一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用

摘要

本发明公开一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR‑Cas9系统，包括特异性靶向KRAS基因的sgRNA，对应的DNA序列如SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示，和特异性靶向EGFR基因的sgRNA，对应的DNA序列如SEQ ID NO.11或/和SEQ ID NO.12所示。本发明还公开了其在制备治疗癌症药物中的应用。本发明CRISPR‑Cas9系统可同时高效敲除在肺癌中高度表达的两个癌症驱动因子KRAS及EGFR，该系统操作简单，敲除效率高，有望在肺癌的治疗中得到应用。本发明系统适用于EGFR和KRAS异常表达的多种癌症。

权利要求

1.一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，包括Cas9及特异性靶向KRAS基因的sgRNA和特异性靶向EGFR基因的sgRNA；特异性靶向KRAS基因的sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示，特异性靶向EGFR基因的sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO.11或/和SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，特异性靶向KRAS基因的sgRNA和Cas9存在一质粒中，特异性靶向EGFR基因的sgRNA和Cas9存在另一质粒中。

3.根据权利要求1所述的同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统还包括2种带不同抗性标记及荧光标记的Cas9骨架载体。

4.根据权利要求3所述的同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述Cas9骨架载体为有U6启动子表达的Cas9骨架载体。

5.权利要求1-4任一权利要求所述的同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统在制备KRAS基因和EGFR基因同时敲除的细胞模型或动物模型中的应用。

6.权利要求1-4任一权利要求所述的同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统在制备治疗癌症药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述癌症包括肺癌、肝癌或胰腺癌。

说明书

一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用。

背景技术

[0002] 肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，全球肺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。在我国，随着工业化速度加快、环境污染严重及人口老龄化加剧，肺癌的癌症负担日益加重。根据病理组织学可将肺癌分为两大类：非小细胞肺癌(NSCLC，85％)和小细胞肺癌(SCLC，15％)，其治疗仍为医疗界最具挑战性的任务之一。

[0003] 肿瘤细胞在驱动基因的作用下持续生长，并对驱动基因的抑制高度敏感，其中KRAS和EGFR是在肺癌中常见的突变驱动基因。

[0004] 已发现三分之一NSCLC和KRAS基因突变直接相关，故针对KRAS突变的靶向治疗是近年来肺癌研究的热点。KRAS基因属RAS基因家族中的一员，编码蛋白P21，本质为一单聚体G蛋白，位于细胞膜内侧，通过与GTP/GDP结合来调节细胞生长、分化。正常状态下p21和GDP结合处于静止状态，当受到生长因子刺激时，p21被激活为GTP结合状态，信号系统开放，同时p21具有的GTP酶活性使GTP水解成为GDP，p21重新和GDP结合后失活，信号系统关闭。正常KRAS基因可抑制肿瘤生长，突变的KRAS蛋白p21仅有微弱的GTP活性，不能迅速分解GTP，因此RAS信号传导蛋白“锁密”在GTP结合的激活状态，使细胞得到持续生长信号的刺激，募集受体信号传播所需蛋白，传递细胞外信号，影响细胞的增殖、存活和分化等过程，持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤发生。

[0005] 表皮生长因子受体(EGFR)基因位于第7号染色体p13～q22区，由28个外显子组成，编码1186个氨基酸。该基因编码的是一种跨膜的蛋白受体，为EGFR家族成员之一。EGFR突变率在不同人种中存在显著差异。突变热点主要是在其酪氨酸激酶的编码区，大多数集中在18～21外显子，最常见的突变是位于19外显子的缺失突变(约占EGFR突变的44％)和位于21外显子的L858R点突变(约占EGFR突变的41％)。

[0006] 表皮生长因子(EGF)是体外最强的促表皮细胞分裂因子，可以与某些细胞分泌的转化因子(TGFA)竞争性结合EGFR，而后激活受体酪氨酸蛋白激酶，后者使自身及胞浆中多种蛋白质底物磷酸化，触发一系列信号传递，将信息传至细胞核内，促进蛋白质和酶的合成及细胞的分裂增殖。人类的许多肿瘤都检测到EGFR表达，并通过自分泌、旁分泌作用促进肿瘤生长，肺癌中EGFR的表达量明显高于正常组织，表明其在肺癌的发生、发展中有着重要作用。

