重组IL-1β免疫疫苗

[0037] (1)佐剂配制：以配制500ml佐剂为例，先在烧杯中加入一定量的进口医药级白油(Acros，比利时，CAS：8012-95-1)，加入20ml司班80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：1338-43-8)和20g硬脂酸铝(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：300-92-5)，适当搅拌，加热至无气泡，用加热过的白油(烧杯中电炉加热至无气泡为止)定容至
500ml，121℃，30min灭菌后使用。配制好的佐剂呈棕黄色，澄清通明。

[0038] (2)草鱼IL-1β重组蛋白预处理：纯化的草鱼IL-1β重组蛋白中加入4％体积的吐温80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS号：9005-65-6)，混合均匀。

[0039] (3)IL-1β疫苗配制：将上述步骤(2)所得到的草鱼IL-1β重组蛋白缓慢加入步骤(1)中配制好的疫苗佐剂中，边搅拌边加入，蛋白与佐剂体积比为1:1，疫苗蛋白浓度为2.0mg/ml，用高速乳化剪切机(众时(上海)机械有限公司，型号：ZLE-A300)混合乳化，
7000r/min，10min，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

[0040] 实施例2制备草鱼重组IL-1β免疫疫苗

[0041] (1)佐剂配制：以配制500ml佐剂为例，先在烧杯中加入一定量的进口医药级白油(Acros，比利时，CAS：8012-95-1)，加入10ml司班80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：1338-43-8)和20g硬脂酸铝(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：300-92-5)，适当搅拌，加热至无气泡，用加热过的白油(烧杯中电炉加热至无气泡为止)定容至
500ml，121℃，30min灭菌后使用。配制好的佐剂呈棕黄色，澄清通明。

[0042] (2)草鱼IL-1β重组蛋白预处理：纯化的草鱼IL-1β重组蛋白中加入8％体积的吐温80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：9005-65-6)，混合均匀。

[0043] (3)IL-1β疫苗配制：将上述步骤(2)所得到的草鱼IL-1β重组蛋白缓慢加入步骤(1)中配制好的疫苗佐剂中，边搅拌边加入，蛋白与佐剂体积比为1:2，疫苗蛋白浓度为1.0mg/ml，用高速乳化剪切机(众时(上海)机械有限公司，型号：ZLE-A300)混合乳化，
7000r/min，10min，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

[0044] 实施例3制备草鱼I L-1β免疫疫苗

[0045] (1)佐剂配制：以配制500ml佐剂为例，先在烧杯中加入一定量的进口医药级白油(Acros，比利时，CAS：8012-95-1)，加入20ml司班80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：1338-43-8)和10g硬脂酸铝(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：300-92-5)，适当搅拌，加热至无气泡，用加热过的白油(烧杯中电炉加热至无气泡为止)定容至
500ml，121℃，30min灭菌后使用。配制好的佐剂呈棕黄色，澄清通明。

[0046] (2)草鱼IL-1β重组蛋白预处理：纯化的草鱼IL-1β重组蛋白中加入6％体积的吐温80(国药集团化学试剂有限公司，化学纯CP，CAS：9005-65-6)，混合均匀。

[0047] (3)IL-1β疫苗配制：将上述步骤(2)所得到的草鱼IL-1β重组蛋白缓慢加入步骤(1)中配制好的疫苗佐剂中，边搅拌边加入，蛋白与佐剂体积比为1:1，疫苗蛋白浓度为1.0mg/ml，用高速乳化剪切机(众时(上海)机械有限公司，型号：ZLE-A300)混合乳化，
7000r/min，10min，制成油包水乳剂疫苗，用于蛋鸡的免疫接种。

