可用于临床检测的黄嘌呤氧化酶、其编码基因及其应用

摘要

本发明涉及一种黄嘌呤氧化酶基因，其序列为SEQ ID NO:1或其同义突变体；还涉及一种高GC含量的黄嘌呤氧化酶表达载体；还涉及上述黄嘌呤氧化酶基因编码的黄嘌呤氧化酶及其应用；还涉及一种氧化次黄嘌呤和黄嘌呤的方法。

权利要求

1.一种表达黄嘌呤氧化酶的重组菌株，其特征在于，通过将包含黄嘌呤氧化酶表达框的表达载体转化至表达宿主中得到,所述黄嘌呤氧化酶表达框由启动子和连接于所述启动子下游的黄嘌呤氧化酶基因组成，所述黄嘌呤氧化酶基因的序列为SEQ ID NO:1或其同义突变体，所述表达宿主为重组工程菌pAW340。

2.一种黄嘌呤氧化酶，其特征在于，由权利要求1所述的表达黄嘌呤氧化酶的重组菌株表达得到。

3.权利要求2所述的黄嘌呤氧化酶在制备用于检测黄嘌呤和/或次黄嘌呤浓度的试剂中的应用。

4.一种氧化溶液中黄嘌呤和/或次黄嘌呤的方法，其特征在于，包括向所述溶液中添加权利要求2所述的黄嘌呤氧化酶的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述溶液的温度为25-55℃，所述溶液的pH为6.0-9.0。

6.根据权利要求4或5中所述的方法，其特征在于，所述溶液中不含金属离子，或者含有Mg2+、Ca2+、Mo6+、Co2+或Mn2+。

说明书

可用于临床检测的黄嘌呤氧化酶、其编码基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种黄嘌呤氧化酶基因、其编码的黄嘌呤氧化酶及其应用，黄嘌呤氧化酶基因表达载体及表达菌株，以及一种氧化次黄嘌呤和黄嘌呤的方法。

背景技术

[0002] 黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，简称XOD，EC 1.1.3.22)广泛存在于各种生物体的组织和细胞中，是一类胞质复合酶，是生物有机体嘌呤代谢的关键酶，属钼酶家族。在O2存在下，XOD以分子氧为直接电子受体，无需辅酶就能催化氧化反应。XOD参与细胞几乎所有生物化学过程，核苷酸在体内可先降解为核苷和磷酸，核苷在核苷酶的作用下分解为嘌呤碱基、嘧啶碱基和核糖。XOD催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化生成尿酸并随后代谢成尿素的反应式如下：

[0003]

[0004] 反应式中(1)表示黄嘌呤氧化酶，(2)表示尿酸氧化酶，(3)表示尿囊素酶，(4)表示尿囊酸酶

[0005] 代谢过程中，还产生超氧化物或氧自由基等具有重要生理功能的物质，其与缺血性再灌注损伤、高尿酸血症、痛风风湿性、肝炎、关节炎等疾病密切相关而倍受注目。

[0006] 目前，XOD已经被开发成为商业用酶且具有较高附加值，在临床上可用于制备免疫抗体、肿瘤抑制剂及用于疾病的检测诊断试剂，主要用于黄嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷(肌苷)的检测，及辅助检测鸟嘌呤和鸟苷，也应用于测定5’-核苷磷酸化酶的活性，适用于肝胆肿瘤检测。同时XOD还被广泛应用于血清无机磷的水平(高磷血症)和超氧化物歧化酶SOD活力的检测上。因而，因此对黄嘌呤氧化酶XOD的开发和研究，具有重要理论意义和广阔的应用前景。

[0007] 此外，鱼体内的次黄嘌呤的含量随着他它的腐烂度增加而增加，所以通过测定其体内次黄嘌呤的变化，可以确定鱼的新鲜度。黄嘌呤氧化酶还可用于降解类胡萝卜素制备烟用香料。