[0007] 近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关核酸酶(Cas)结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。CRISPR/Cas9技术被Nature、Science杂志分别评为2013年前10位的明星技术之一，并位居2015年科学杂志评选出来的十大发现之首。该项技术将成为功能基因组学和系统生物学领域中强有力的研究工具。

[0008] CRISPR/Cas9是一种RNA介导的DNA内切酶，通过一个与目标序列互补的单引导RNA(singleguide RNA，sgRNA)引导定位到基因组的目标序列上，此目标序列必须与一个以NGG或NAG形式的PAM序列相邻。CRISPR/Cas9在与目标序列结合后，在特定基因组区域产生双链断裂。从而激活机体的NHEJ(非同源末端连接，Non-homologous end joining)DNA突变修复机制。在该修复机制下由于没有模板，因此DNA只是随机修复以恢复其双链结构，这势必会造成修复结果与原基因组序列不同形成突变—基因敲除。

[0009] CRISPR-Cas9具有突变率高，操作简单，成本低的特点。基于CRISPR-Cas9的基因工程操作，可实现对疾病关键基因的定向修饰，以实现减缓或治愈疾病的目的。

[0010] 目前肺癌的治疗方法主要有：手术治疗、放疗、化疗和分子靶向治疗。化疗是一个相当广谱的治疗方法，但是对病人的体质有要求，体质相对较差或者有合并症的患者是化疗的禁忌，且化疗有一定的副作用。近几年分子靶向治疗的问世对这一点是比较大的突破，一些分子靶向药物在肺癌的临床治疗上取得了效果，但是靶向治疗不同于化疗，有一个特定的获益人群。随着肿瘤分子生物学，肿瘤免疫学等学科的发展，使得针对肿瘤的基因诊断、靶向治疗逐渐成为可能，基因治疗作为一种特异性强、靶向性好的新型临床治疗方法，越来越被广大的肺癌医学者所重视。

[0011] 针对基因的靶向抑制，目前常用的siRNA可有效地抑制基因表达，但是siRNA的使用具有药物的递送效率低，要持续给药，并不能够彻底根治，而且用药复杂，不适宜大规模推广。ZFNs和TALEN技术表达结构复杂，而CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。目前未见同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统的报道。

发明内容

[0012] 本发明的目的是提供一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用，以解决现有技术的不足。

[0013] 本发明采用以下技术方案：

[0014] 一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统，包括特异性靶向KRAS基因的sgRNA和特异性靶向EGFR基因的sgRNA；特异性靶向KRAS基因的sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示，特异性靶向EGFR基因的sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO.11或/和SEQ ID NO.12所示。

[0015] 进一步地，所述CRISPR-Cas9系统还包括Cas9。

[0016] 进一步地，特异性靶向KRAS基因的sgRNA或特异性靶向EGFR基因的sgRNA和Cas9存在同一质粒中或分别存在质粒中。

[0017] 进一步地，所述CRISPR-Cas9系统还包括2种带不同抗性标记及荧光标记的Cas9骨架载体。

[0018] 进一步地，所述Cas9骨架载体为有U6启动子表达的Cas9骨架载体。

[0019] 上述同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统在制备KRAS基因和EGFR基因同时敲除的细胞模型或动物模型中的应用。

[0020] 上述同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统在制备治疗癌症药物中的应用。

[0021] 进一步地，所述癌症包括肺癌、肝癌或胰腺癌。

[0022] 本发明的有益效果：

[0023] 1、本发明CRISPR-Cas9系统可同时高效敲除在肺癌中高度表达的两个癌症驱动因子KRAS及EGFR，该系统操作简单，敲除效率高，有望在肺癌的治疗中得到应用。EGFR和KRAS是在肺癌、肝癌和胰腺癌等多种癌症中都异常表达的基因，并参与着肿瘤的发生和发展，本发明系统适用于EGFR和KRAS异常表达的多种癌症。

[0024] 2、本发明通过质粒改造，分别选用2个带不同抗性标记及荧光标记的cas9骨架载体，通过共转化方式实现双基因同时敲除，加速基因敲除研究的进程。

[0025] 3、CRISPR-Cas9系统操作简单，靶位点选择较多，且靶向精确，脱靶率低，敲除的效率可达90％以上。本发明选用CRISPR-Cas9系统，相比较传统打靶系统，操作简便且打靶效率高。