[0048] 实施例4免疫产蛋鸡

[0049] 选择生物安全隔离条件好、饲养管理科学规范、鸡群健康的鸡场500羽具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋鸡(海兰蛋鸡，110日龄)作为试验鸡群，饲养管理按照海兰蛋鸡产蛋期饲养管理要求进行。用实施例1、实施例2和实施例3记载的方法配置的IL-1β疫苗免疫蛋鸡，剂量为1.0ml/羽，分颈部皮下、两胸肌部位三针进行免疫。一周以后以同样剂量和方法免疫第二次。第二次接种后从第10天开始抽检鸡蛋中抗体滴度。此后，当抗体滴度低于1:6400时按同样剂量及方法加强免疫。

[0050] 实施例5制备本发明提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体

[0051] (1)收集第二次免疫后抗体滴度达到1:6400以上的鸡蛋，剔除已变质的坏蛋，将新鲜合格的鸡蛋放入洗蛋机上，用常温水清洗2min。

[0052] (2)用2.5×10-5浓度的二氧化氯水溶液浸泡洗净的鸡蛋1分钟；再用自来水喷淋消毒过的鸡蛋2min，去除消毒液。

[0053] (3)将消毒洗净后的鸡蛋打碎，存于洁净的不锈钢容器内初步搅拌，称重待用。

[0054] (4)称取蛋液重量1％的海藻酸钠、2％β-环状糊精及3％的羧丙基甲基纤维素，加入蛋液重量12％的60℃的自来水中，加热搅拌至溶液呈半透明制得包膜液；再将包膜液缓缓加入蛋液中，边加边搅拌。

[0055] (5)将上述物料转移至乳化罐中，均质乳化10min。

[0056] (6)将均质乳化后的蛋液转移至巴氏消毒罐内，60℃消毒30min。

[0057] (7)将消毒后的物料用泵吸入离心式喷雾干燥塔，设置进风温度为100℃，出风温度为65℃，喷雾干燥，即得到所述抗鱼类IL-1β卵黄抗体。

[0058] 实施例6制备本发明提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体

[0059] (1)收集第二次免疫后抗体滴度达到1:6400以上的鸡蛋，剔除已变质的坏蛋，将新鲜合格的鸡蛋放入洗蛋机上，用常温水清洗1min。

[0060] (2)用2.5×10-5浓度的二氧化氯水溶液消毒洗净的鸡蛋1min；再用自来水喷淋消毒过的鸡蛋2min，去除消毒液。

[0061] (3)将洗净的鸡蛋打碎，存于洁净的不锈钢容器内初步搅拌，称重待用。

[0062] (4)称取蛋液重量1％壳聚糖、5％β-环状糊精，分别加入蛋液重量10％的加热至45℃的自来水中，边加边搅，继续加热至溶液呈半透明制得包膜液；再将包膜液缓缓加入蛋液中，边加边搅。

[0063] (5)将上述物料转移至乳化罐中，均质乳化30min。

[0064] (6)将均质乳化后的蛋液转移至巴氏消毒罐内，65℃消毒15min。

[0065] (7)将均质后的物料用泵吸入离心式喷雾干燥塔，设置进风温度为120℃，出风温度为70℃，喷雾干燥，即得到所述抗鱼类IL-1β卵黄抗体。

[0066] 实施例7制备本发明提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体

[0067] (1)收集第二次免疫后抗体滴度达到1:6400以上的鸡蛋，剔除已变质的坏蛋，将新鲜合格的鸡蛋放入洗蛋机上，用常温水清洗1min。

[0068] (2)用2.5×10-5浓度的二氧化氯水溶液消毒洗净的鸡蛋1min；再用自来水喷淋消毒过的鸡蛋2min，去除消毒液。

[0069] (3)将洗净的鸡蛋打碎，存于洁净的不锈钢容器内初步搅拌，称重待用。

[0070] (4)称取蛋液重量2％变性淀粉、4％明胶，加入蛋液重量18％的加热至60℃的自来水中，边加边搅，继续加热至溶液呈半透明制得包膜液；再将包膜液缓缓加入蛋液中，边加边搅。

