重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法

摘要

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中L‑哌啶酸的分离提纯方法。本发明是以全细胞催化制备L‑哌啶酸的发酵液为原料，经脱色、去除杂质和溶析结晶得到针状晶体L‑哌啶酸。本发明的分离提纯方法将等电点结晶和溶析结晶结合，采用了丙酮作为溶析剂，解决了L‑哌啶酸在水中溶解度大，不容易析出的问题，提纯的L‑哌啶酸，光学纯度可以达到百分之百；且该方法操作简单，对环境污染小，收率高，可达94.9％，而且所需试剂简单，可以通过设计新型装置达到循环利用，为工业生产L‑哌啶酸提供一种新方法。

权利要求

1.重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待分离样品处理：取发酵原液，加入吸附剂充分混匀后加热搅拌，再经滤纸、硅藻土和滤膜过滤，得澄清溶液；所述发酵原液中L-哌啶酸浓度为10～60g/L，pH值为2～10；所述发酵原液中含有锌、钾、钠、铵、铁、铜、镁阳离子，含有磷酸根、硫酸根、氯离子阴离子，还含有葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸有机成分；

2)杂质去除：将步骤1)所述的澄清溶液，加入溶剂后充分混匀，再经静置、离心，取上清液；

3)溶析结晶：将步骤2)所述的上清液调节pH值至6.0～6.5，加入丙酮静置溶析，离心后析出白色晶体后进行抽滤烘干，得针状晶体L-哌啶酸，抽滤得到的滤液循环到下一次溶析结晶。

2.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤1)中加热搅拌的速率为1000～1500r/min，加热温度为40～80℃，加热搅拌时间为0.67～1.5h。

3.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤1)中滤膜过滤为至少一次

0.2～0.8μm滤膜过滤。

4.根据权利要求3所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤1)中滤膜过滤为依次经0.8μm滤膜、0.45μm滤膜过滤。

5.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤2)中溶剂包括无水乙醇、甲醇、丙醇和乙二醇的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤2)所述溶剂与所述澄清溶液的体积比为1：1～1：2。

7.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤2)中静置的时间为3～8min，离心条件为3500～4500r/min，10～25℃，5～10min。

8.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤3)中丙酮与上清液是体积比为2:3～2:13。

9.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于，步骤3)中静置时间为5～15min，离心条件为3500～4500r/min，10～25℃，5～10min。

说明书

重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法。

背景技术

[0002] 哌啶酸(Pipecolic acid，简称PA)是一种重要的刚性环状非蛋白质氨基酸，它既可以限定多肽的构象，还可作为不同化合物合成库中的多功能骨架，所以广泛用于许多手性药物和生物活性物质的制备。新一代局麻药罗哌卡因(Ropivacaine)、抗精神病药物硫利哒嗪(Thioridazine)、免疫抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)以及抗肿瘤抗生素山卓霉素(Sandramycin)等，均是以哌啶酸或其衍生物为主要原料制得的。

[0003] 由于哌啶酸及其衍生物具有的生物活性和广泛的应用前景，其合成已引起众多国外研究者的兴趣，并开发出许多合成的新方法和新技术。利用重组大肠杆菌生产手性L-哌啶酸是一种新型生产哌啶酸的方法，其具有产率高选择性高光学纯度高等优点。哌啶酸及其衍生物作为一类应用广泛的医药中间体，市场需求会越来越大。若将上述生物合成哌啶酸的方法转为工业生产，L-哌啶酸分离提纯技术也很重要。随着合成技术、生物技术及药学研究的不断发展，可以预期哌啶酸及其衍生物必定具有更为广泛的应用前景。

[0004] 目前分离提取有机酸的方法主要有：钙盐法、沉淀法、萃取法、离子交换法、膜分离法。钙盐法是一种传统的从发酵液中提取有机酸的方法，但此法收率低，操作过程中存在损失过多问题，而且会产生大量废弃物，对环境造成严重污染。萃取法采用有机溶剂经行萃取，此过程中采用大量的毒性有机溶剂，残留的毒性溶剂会对产品质量造成影响，并且存在着溶剂回收处理的问题。申请号为200810195852.5的专利采用阳离子树脂交换提取发酵液中琥珀酸，但琥珀酸发酵液中的大量杂质离子会导致树脂污染严重，交换容量迅速下降，而且树脂的频繁再生会产生大量废液，造成严重的环境污染。申请号为200610086003.7的专利利用膜分离、活性炭脱色及结晶技术从厌氧发酵法制备的发酵液中分离提取琥珀，但膜的清洗加大了劳动强度，而且50℃脱色及65℃和-0.08～0.1MPa下的减压蒸发浓缩，会导致大量的能耗。

