一种植物甾醛类化合物的分离精制方法

摘要

本发明公开了一种从植物甾醇发酵液萃取后的结晶母液中分离制备植物甾醛类化合物（简称BA）的方法。植物甾醇经分歧杆菌发酵得到的发酵液，再经萃取、结晶等步骤提取雄烯二酮（简称4AD）之后的结晶母液浓缩浸膏用低碳醇完全溶解后，过滤获得含有BA的滤液。用少量树脂吸附，室温下挥干，加入填充大孔吸附树脂的层析柱顶端。以不同浓度的乙醇和水的混合溶液为洗脱液进行阶段洗脱；收集含有BA的洗脱液，蒸发浓缩，之后用甲醇、乙腈、水的混合液完全溶解，置于低温下结晶，过滤洗晶后得到纯度为98.5%以上的BA。该方法工艺简单，母液可纯化回收，成本低，易于工业化，过程无污染，无废水，符合环保要求，且得到的产品符合医药行业需求。

权利要求

1.一种植物甾醛类化合物的分离精制方法，包括大孔吸附树脂色谱分离和低温结晶法提纯，其特征在于：依次包括下述步骤：

1）取骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂，湿法装柱；

2）以植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩浸膏为原料，用少量低碳醇完全溶解，过滤去杂；

滤液中再加入步骤1）预留的少量大孔吸附树脂，拌匀并挥发溶剂后加到步骤1）所述大孔吸附树脂柱的顶层，干法上样；

所述低碳醇为甲醇、乙醇或异丙醇；

3）大孔吸附树脂柱层析，先以低浓度的乙醇水溶液淋洗除杂，再用高浓度乙醇水溶液洗脱；所述低浓度乙醇水溶液的体积百分比浓度为40%～60%，所述高浓度乙醇水溶液的体积百分比浓度为70%～100%；

4）步骤3）得到的洗脱液在65℃以下经旋转蒸发至无溶剂，再由乙腈、甲醇、水混合液溶解，置于-20～5℃低温下冷却结晶；所述的乙腈、甲醇、水混合液的比例为（15～20）︰3︰1 。

2.根据权利要求1所述一种植物甾醛类化合物的分离精制方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂是苯乙烯-二乙烯苯骨架结构的HZ-816、HZ-818、HZ-826、HZ801。

说明书

一种植物甾醛类化合物的分离精制方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物甾醛类物质的分离精制方法，尤其涉及用大孔吸附树脂色谱分离和低温结晶法，从植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩浸膏中，分离精制植物甾醛类物质的工艺。属植物甾醇发酵液中生化分离甾醛类物质技术领域。

背景技术

[0002] 植物甾醇发酵得到雄烯二酮（简称4AD）的过程中，会有一些有用的副产物的产生；发酵液在分离主要产品雄烯二酮之后，结晶母液中还含有某些具有很高应用价值的产物，如植物甾醛类化合物（简称BA），约含19%（见附图1），如直接舍弃，不仅是对资源的浪费，同时也会对环境造成污染。

[0003] BA全称Bisnorcholenaldehyde，目前暂无公认的中文译名，其结构如下式所示，因其结构含有甾核和醛基，所以将其归为植物甾醛类化合物。

[0004]

[0005] BA是合成黄体酮过程中一种重要中间体，近年来有专利提出BA在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，水合醋酸铜和2，2’-联吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，进行氧化脱羧反应制备黄体酮，具有产品收率高，工艺简单，生产成本低等优点。而此工艺的快速发展将促使BA的需求量急剧增长。

[0006] BA是合成黄体酮过程中一种重要中间体，黄体酮在临床上具有非常重要的用途，可以治疗由于黄体功能不全引起的先兆性流产、习惯性流产等症。此外，黄体酮还是皮质激素、雄激素和雌激素的前体，是合成一切类固醇激素的中间产物，具有非常重要的应用价值。传统的黄体酮有机合成方法步骤多、收率低、成本高；因此，黄体酮的价格一直居高不下，而BA作为合成黄体酮过程中一种重要中间体，高纯度BA的价格也很高。