[0071] (5)将上述物料转移至乳化罐中，均质乳化20min。

[0072] (6)将均质乳化后的蛋液转移至巴氏消毒罐内，65℃消毒25min。

[0073] (7)将均质后的物料用泵吸入离心式喷雾干燥塔，设置进风温度为130℃，出风温度为60℃，喷雾干燥，即得到所述抗鱼类IL-1β卵黄抗体。

[0074] 实施例8抗体滴度检测(间接ELISA法)

[0075] 以纯化的草鱼IL-1β重组蛋白(实施例1～3中步骤(2)所述预处理得到的包含吐温80的纯化重组蛋白)为抗原，以无特异性IgY的普通蛋粉(同一养鸡场同期所产普通鸡蛋，制备方法同实施例5～7所得)为阴性对照，用间接ELISA法测定所制备的抗鱼类IL-1β卵黄抗体的效价：将纯化的草鱼IL-1β重组蛋白用包被液稀释至10μg/ml，按100μl/孔加到酶标反应板内，4℃包被过夜。将包被好的酶标板甩去孔内液体，加TBS洗涤液300μl/孔，重复洗涤2次，并在吸水纸上拍干。加入含体积百分比5％小牛血清的TBS，300μl/孔，37℃温育1.5h。
TBS重复洗涤2次，拍干，加入实施例3得到的抗IL-1β卵黄抗体(用PBS将卵黄抗体按1:800、
1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400比例稀释)，100μl/孔，37℃温育2h。用T-TBS洗板5次，拍干后用TBS洗涤2次，拍干。加入羊抗鸡辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体100μl/孔(购自Sigma公司)，37℃温育1.5h。用T-TBS洗板5次，拍干后用TBS洗涤2次，拍干。每孔加入邻苯二胺显色底物(OPD，购自北京百灵威科技有限公司)100ul，避光反应3～5min(根据阳性对照进行判定)，加入2M H2SO4终止液100ul。用酶标仪(美国，Bio-Tek)测定492nm处样品OD值。每个样品8个平行，取平均值。判定标准：OD值大于阴性对照平均值2.1倍的最高稀释度为其效价。结果见表1和图2，阴性对照稀释倍数在1:40以上时的OD值为空白对照的2.1倍以上，抗IL-1β卵黄抗体的稀释倍数为1:6400以上时的OD值是阴性对照的
2.1倍以上。说明抗鱼类IL-1β卵黄抗体可以与纯化的草鱼IL-1β重组蛋白特异性结合，并抗体结合效价为1:6400，而普通鸡蛋粉抗体效价几乎为零，这种程度差异达到了极为显著的程度，显示了抗体的特异性和高效性。因此，通过本方法制备的抗鱼类IL-1β卵黄抗体有很高的抗体活性。

[0076] 表1抗鱼类IL-1β卵黄抗体的效价测定结果

[0077]