[0008] 目前国内外所使用的黄嘌呤氧化酶，主要是从牛奶中获取。由于其来源较为单一，生产成本较高，而且黄嘌呤氧化酶的含量和质量受不同地域、不同种类奶牛的影响，在应用上对其限制很大。

[0009] 因此，需要一种新的黄嘌呤氧化酶基因和表达系统。

发明内容

[0010] 为解决以上问题，本发明提供了一种黄嘌呤氧化酶基因，其序列为SEQ ID NO:1或其同义突变体。

[0011] 本发明还提供了一种黄嘌呤氧化酶的表达载体，其包含黄嘌呤氧化酶表达框，所述黄嘌呤氧化酶表达框由启动子和连接于所述启动子下游的黄嘌呤氧化酶基因组成，所述黄嘌呤氧化酶基因的序列为SEQ ID NO:1或其同义突变体。

[0012] 在一个优选实施方案中，所述启动子为可诱导型启动子。

[0013] 本发明还提供了一种表达黄嘌呤氧化酶的重组菌株，其通过将上述黄嘌呤氧化酶基因的表达载体转化至表达宿主中得到。

[0014] 本发明还提供了一种黄嘌呤氧化酶，其由上述黄嘌呤氧化酶基因编码。

[0015] 本发明还提供了上述黄嘌呤氧化酶在制备用于检测次黄嘌呤和/或黄嘌呤浓度的试剂中的应用。

[0016] 本发明还提供了一种氧化溶液中次黄嘌呤和/或黄嘌呤的方法，其包括向所述溶液中添加上述黄嘌呤氧化酶的步骤。

[0017] 在一个优选地实施方案中，所述溶液的pH为6.0-9.0。

[0018] 在另一个优选地实施方案中，所述溶液的温度为25-55℃。

[0019] 在另一个优选地实施方案中，所述溶液中不含金属离子，或者含有Mg2+、Ca2+、Mo6+、Co2+或Mn2+。

附图说明

[0020] 图1为提取的YF06基因组的电泳图；

[0021] 图2为以YF06基因组为模板，用引物1和2进行PCR扩增得到的PCR 产物的电泳图；

[0022] 图3为EcoRⅠ和HindⅢ双酶切检测重组质粒pGEMT-xodAB-His的电泳图；

[0023] 图4为EcoRⅠ和HindⅢ双酶切检测重组质粒pVLT33-xodAB-His的电泳图；

[0024] 图5为XOD纯化图，显示蛋白洗脱峰时间；

[0025] 图6为pAW340[pVLT33]和pAW340[pVLT33-xodAB-His]的粗酶液，纯化收集的7、8、9号蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道1,2,3是纯化后收集的浓度较高的7、8、9号蛋白；泳道4是纯化前的粗酶液；泳道5是对照 pAW340[pVLT33]；M是蛋白分子marker；

[0026] 图7为用BSA制作的浓度标准曲线图；

[0027] 图8为pH-XOD活力曲线；

[0028] 图9为在不同pH保持16h后的XOD的酶活曲线；

[0029] 图10为在温度-XOD活力曲线；

[0030] 图11为在不同温度下保持30min后的XOD的酶活曲线；

[0031] 图12为XOD催化黄嘌呤氧化的酶促反应动力学双倒数作图。

具体实施方式

[0032] 以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

[0033] 1.产XOD菌株的筛选

[0034] 采集多地不同啤酒生产企业的污水处理池活性污泥，充分混匀，分别取少量样品于放于洗净灭菌的三角烧瓶中，加入适量的无菌水，在摇床上震荡培养2天，让土样中的菌体充分释放，离心取上清，得到含有土样中的微生物的母液。

[0035] 取1mL母液加入至50mL选择培养基中，于30℃下振荡(180r/min) 培养7天；然后连续传代培养4次，取200μL培养液梯度稀释后，涂布选择培养基平板，于30℃培养7天；待单菌落长出，挑取单菌落至固体无机盐选择培养基中，于30℃恒温培养，挑选水解圈较大的菌落，在筛选过程中得到一株节杆菌属菌株YF06，做进一步鉴定。