[0007] 目前有学者提出以植物甾醇发酵产物（20S）-20-羟甲基孕-4-烯-3-酮为原料合成黄体酮的工艺，此方法不仅要先从植物发酵产物中提取高纯度（20S）-20-羟甲基孕-4-烯-3-酮，而且要用二甲基硫醚和N-氯代丁二酰亚胺的混合物将其氧化得到BA，然后在1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，水合醋酸铜和2，2’-联吡啶的二甲基甲酰胺溶液中，进行氧化脱羧反应制备黄体酮。此工艺中获得BA的纯度和收率都会降低，得到的BA的结构也有可能发生改变。因此，从发酵液中直接提取BA做为黄体酮的合成原料更加经济可行。在上个世纪80年代中期，就有日本学者提出用酸性亚硫酸盐处理植物甾醛类物质，然后用离子交换树脂分离得到高纯度的植物甾醛类化合物单体，纯度可以达到95%。该工艺的主要不足在于：1.植物甾醛类化合物在经过衍生化和还原之后，化学结构可能会发生较大的改变；2.纯度不够高，无法达到工业合成的纯度需求，同时也加重了后续分离纯化工艺的压力。传统可用于非极性化合物（植物甾醛类化合物也属于非极性化合物）的分离方法还有硅胶层析，但硅胶分离工艺存在一些明显的不足之处：1.使用大量有机溶剂，易对环境会造成污染；2.硅胶可重复使用性不高，增加生产成本；3.结晶母液浓缩浸膏含量较低，使用硅胶分离处理量少；4.硅胶层析工艺条件波动较大，难以控制。

[0008] 甾体类激素作为仅次于抗生素的第二大药物，一直以来由于生产成本及提取工艺等问题制约，市场需求远远大于产能。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于：提供一种工艺路线简单、生产成本低廉、符合环保要求；所得产品纯度高，符合医药行业黄体酮合成需求的BA纯化精制技术方案。

[0010] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：以BA含量约为19%的植物甾醇发酵液结晶母液浓缩浸膏为生产原料，经过大孔吸附树脂层析初步纯化后，洗脱液洗脱、旋转蒸发干燥、再冷却结晶，获得纯度大于98.5%的BA的工艺路线。

[0011] 一种植物甾醛类化合物的分离提纯方法，包括对植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩浸膏，用大孔吸附树脂色谱分离和低温结晶法提纯，其特征在于：依次包括下述步骤：

[0012] 1）取骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯的大孔吸附树脂，大部湿法装柱；

[0013] 2）以植物甾醇发酵液的结晶母液浓缩液浸膏为原料，用少量低碳醇完全溶解，过滤去杂；滤液中再加入步骤1）预留的少量大孔吸附树脂，拌匀并旋去溶剂后小心加到步骤1）所述大孔吸附树脂柱的顶层，干法上样；

[0014] 所述低碳醇为甲醇、乙醇或异丙醇；

[0015] 3）大孔吸附树脂柱层析，先以低浓度的乙醇水溶液淋洗除杂，再用高浓度乙醇水溶液洗脱；所述低浓度乙醇水溶液的体积百分比浓度为40%～60%，所述高浓度乙醇水溶液的体积百分比浓度为70%～100%；

[0016] 4）步骤3）所述洗脱液在65℃以下经旋转蒸发至无溶剂，再由乙腈、甲醇、水混合液溶解，置于-15～5℃低温下冷却结晶；所述的乙腈、甲醇、水混合液的比例为（15～20）︰3︰1[0017] 进一步的，所述的大孔吸附树脂是苯乙烯-二乙烯苯骨架结构的HZ-816、HZ-818、HZ-826、HZ801。