[0078] 实施例9抗体特异性评估

[0079] 采用Western blotting方法，使用本发明所提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体为一抗，进行草鱼、泥鳅免疫组织中天然IL-1β的识别检测，评估抗鱼类IL-1β卵黄抗体的特异性。具体方法：首先分别将泥鳅与草鱼的肠道组织剪碎、消化、过滤；再用40％的Percoll分离液(Solarbio，密度1.131)分离泥鳅与草鱼的肠道淋巴细胞。每个样本约取1010数量级的细胞，加入10μlPBS悬浮，再加入等体积2×SDS上样缓冲液，沸水煮15min，12000r/min离心15min，每孔上样30μl，进行SDS-PAGE凝胶电泳，待溴酚蓝迁移至凝胶下端1cm左右时停止电泳，剥离凝胶。然后按以下步骤操作：(1)根据凝胶大小，裁剪NC膜及6张滤纸，置于转膜缓冲液中浸泡5min。(2)将凝胶用ddH2O冲洗数秒后，放入转膜缓冲液中。(3)在电极板上放上海绵垫，从阴极到阳极依次叠放滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，同时用玻璃棒赶尽各层之间的气泡。(4)安装转移装置，接通电源，110mA，冰水浴中转移约4h。(5)取下NC膜，观察转膜效率，PBST洗涤3次。(6)封闭：将膜放入2％Casein封闭液(干酪素，BBI，CAS：9000-71-9)中，4℃封闭2h。(7)洗涤：取出NC膜，用PBST洗涤2次，每次3min。(8)孵一抗过夜(4℃轻摇)：抗鱼类IL-1β卵黄抗体为一抗，另用过量重组的草鱼IL-1β蛋白预结合的抗鱼类IL-1β卵黄抗体液作为对照，以鼠抗β-actin抗体(购自ABclonal)检测各组细胞上样量；(9)洗涤：取出NC膜，分别用PBST漂洗2次，每次3min。(10)孵二抗：用PBS稀释HRP标记二抗(1:500，购自Sigma公司)，放入NC膜，室温平缓摇动孵育1h。(11)洗涤：PBST洗膜2次，每次3min。(12)显色：将洗涤后的NC膜在滤纸上吸干表面多余液体，放入DAB显色液(购自上海碧云天生物技术有限公司)中。待出现褐色条带，且条带颜色不再加深时立即取出膜，用清水漂洗。用滤纸吸干膜上残留水分，扫描记录，分析抗鱼类IL-1β卵黄抗体的特异性，以及草鱼与泥鳅IL-1β基因的同源性。结果见图3，图3显示，从各条泳道内参基因β-actin(约49kDa)的表达量反应，各泳道的上样量基本一致。以重组草鱼IL-1β蛋白为抗原，制备的抗鱼类IL-1β卵黄抗体蛋白液作为一抗时，分别在泥鳅、草鱼的肠淋巴细胞液泳道的～34kDa、～30kDa处出现特异性的条带，即分别为泥鳅和草鱼的IL-1β，这与预测的草鱼IL-1β的大小一致，但泥鳅IL-1β的分子量略大于草鱼；同时还出现了～20kDa的IL-1β另外一个剪切体。证明了抗体的特异性强，同时，也说草鱼与泥鳅IL-1β基因的同源性很高。用过量重组草鱼IL-1β蛋白预结合卵黄抗体后再孵育抗原，特异性条带已消失，进一步证明了本发明所制备的抗鱼类IL-1β抗体的特异性。

[0080] 实施例10用本发明所提供的抗鱼类I L-1β卵黄抗体进行草鱼养殖试验[0081] 在苏州大学水产养殖实验室使用本发明所提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体进行草鱼养殖试验。草鱼购自苏州市某养殖场，为当年池塘养殖鱼种，经一周驯养适应环境后，选取大小均匀、体格健壮，约37.8±0.2g的鱼种，随机分配到12个70cm×80cm×100cm的玻璃钢水族箱中，每箱20尾，随机分组。试验分组：试验在草鱼基础饲料中添加质量比1.5g/kg、3.0g/kg的抗IL-1β卵黄抗体，以普通鸡蛋粉3.0g/kg作为阴性对照组，以草鱼基础饲料为空白对照组，每个处理组设3个重复。养殖期间水质条件为：水温25±2℃，DO>5.0mg/L，pH 7.5±0.2，NH4+-N(0.25±0.05)mg/L，NO2--N(0.04±0.01)mg/L，硫化物<0.05mg/L，各项指标均符合养殖水体要求。正式试验自2015年9月2日至2015年11月2日，共进行8周。