[0005] 目前为止有关L-哌啶酸分离纯化的国内外文献资料相对较少，因此开发一种光学纯度高、操作简单、成本低、对环境污染小、收率高的从重组大肠杆菌发酵产物中分离提纯的L-哌啶酸的方法在工业生产中具有重要意义。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法，本发明的分离提纯方法将等电点结晶和溶析结晶结合，采用了丙酮作为溶析剂，解决了L-哌啶酸在水中溶解度大，不容易析出的问题；且该方法操作简单，对环境污染小，收率高。

[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0008] 重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法，包括以下步骤：

[0009] 1)待分离样品处理：取发酵原液，加入吸附剂充分混匀后加热搅拌，再经滤纸、硅藻土和滤膜过滤，得澄清溶液；

[0010] 2)杂质去除：将步骤1)所述的澄清溶液，加入溶剂后充分混匀，再经静置、离心，取上清液；

[0011] 3)溶析结晶：将步骤2)所述的上清液调节pH值至6.0～6.5，加入丙酮静置溶析，离心后析出白色晶体后进行抽滤烘干，得针状晶体L-哌啶酸，抽滤得到的滤液循环到下一次溶析结晶。

[0012] 作为一种优选，步骤3)中将步骤2)所述的上清液调节pH值至6.0～6.5，加入丙酮静置溶析，离心后析出白色晶体后进行抽滤烘干，抽滤得到滤液，再将滤液经丙酮两次静置溶析、离心、析出白色晶体后进行抽滤烘干，三次得到的白色晶体都为针状晶体L-哌啶酸。

[0013] 进一步，步骤1)所述发酵原液中哌啶甲酸浓度为10～60g/L，pH值为2～10；所述发酵原液中含有锌、钾、钠、铵、铁、铜、镁等多种阳离子，含有磷酸根、硫酸根、氯离子等多种阴离子，还含有少量葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸等有机成分。

[0014] 所述重组大肠杆菌是过表达L-赖氨酸-α-氧化酶(LysoX)，葡萄糖脱氢酶(gcd)，Pip2C还原酶(DpkA)和赖氨酸转运蛋白酶(LysQ)的宿主工程菌，所述重组大肠杆菌能转化含有L-赖氨酸-α-氧化酶基因(LysoX)，葡萄糖脱氢酶基因(gcd)，Pip2C还原酶基因(DpkA)，赖氨酸转运蛋白酶的基因(lysQ)的重组表达载体。

[0015] 所述重组大肠杆菌生产L-哌啶酸的方法为：将所述重组大肠杆菌按1～10％接种于5L发酵罐中，以葡萄糖或L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸为底物，先有氧积累菌体量，再微氧进行发酵的双阶段培养方式发酵。

[0016] 一种具体的实施方式，生产L-哌啶酸的方法为：所述双阶段的第一阶段有氧积累菌体量：将种子液按1～20％接种发酵液中，发酵8h～15h后，以1～5g/L/h的流速添加葡萄糖或L-赖氨酸或L-赖氨酸盐酸盐；第二阶段微氧发酵生产L-哌啶甲酸：待OD达到最大值后，降低转速和减小通气量，使罐内处于微氧或无氧状态，发酵过程中检测葡萄糖浓度低至10g/L时，补加葡萄糖使其浓度保持10g/L。种子培养基为LB培养基，和/或发酵培养基为加葡萄糖的无机盐培养基，初始葡萄糖浓度为40g/L，另加无机盐K2HPO4.3H2O 7.5g/L，MgSO4.7H2O2g/L，(NH4)2SO4 1.6g/L，柠檬酸2g/L，MnSO4·H2O 0.0045g/L，FeSO4·
7H2O0.0756g/L，Na2SO4 0.02g/L，Zn2SO4 0.0064g/L，CoCl2·6H2O 0.004g/L，CuSO4.5H2O 
0.0006g/L。