[0018] 进一步的，所述的大孔吸附树脂，其规格为50～80目或80～120目。

[0019] 本发明的积极效果是：1.工艺路线简单，易于工业化放大；2.所得产品纯度高，达98.5%以上，符合医药行业需求；3.由于大孔吸附树脂可以再生使用，过程中使用的溶剂主要为低碳醇和水溶液，所以生产成本低廉；4.BA的市场价值较高，而原料为植物甾醇提取
4AD后废弃的结晶母液浓缩浸膏，使得资源再利用，同时提高企业利润；5.工艺过程无污染，无废水，符合环保要求。本发明的实施对于甾体类药物的生产发展具有推动作用，对企业拥有显著的经济效益，对社会医疗保障具有很大的积极意义。

附图说明

[0020] 图1为结晶母液浓缩浸膏高效液相色谱图；

[0021] 图2为纯化后产品的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0022] 本发明所用的原料为植物甾醇经分歧杆菌发酵得到的发酵液，再经萃取、结晶等步骤提取雄烯二酮（简称4AD）之后的结晶母液浓缩浸膏，其高效液相色谱图图1。由图可见发酵液在分离主要产品雄烯二酮之后，结晶母液中还含有某些具有很高应用价值的产物，如植物甾醛类化合物（简称BA），约含19%。如直接舍弃，不仅是对资源的浪费，同时也会对环境造成污染。实施例中所用旋转蒸发仪型号为BC-R205C，所用的高效液相为Agilent 1100，检测条件如下：柱温箱温度为30℃；检测波长为254nm；色谱柱为安捷伦C18 4.6×100mm，3.5μm色谱柱；流动相为甲醇∶水（65:35），流速为1ml/min。实施例中釆用的大孔吸附树脂是指上海华震科技有限公司产品HZ-816、HZ-818、HZ-826、或HZ801，规格为50～80目或80～120目。

[0023] 实施例1：

[0024] 取30ml 50目-80目的HZ-816型大孔吸附树脂，预留4ml树脂，其余采用湿法装柱，倒入树脂柱中。取1.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入预留的4ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用14倍50%乙醇溶液，以2ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含BA的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁热过滤，置于0℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.15g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.6%。

[0025] 实施例2：

[0026] 取30ml 80目-120目的 HZ-826型大孔吸附树脂，预留3ml树脂，其余采用湿法装柱倒入树脂柱中。取1.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的3ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用13倍50%乙醇溶液，以1ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含BA的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（15:3:1）溶解，趁热过滤，置于4℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.16 g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.8%。

[0027] 实施例3：

[0028] 取50ml 50目-80目的 HZ-826大孔吸附树脂，采用湿法装柱，剩余5ml树脂，其余倒入树脂柱中。取2.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的5ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用13倍50%乙醇溶液，以2ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用4倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含BA的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（17:3:1）溶解，趁热过滤，置于-10℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到0.18g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.5%。

[0029] 实施例4：

[0030] 取50ml 80目-120目的HZ-816大孔吸附树脂，采用湿法装柱，剩余3ml树脂，其余倒入树脂柱中。取2.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的3ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用18倍50%乙醇溶液，以2.5ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用3倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含BA的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁热过滤，置于4℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到 0.11g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为99.0%。

[0031] 实施例5：

[0032] 取50ml 80目-120目的HZ801型大孔吸附树脂，预留5ml树脂，其余采用湿法装柱倒入树脂柱中。取2.5g浓缩浸膏，使用少量无水乙醇（5ml）溶解至完全，过滤，加入剩余的5ml树脂，挥发溶剂后采用干法上样。使用8倍50%乙醇溶液，以0.5ml/min的流速洗脱除去杂质，然后用3倍90%乙醇溶液以相同流速洗脱得到含BA的洗脱液。将洗脱液在65℃下用旋转蒸发仪浓缩，用乙腈-甲醇-水（16:3:1）溶解，趁热过滤，置于-20℃条件下浓缩结晶。过滤，用冷的结晶体系清洗2-3次。得到 0.23g高纯度纯品，经高效液相测定其含量为98.9%。