[0036] 2.从YF06中提取XOD

[0037] 1)将YF06接种于已经灭菌的1/4营养培养基中培养，170r/min，30℃，培养24h；

[0038] 2)向四瓶分别装有100mL的1/4营养培养基中分别添加1mL培养物，培养48h后，测其OD600值为0.6-0.8，加入黄嘌呤诱导24h；

[0039] 3)将上述400mL培养物于8000r/min离心10min，弃上清，得沉淀，将沉淀用15mL 50mM的Tris-HCl(pH 7.5)悬浮，在0℃条件下，以超声功率400w，超声频率2s间隔2s进行超声波细胞破碎，全程时间为25min。破碎完成后，于0℃、12000rpm下离心15min离心，除去细胞碎片，即得细胞破碎液上清；

[0040] 4)将所得上清于0℃下缓慢加入硫酸铵固体至饱和度为45％，边加入边搅拌，盐析过夜，8000rpm离心15min，去上清，向沉淀中加入最小体积酶缓冲液Tris-HCI缓冲液(50mM，pH 7.5)将其完全溶解，经测定，所得的溶液具有XOD酶活性，可见菌株YF06的基因组中可能具有XOD酶编码基因。

[0041] 3.从菌株YFO6分离XOD酶编码基因

[0042] 用Premega基因组提取试剂盒提取YF06基因组，取少量DNA进行凝胶电泳检测。结果如图1所示，所提取的基因组较为完整。对于单一型的同种 DNA样品来说，核酸染料的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比，由图可得提取的DNA亮度约为Marker的3倍，由加入的Marker的量，即可推算出DNA 的浓度。利用微量紫外分光光度计，测定DNA浓度5ug/ml,DNA OD260/OD280的比值约为1.71，证明其纯度较好。

[0043] 下载NCBI GenBank数据库中XOD大小亚基基因序列，用clustalw2进行多序列比对后在XOD基因的上游及下游保守区利用Primer5.0软件设计能扩增XOD的引物。引物对序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。

[0044] 引物1：5’-GAATTCCATG TGGCCCGCGCTGACCGTCACC-3’(SEQ ID NO:2)；

[0045] 引物2：5’-AAGCTTTCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GCCCATCGGGCCCACGGTGT-3’ (SEQ ID NO:3)。

[0046] 以YF06为模板，使用引物1和2进行PCR扩增，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，可以看到在5000下方有一条明显的条带，与预期目的基因大小相符，测序后得知其序列如SEQ ID NO:1所示，为扩增产物XOD编码基因xodAB，从该序列可看到，其中的GC含量达到75％以上。

[0047] 4.构建重组表达质粒pVLT33-xodAB-His

[0048] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，将产物加A。加尾产物连接到 pGEMT-easy载体，转入DH5α，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养12h，随机挑选转化子接种于3mL液体LB培养基中，37℃，12h后用碱裂解法提取质粒，进行酶切鉴定转化子。结果如图3所示，pGEMT-easy 载体大小为2867bp，xodAB基因大小为3597bp，可以看到酶切抽提的质粒后有两个条带，与载体pGEMT-easy和基因xodAB大小相吻合，因此，xodAB 成功克隆到了pGEM-T载体上。送上海生工测序，将正确的重组质粒命名为 pGEMT-xodAB。

[0049] 将鉴定正确的转化子涂平板，挑取单菌落接于LB(含氨苄青霉素)37℃培养12h，用试剂盒抽提质粒，双酶切后凝胶电泳回收xodAB基因片段。将回收的目的基因连接到EcoRI/HindIII双酶切回收的pVLT33载体上，并转化于大肠杆菌DH5α，涂布于固体LB(卡那霉素50μg/ml)平板，37℃，培养12h后随机挑选单菌落接于5mL液体LB(卡那霉素，37℃，12h后用煮沸法抽质粒，用EcoRI、HindIII双切鉴定转化子。结果如图4所示，pVLT33 载体大小为9.7kb，XOD基因xodAB大小为3597bp，由图可以看到酶切抽提的质粒后有两个条带，与载体pVLT33和基因xodAB大小相吻合，因此，xodAB 成功克隆到了pVLT33载体上。