附图说明

[0026] 图1：CRISPR-Cas9靶序列在KRAS基因中的位置。

[0027] 图2：CRISPR-Cas9靶序列在EGFR基因中的位置。

[0028] 图3：T7EN1酶切电泳图

[0029] 其中，1号泳道和3号泳道是未处理组DNA；2号泳道和4号泳道是处理组DNA；M表示Marker，从上到下条带分别为600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp。

[0030] 图4：KRAS蛋白相对表达量。

[0031] 图5：EGFR蛋白相对表达量。

具体实施方式

[0032] 下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

[0033] 实施例1

[0034] 1.sgRNA设计

[0035] 根据GeneBank中给出的人KRAS基因序列(Sequence ID:NM_033360.3)与EGFR基因序列(Sequence ID:NM_201282.1)分别设计10条sgRNA(对应的DNA序列分别如SEQ ID NO.1-10所示和SEQ ID NO.11-20所示)。两个基因的sgRNA都靶定在其外显子区域上，在UCSC或NCBI中用blast进行比对，确保其靶序列的唯一性。分别设计的10条sgRNA中，只有2条能有效地敲除KRAS和EGFR，选取第一条kras-sg1(对应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示)和egfr-sg1(对应的DNA序列如SEQ ID NO.11所示)进行详细讲解，如图1和图2所示。

[0036] 2.构建sgRNA的寡聚核苷酸双链

[0037] 将确定的KRAS靶序列上游引物5＇端添加CACC，下游引物5＇端添加AAAC，这样退火后形成的双链DNA粘性末端与pX458-neo-GFP骨架载体经Bbs I酶切后形成的粘性末端互补，便于后期载体的构建连接。载体pX458-neo-GFP具有新霉素抗性及GFP荧光标记。值得注意的是，靶序列的第一位碱基需为G，便于载体上U6启动子识别。

[0038] Forwarc oigo→5′-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3′

[0039] 3′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5′←Reverse oligo

[0040] 将确定的EGFR靶序列上游引物5＇端添加CACCG，下游引物5＇端添加AAAC，3′端加C，这样退火后形成的双链DNA粘性末端与pX260-puro-RFP骨架载体经Bbs I酶切后形成的粘性末端互补，便于后期载体的构建连接。载体pX260-puro-RFP具有嘌呤霉素抗性及RFP荧光标记。值得注意的是，靶序列的第一位碱基需为G，便于载体上U6启动子识别。

[0041] Forward oligo→5′-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3′

[0042] 3′-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5′←Reverse oligo

[0043] 将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链。将合成的上下游引物用1×Anneal buffer溶解，使其浓度为100μM，分别取2.5μl的上下游引物混匀，加入1μl NEB buffer，4μl无菌水，按照如下touchdown程序退火，使其形成双链DNA，置于-20℃保存备用。

[0044] 退火程序：

[0045]

[0046]

[0047] 3.CRISPR载体构建

[0048] 用限制性内切酶Bbs I对载体进行酶切，体系如表1所示：

[0049] 表1

[0050]

[0051] 按顺序加入200μL的PCR管中，37℃恒温6h后，用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳回收目的载体片段。

[0052] 将上述纯化的线性化质粒与退火形成的双链靶位点寡核苷酸重新连接形成特异性打靶载体pX458-neo-GFP-Kras-sg1和pX260-puro-RFP-egfr-sg1。连接体系如下：双链寡核苷酸0.2pmol，线性化质粒20ng，10×T4连接酶缓冲液1μL，T4连接酶1μL，加水至10μL，22℃连接1.5小时。

[0053] 将酶连产物转化到100μL的DH5α感受态细胞中，涂布相应抗性抗生素平板，37℃培养过夜。挑取单菌落用通用U6引物测序验证阳性克隆。

[0054] U6：ATGGACTATCATATGCTTACCGTA

[0055] 挑取阳性克隆37℃摇菌培养过夜，用试剂盒分别提取质粒pX458-neo-GFP-Kras-sg1和pX260-puro-RFP-egfr-sg1。

[0056] 4.质粒转染肺癌细胞

[0057] 接种A549细胞于6孔板，待细胞密度为70％，按照Lipofectamine TM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，共转染3μg pX458-neo-GFP-Kras-sg1和3μg pX260-puro-RFP-egfr-sg1重组质粒，6.5h后换液，加入新霉素和嘌呤霉素筛选培养48h后，收集存活细胞。