[0017] 由上述生产L-哌啶酸的方法可以看出重组大肠杆菌发酵产物中成分复杂，本发明将等电点结晶和溶析结晶结合，在溶析结晶前采用利用加入乙醇除去发酵液中的无机盐离子，提高了产品结晶的纯度；采用了丙酮作为溶析剂，解决了L-哌啶酸在水中溶解度大，不容易析出的问题。

[0018] 解决了重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸分离的难题。

[0019] 进一步，步骤1)中加热搅拌的速率为1000～1500r/min，加热温度为40～80℃，加热搅拌时间为0.67～1.5h。

[0020] 进一步，步骤1)中滤膜过滤为至少一次0.2～0.8μm滤膜过滤。

[0021] 作为一种优选，步骤1)中滤膜过滤的最后一次为0.22μm或0.45μm的滤膜过滤。

[0022] 进一步，步骤1)中滤膜过滤为依次经0.8μm滤膜、0.45μm滤膜过滤。

[0023] 作为一种优选，步骤1)中滤膜过滤为依次经0.8μm滤膜、0.6μm滤膜和0.2μm滤膜过滤。

[0024] 进一步，步骤2)中溶剂包括无水乙醇、甲醇、丙醇和乙二醇的一种或多种。

[0025] 进一步，步骤2)所述溶剂与所述澄清溶液的体积比为1：1～1：2。

[0026] 进一步，步骤2)中静置的时间为3～8min，离心条件为3500～4500r/min，10～25℃，5～10min。

[0027] 进一步，步骤3)中丙酮与上清液是体积比为2:3～2:13。

[0028] 进一步，步骤3)中静置时间为5～15min，离心条件为3500～4500r/min，10～25℃，5～10min。

[0029] 本发明的有益效果在于：

[0030] 1)本发明为从重组大肠杆菌发酵产物中分离提纯的L-哌啶酸，光学纯度可以达到百分之百。

[0031] 2)本发明在溶析结晶前采用利用加入乙醇除去发酵液中的无机盐离子，提高了产品结晶的纯度。

[0032] 3)本发明的方法将等电点结晶和溶析结晶结合，采用了丙酮作为溶析剂，解决了L-哌啶酸在水中溶解度大，不容易析出的问题。

[0033] 4)本发明操作简单，对环境污染小，收率高，可达94.9％，而且所需试剂简单，可以通过设计新型装置达到循环利用，为工业生产L-哌啶酸提供一种新方法。

附图说明

[0034] 图1为L-哌啶酸提纯流程图。

具体实施方式

[0035] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

[0036] 待分离样品：待分离样品为由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备L-哌啶酸的发酵原液，所述发酵原液中哌啶甲酸浓度为10～60g/L，pH值为2～10；发酵原液中含有锌、钾、钠、铵、铁、铜、镁等多种阳离子，含有磷酸根、硫酸根、氯离子等多种阴离子，还含有少量葡萄糖、赖氨酸、柠檬酸等有机成分。

[0037] 实施例1重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法

[0038] (1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备L-哌啶酸的发酵原液。

[0039] (2)样品处理：将发酵液按照质量分数4％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌1小时，温度为75℃，转速为1400r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜以及0.45μm滤膜得到澄清溶液。

[0040] (3)杂质去除：将上述处理后的发酵液进行除杂。取20ml发酵液，加入1:1的无水乙醇，玻璃棒搅拌，静置5min。进行离心，离心条件4000r/min，15℃，8min。发现有淡黄色沉淀析出，取上清液。

[0041] (4)L-哌啶酸的等电点溶析结晶：将上述上清液，利用稀盐酸调节pH值至6.21，加入30ml丙酮，静置10min，进行离心，离心条件4000r/min，15℃，8min。析出少量白色晶体，进行抽滤，并将晶体烘干。将滤液加入丙酮40ml,静置10min，进行离心，离心条件4000r/min，15℃，8min，析出白色晶体，进行抽滤烘干；将滤液加入丙酮40ml,静置10min，进行离心，离心条件4000r/min，15℃，8min，析出白色晶体，进行抽滤烘干；三次提纯都可得到针状晶体，即为L-哌啶酸晶体。回收率为94.9％。

[0042] 实施例2重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法

[0043] (1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备L-哌啶酸的发酵原液。

[0044] (2)样品处理：将发酵液按照质量分数5％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌1.2小时，温度为45℃，转速为1400r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜、0.6μm滤膜以及0.2μm滤膜得到澄清溶液。