[0050] 5.表达菌株的构建

[0051] 将鉴定正确的转化子涂平板，挑取单菌落用煮沸法提取质粒，将重组质粒转入pAW340，即得到表达菌株。

[0052] 诱导后的菌液离心，超声破碎，4℃，12000rpm离心15min,除去细胞碎片，即得细胞粗酶液。取细胞粗酶液测定酶活性，测得工程菌酶摇瓶发酵产量为1.52U/mL。可见所得的重工程菌株能有活性的XOD。

[0053] 6.黄嘌呤氧化酶的纯化

[0054] 将诱导表达的重组工程菌pAW340[pVLT33-xodAB-His]粗酶液加入咪唑 (0.005M)和NaCl(0.5M)过滤，用His Trap镍柱纯化蛋白。在纯化酶的收集过程中从溶液B的体积增加开始收集，每1mL收集一管。纯化如图5 所示，由图可以看出，5号到10号是出峰时间段，无杂峰出现。分别取 pAW340[pVLT33]和pAW340[pVLT33-xodAB-His]的粗酶液，以及纯化收集的7、 8、9号蛋白20μL，加入5×上样缓冲液沸水煮10min后离心，取上清进行 SDS-PAGE凝胶检测，结果如图6所示,泳道1,2,3是纯化后收集的浓度较高的7、8、9号蛋白；泳道4是纯化前的粗酶液；泳道5是对照pAW340[pVLT33]； M是蛋白分子量marker。

[0055] 收集后测定每管的活力，选择活力较高的7、8、9号用超滤离心管7000 rpm离心3min。纯化后的酶液分两管保存。

[0056] 用BSA标准液在不同浓度下测定595nm处的吸光度，绘制标准曲线，如图7所示，BSA标准品的浓度在10-50μg/mL的范围内与A595成较好的线性关系，标准曲线方程为y＝0.012x2
+0.008，R ＝0.993，可用于蛋白浓度计算。根据标准曲线计算纯化后的pAW340[pVLT33-xodAB-His]的蛋白样品浓度为 26μg/mL。

[0057] 7.XOD酶活性的测定

[0058] 黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化1mol黄嘌呤，将消耗1mol分子氧和水，产生1mol尿酸和1mol H2O2。尿酸在293nm 处有最大吸收峰。可通过检测溶液在293nm处的吸光度来测定尿酸浓度，从而通过浓度变化确定XOD酶活性。

[0059] 将纯酶液加入含有黄嘌呤的溶液中，用紫外分光光度计在293nm吸收处进行测量。每隔30s进行一次检测，根据反应产物尿酸的紫外吸收情况来确定黄嘌呤氧化酶的活力。

[0060] 1U酶活力定义为在一分钟内产生1μmol尿酸所需的酶量为1U。酶活性测定实验采用产品说明书上的测定酶活方法，具体使用试剂及步骤如下：

[0061] A.Tris-HCl buffer,pH 7.5               ：0.1M

[0062] B.Sodium hydroxide solution            ：0.0025M

[0063] C.Xanthine solution                    ：10mM

[0064] D.Oxonic acid potassium salt solution     ：1mM

[0065] E.Enzyme diluent                 ：50mM Tris-HCl buffer,pH7.5[0066] 向紫外石英杯中加入2.24ml溶液A，80μL溶液C，80μL溶液D，轻轻吹匀，于37℃温浴45min，向混合液中加入粗酶液，于紫外分光光度计中，测其在293nm处吸光度的变化值，每
30秒记录一次OD293变化，记录数据。

[0067] 根据日本“TOYOBO ENZYMES”文献中提供的酶活性的计算公式：

[0068]