[0082] 抗鱼类IL-1β卵黄抗体对草鱼生长性能的影响见表2，结果显示：与对照组相比，添加普通蛋粉和抗鱼类IL-1β卵黄抗体均可提高草鱼的增重率及肥满度；但阴性对照组与空白对照组相比无显著性差异；而添加抗鱼类IL-1β卵黄抗体后，草鱼的增重率提高了10.6％～17.1％，饲料系数降低了6.9％～13.4％，肥满度提高了8.30％～18.1％；其中，当抗鱼类IL-1β卵黄抗体添加量达到饲料质量百分比0.3％时，增重率、肥满度增幅及饲料系数降幅达到显著水平(p＜0.05)。结果表明，在饲料中添加抗鱼类IL-1β卵黄抗体能达到促进草鱼生长的目的，且其促生长程度达到了极为显著的程度。

[0083] 表2抗鱼类IL-1β卵黄抗体对草鱼生长性能的影响

[0084]

[0085] 注：同列数字肩标字母不同表示差异显著，下同。

[0086] 生长试验结束后考查了抗鱼类IL-1β卵黄抗体对草鱼抗细菌性炎症能力的影响，三组草鱼进行嗜水气单胞菌攻毒试验，攻毒量为嗜水气单胞菌粗提取液108cfu/ml(0.1ml/尾)背脊基本肌肉注射。攻毒后将草鱼分别饲养于30×30×100cm3塑料水箱中，每箱10尾，设3个平行，24h充氧，随时观察并记录结果，试验时间7d，并记录死亡情况。试验期间pH7.5±0.2，水温28±1℃，DO≥7.0mg/L。计算公式：死亡率(％)＝(死亡只数/试验总只数)×100％，免疫保护率＝(对照组死亡率－试验组死亡率)/对照组死亡率×100％。攻毒试验结果见表3，表3显示，对照组7d累计死亡率达到73.3％。投喂普通蛋粉可稍微提高草鱼免疫保护率，但与空白对照组相比并无显著性差异；投喂1.5g/kg和3.0g/kg抗鱼类IL-1β卵黄抗体组的死亡率分别是50.0％和36.7％，与空白对照组呈显著差异(p<0.05)；3.0g/kg添加组草鱼免疫保护率最高，为49.9％。攻毒后草鱼的炎症症状与死亡基本集中在前4d，4d后草鱼逐渐恢复健康。因此，抗鱼类IL-1β卵黄抗体能增强草鱼对嗜水气单胞菌炎性反应的抵抗能力，减少死亡，增强效果非常显著。

[0087] 表3抗鱼类IL-1β卵黄抗体对草鱼抗细菌性炎症能力的影响

[0088]

[0089] 试验同时考察了抗鱼类IL-1β卵黄抗体对草鱼肠道结构的影响，肠道扫描电镜(日立S-4700型冷场发射扫描电镜，日本)结果如图4-11。图4-11显示，放大100倍时发现，空白对照组(图4)及阴性对照组(图6)的草鱼肚肠道皱褶较粗且稀疏，随着抗鱼类IL-1β卵黄抗体添加量的增加，草鱼肠道黏膜皱褶变得越来越紧密(图8与图10)，说明表面积更大；相应的，放大20000倍时添加卵黄抗体组的草鱼肠道微绒毛排列整齐(图9与图11)，明显增长增密，粘液明显减少。说明了抗鱼类IL-1β卵黄抗体的添加能改善草鱼的肠道微细结构，增加食物的吸收面积，且其改善程度达到了显著的程度。