[0045] (3)杂质去除：将上述处理后的发酵液进行除杂。取10ml发酵液，加入1:2的乙二醇，玻璃棒搅拌，加入碱液，调节其pH值至碱性，静置8min。进行离心，离心条件5000r/min，25℃，8min。发现有淡黄色沉淀析出，取上清液。

[0046] (4)L-哌啶酸的等电点溶析结晶：将上述上清液，利用稀盐酸调节pH值至6.21，加入10ml丙酮，静置8min，进行离心，离心条件4500r/min，25℃，8min。析出少量白色晶体，进行抽滤，并将晶体烘干。将滤液加入丙酮20ml,静置8min，进行离心，离心条件4500r/min，25℃，8min，析出白色晶体，进行抽滤烘干；将滤液加入丙酮30ml，静置8min，进行离心，离心条件4500r/min，25℃，8min，析出白色晶体，进行抽滤烘干；三次提纯都可得到针状晶体，即为L-哌啶酸晶体。回收率为93.1％。

[0047] 实施例3重组大肠杆菌发酵产物中L-哌啶酸的分离提纯方法

[0048] (1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备L-哌啶酸的发酵原液。

[0049] (2)样品处理：将发酵液按照质量分数3％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌40分钟，温度为70℃，转速为1500r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜、0.45μm滤膜以及0.2μm滤膜得到澄清溶液。

[0050] (3)杂质去除：将上述处理后的发酵液进行除杂。取15ml发酵液，加入1:2的丙醇，玻璃棒搅拌，加入碱液，调节其pH值至碱性，静置5min。进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min。发现有淡黄色沉淀析出，取上清液。

[0051] (4)L-哌啶酸的等电点溶析结晶：将上述上清液，利用稀盐酸调节pH值至6.21，加入20ml丙酮，静置5min，进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min。析出少量白色晶体，进行抽滤，并将晶体烘干。将滤液加入丙酮30ml,静置5min，进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min，析出白色晶体，进行抽滤烘干；将滤液加入丙酮40ml,静置5min，进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min，析出白色晶体，进行抽滤烘干，三次提纯都可得到针状晶体，即为L-哌啶酸晶体。回收率为93.4％。

[0052] 对比实施例

[0053] (1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备L-哌啶酸的发酵原液。

[0054] (2)样品处理：将发酵液按照质量分数3％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌40分钟，温度为70℃，转速为1500r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜、0.45μm滤膜以及0.2μm滤膜得到澄清溶液。

[0055] (3)杂质去除：将上述处理后的发酵液进行除杂。取15ml发酵液，加入1:2的无水乙醇，玻璃棒搅拌，加入碱液，调节其pH值至碱性，静置5min。进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min。发现有淡黄色沉淀析出，取上清液。

[0056] (4)L-哌啶酸的等电点溶析结晶：将上述上清液，利用稀盐酸调节pH值至6.21，加入20ml甲醇，静置5min，进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min，未见白色晶体析出。

[0057] 其中采用甲醇作为溶析剂，但L-哌啶甲酸在甲醇的溶解度也较大，所以对与L-哌啶甲酸的分离提取并不适用。

[0058] 对比实施例

[0059] (1)样品来源：由重组大肠杆菌进行摇瓶发酵制备L-哌啶酸的发酵原液。

[0060] (2)样品处理：将发酵液按照质量分数3％加入活性炭(活性炭为木质粉状活性炭，用于吸附色素)将发酵液与活性炭的混合液加热搅拌40分钟，温度为70℃，转速为1500r/min。脱色结束后过滤纸、硅藻土、0.8μm滤膜、0.45μm滤膜以及0.2μm滤膜得到澄清溶液。

[0061] (3)杂质去除：将上述处理后的发酵液进行除杂。取15ml发酵液，加入1:2的无水乙醇，玻璃棒搅拌，加入碱液，调节其pH值至碱性，静置5min。进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min。发现有淡黄色沉淀析出，取上清液。

[0062] (4)L-哌啶酸的等电点溶析结晶：将上述上清液，利用稀盐酸调节pH值至6.21，加入20ml乙醇，静置5min，进行离心，离心条件3500r/min，20℃，10min，未见白色晶体析出。

[0063] 其中采用乙醇作为溶析剂，但L-哌啶甲酸在乙醇的溶解度也较大，所以对与L-哌啶甲酸的分离提取并不适用。

[0064] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。