[0069] Volume activity(U/ml)＝ΔOD/min×2.0×df

[0070] Weight activity(U/mg)＝(U/ml)×1/C

[0071] 其中，各符号或数字的含义如下：Vt为总体积(2.5ml)；Vs为样品体积(0.1ml)；12.5为检测条件下每毫摩尔尿酸的吸光系数(cm2/μM；1.0为光路长度(cm)；df为稀释倍数；
C为溶解酶浓度(mg/ml)。

[0072] 1)pH对XOD酶活力和稳定性的影响

[0073] 用不同pH(pH 4.0-10.0)的缓冲液配制酶检测液，按上述方法测定酶活力，确定XOD最适反应pH值。将酶液用不同pH(pH4.0-11.0)的缓冲液稀释， 25℃保温15h后，测定残余酶活力。以在最适pH下XOD的酶活性，制作pH 与酶活力的曲线，考察XOD的pH稳定性。

[0074] 37℃下，分别在pH4.0-10.0的缓冲液中测定XOD的活力，结果如图8 所示，pH4.0时酶活性为0，随着pH的增加，黄嘌呤氧化酶活性逐渐增加，在pH8.0时达到最大值。随后开始降低，pH10.0时活性消失。因此，酶在 pH 6-9之间具有活力，并且酶的最适反应pH值为8.0。

[0075] 在不同pH缓冲液中加入酶液，于25℃保温16h后，测定残余酶活力，结果如图9所示，黄嘌呤氧化酶在pH4.0-5.0时没有活性，随后随着pH的上升酶活力增加，pH8.0时酶达到最大值，由此可知道黄嘌呤氧化酶在pH8.0 的Tris-HCl缓冲液中稳定性最好。

[0076] 2)温度对XOD酶活力和稳定性的影响

[0077] 在pH 7.5缓冲液中，按照上述方法测定不同温度下酶活力，确定XOD 最适反应温度。酶液在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和70℃下各保温30min，迅速冷却至室温，测定残余酶活力，制作温度-酶活性曲线，结果如图10所示，30-50℃，60-80℃之间，酶活性变化不明显，在55℃时活性达到最高。

[0078] 将酶液在不同温度下保温30min后测定酶活性变化情况，研究XOD的热稳定性。结果如图11所示，温度对黄嘌呤氧化酶稳定性有较大影响。在 30-50℃下处理30min，酶活性基本没有丧失，60℃处理30min后酶基本丧失活力。

[0079] 3)XOD的动力学常数测定

[0080] 分别以0.08、0.16、0.2、0.32、0.4mM等不同浓度的黄嘌呤底物对XOD 酶活进行测定，观察底物对酶促反应速度的影响。根据Lineweaver-Burk(双倒数作图法)如图12，线性方程为(1/V)＝0.5091×(1/S)+7.6272，相关系数R2为0.9958，求得黄嘌呤氧化酶的米氏常数Km＝0.06675mM，最大反应速度为Vmax＝0.1303mM﹒min。

[0081] 4)金属离子对XOD酶活性的影响

[0082] 酶液中加入不同的金属离子(终浓度为2mM/L)，25℃下保温2h后测定残余酶活性。以不添加金属离子的酶液为对照，计算相对酶活。结果如表1 所示，金属离子Mg2+、Ca2+对黄嘌呤氧化酶活性有稍微的促进作用，Co2+、Mn2+、Ba2+对酶活性均有一定的抑制作用。而在反+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3+
应体系中加入Ag 、Hg 、 Pb 、Zn 、Cu 、Fe 、Fe 离子后均未测到酶活性，且看到明显沉淀。分析原因认为，反应体系中黄嘌呤极难溶于水，用0.025M/L的NaOH配制的黄嘌呤溶液，因此Ag+、Hg2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+等金属离子均与 OH-反应产生沉淀。

[0083] 表1不同金属离子对酶活力的影响

[0084]