[0090] 实施例11用本发明所提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体进行大鳞副泥鳅养殖试验[0091] 在苏州大学水产养殖实验室使用本发明所提供的抗鱼类IL-1β卵黄抗体进行大鳞副泥鳅养殖试验。试验分组：试验在大鳞副泥鳅基础饲料中添加1.0、2.0、4.0和6.0g/kg抗IL-1β卵黄抗体，以普通鸡蛋粉6.0g/kg作为对照组，每个处理组设3个重复。大鳞副泥鳅购自如东贝德福泥鳅水产养殖场泥鳅繁育基地，为当年池塘养殖鱼种。经一周驯养后，挑选外观正常、大小均一、健康活泼的个体作为试验鱼，试验鱼的平均体重为9.8±0.5g。随机分配到15个30×30×100cm3的塑料水箱中，每箱20尾。各试验组按完全随机化配置法分布以避免地理位置的差异造成的试验误差。养殖期间水质条件为：水温25±2℃，DO>5.0mg/L，pH 7.5±0.2，NH4+-N(0.25±0.05)mg/L，NO2--N(0.04±0.01)mg/L，硫化物<0.05mg/L，各项指标均符合养殖水体要求。正式试验自2016年8月20日至2016年10月15日，共进行8周。养殖效果见表4，结果显示：与对照组相比，添加抗鱼类IL-1β卵黄抗体对大鳞副泥鳅的增重率、饲料系数及特定生长率均有不同程度的影响。其中，增重率由高到低顺序依次是4.0g/kg添加组＞2.0g/kg添加组＞6.0g/kg添加组＞1.0g/kg添加组＞对照组，2.0g/kg添加组、4.0g/kg添加组和6.0g/kg添加组均显著高于对照组(P＜0.05)，提高了62.0％～101.8％；饲料系数由低到高的顺序依次是2.0g/kg添加组＝4.0g/kg添加组＜6.0g/kg添加组＜1.0g/kg添加组＜对照组，且各添加组均显著低于对照组(p<0.05)；特定生长率由高到低的顺序依次为
4.0g/kg添加组＞2.0g/kg添加组＞6.0g/kg添加组＞1.0g/kg添加组＞对照组，2.0g/kg添加组、4.0g/kg添加组和6.0g/kg添加组均显著高于对照组(p<0.05)，提高了53.6％～
89.3％。上述结果表明，在饲料中添加抗鱼类IL-1β卵黄抗体能降低饲料系数，提高增重率和特定生长率的目的，其适宜添加量是2.0～4.0g/kg饲料。

[0092] 表4抗鱼类IL-1β卵黄抗体对大鳞副泥鳅生长性能的影响

[0093]

[0094] 试验结束后考查了抗鱼类IL-1β卵黄抗体对大鳞副泥鳅抗细菌性炎症能力的影响，五组大鳞副泥鳅进行嗜水气单胞菌攻毒试验，每缸10尾鱼，攻毒量为嗜水气单胞菌粗提8
取液10 cfu/ml(0.1ml/尾)背脊基部肌肉注射。用加热设备时水温保持28℃，连续观察7d，并记录死亡情况，计算公式：死亡率(％)＝(死亡只数/试验总只数)×100％，免疫保护率＝(对照组死亡率－试验组死亡率)/对照组死亡率×100％。结果见表5。表5显示，对照组7d累计死亡率达到100％。投喂1.0、2.0、4.0和6.0mg/kg抗体处理组的死亡率在53.3％～
66.7％，与对照组呈显著性差异(p<0.05)；2g/kg抗体组大鳞副泥鳅保护率最高，为46.7％，炎症症状与死亡基本集中在3d前，3d后实验鱼逐渐恢复健康，因此，抗鱼类IL-1β卵黄抗体能增强大鳞副泥鳅对嗜水气单胞菌炎性反应的抵抗能力，减少死亡，且其增强程度达到了很显著的程度。

[0095] 表5不同水平抗鱼类IL-1β卵黄抗体对大鳞副泥鳅抗细菌性炎症能力的影响[0096]

[0097] 养殖试验结束后对大鳞副泥鳅的肠道进行了扫描电镜观察(日立S-4700型冷场发射扫描电镜，日本)，结果见表6和图12-21。表6与图12-21显示，添加抗鱼类IL-1β卵黄抗体后，大鳞副泥鳅肠道微绒毛明显增长增密，粘液明显减少，且2.0mg/kg和4.0mg/kg添加组较其他实验组肠道微绒毛结构更好。

[0098] 表6抗炎卵黄抗体对大鳞副泥鳅肠道皱襞高度，宽度和肌层厚度的影响[0099]

[0100]