[0058] 5.筛选同时敲除KRAS基因和EGFR基因的A549稳定细胞株。

[0059] 流式细胞仪筛选：

[0060] 将存活细胞进行无菌流式分选，筛选出同时发绿色荧光和红色荧光的细胞，并收集。

[0061] 本实施例中，所用的载体可以替换为有U6启动子表达的cas9骨架载体，如PX330等；所用的新霉素，嘌呤霉素可替换为除氨苄霉素以外的其他抗生素；且GFP和RFP可替换为其他不同荧光。

[0062] 实施例2

[0063] T7EN1酶切实验：

[0064] 将实施例1收集的细胞进行裂解，用试剂盒抽提基因组DNA，最后溶于50μL去离子水中。

[0065] 根据GenBank公布的KRAS基因序列和EGFR基因序列，用Primer 5.0软件设计特异性引物，如表2所示：

[0066] 表2

[0067]

[0068] 用试剂盒提取部分细胞基因组DNA，以上述提取的细胞基因组DNA为模板，利用表2中设计的特异性引物扩增目的片段。扩增体系：2×PCR Mix 10μL，基因组DNA 1μL，上、下游引物各1μL，加dd H2O至20μL。反应程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸35秒，共30个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。

[0069] 取100ng纯化后的PCR产物在NEB Buffer 2中变性、复性后，用T7核酸内切酶(NEB，M0302L)37℃孵育40min，然后用2％的琼脂糖凝胶电泳分离。T7核酸内切酶能够识别不完全配对的双链DNA并进行切割，如果CRISPR-Cas9对靶点造成了突变，将能够被该酶识别并造成双链DNA断裂。因此，电泳后显示除PCR以外的其他条带说明靶点DNA存在突变。如图3所示，处理组经酶切后均出现了2条新的条带，说明处理组确实引入了突变。将上述步骤获得的PCR纯化回收产物进行TA克隆，步骤：取1ul产物与pMD19-T vector连接并转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆以通用引物U6序列atggactatcatatgcttaccgta测序，确保得到稳定敲除KRAS和EGFR的A549突变株。

[0070] 实施例3

[0071] 免疫印迹实验：

[0072] 将肺癌细胞KRAS和EGFR敲除前后的细胞各取1x106细胞，收集后加入20μL裂解液(50mM HEPES，PH7.0，1％NP-40，5mM EDTA，450mM Nacl，10mM Na pyrophosphate和50mM NaF)，裂解液中加入各种新鲜抑制剂(1mM Na orthovanadate，1mM  PMSF，10μg/ml Aprotinin，Leupeptin，胃酶抑素)。室温下超声处理后加入1％巯基乙醇，100℃中放置5min煮沸变性，在SDS-PAGE胶中，每孔上样10μL。电泳后转膜将蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后用TBST洗膜一次，用5％脱脂奶粉封闭1小时，用TBST洗膜一次，将稀释后的一抗与膜室温杂交2小时或4℃过夜。用TTBS洗涤三次后将稀释后的二抗与膜室温杂交1小时，用TBST洗膜3次，加入ECL显影试剂显色，用蛋白灰度分析软件分析结果。

[0073] 图4和图5定量分析结果显示，与未处理组相比，处理组KRAS的相对蛋白表达量为0.107±0.025，EGFR的相对蛋白表达量为0.081±0.023，表示EGFR和KRAS蛋白表达都被有效地抑制了。

[0074] 实施例4

[0075] 增殖实验：

[0076] 将肺癌细胞KRAS和EGFR敲除前后的细胞分别接种于96孔板中，另设只有培养液的空白组，每组设6个重复。培养24h、48h、72h后每孔加入20μL MTT溶液，37℃孵育2h，酶标仪上读取每孔460nm吸光度值，并计算细胞生长抑制率。数据以 表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，两者比较采用T检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。结果如表3所示：

[0077] 表3

[0078]

[0079] 注：*与A549-con相比，P＜0.05

[0080] MTT法测定细胞增殖实验结果表明：单独抑制KRAS的表达(A549-KRAS组)或单独抑制EGFR(A549-EGFR组)的表达，细胞的增殖都会受到抑制；KRAS和EGFR被同时沉默后(A549-double组)，A549的细胞增殖明显受到抑制。