一种水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵及其制备方法

摘要

本发明公开了一种水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵及其制备方法。它是将羟乙基纤维素和大豆蛋白质分别溶解在去离子水和稀NaOH溶液中，然后经冷冻、真空干燥法制备复合海绵。通过改变羟乙基纤维素和大豆蛋白质的比例及环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚交联改性，可获得具有不同微观结构和性能的复合海绵材料。该复合海绵材料具有水敏感型记忆功能，可恢复压缩前的形状和结构。体外细胞培养实验和血液相容性实验表明，这类复合材料具有良好的细胞、血液、组织相容性。该方法简单实用，原材料来源广泛，可望塑造出具有应用前景的天然高分子生物医用材料。

权利要求

1.一种具有水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵的制备方法，其特征在于，它是将羟乙基纤维素和大豆蛋白质先分别溶解在去离子水和4 5wt％氢氧化~钠水溶液中，然后按比例共混，羟乙基纤维素和大豆蛋白质的质量比为90:10～30:70，搅拌得到均匀的共混液，向上述共混溶液中加入羟乙基纤维素和大豆蛋白质总质量的10-50 %的环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚室温下搅拌混匀进行交联反应，经离心脱气后置于-

20℃下放置12 h，再转入-80℃下放置24 h后经冷冻干燥，然后用稀醋酸中和至pH为7，清水漂洗即得复合海绵。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联的条件为加入环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚交联，在室温下搅拌混匀30 min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，交联完成后所述的离心脱气的条件为

5000rpm离心8～10min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，稀醋酸溶液的浓度为4%～5%。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述的大豆蛋白质为大豆分离蛋白。

6.一种具有水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆分离蛋白复合海绵，其特征在于，通过权利要求1-5任意一项所述的方法制备得到。

说明书

一种水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合

海绵及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵及其制备方法。

背景技术

[0002] 作为自然界中最丰富的天然高分子，纤维素已被广泛应用于纺织、造纸、农业和食品等行业。近几十年来,由于其安全性和生物相容性等特性，纤维素也被用作功能性生物材料和组织工程支架材料。由于纤维素的开发利用，纤维素的衍生物如醋酸纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羧甲基纤维素 (CMC)、甲基纤维素、氰乙基纤维素等也开始被大家所认知和利用。其中，HEC 和CMC易溶于水，可以体内降解或者溶解在体液中，在可降解或可吸收生物材料领域具有应用前景。因此，使用羟乙基纤维素(HEC)代替纤维素，体内生物降解性的难题可能被解决。同时，HEC作为纤维素的衍生物除了具有纤维素本身的一些优良特性外，还具有其它更优良的特性，如良好的增稠、悬浮、分散、乳化、成膜和降解等特性。

[0003] 大豆蛋白质不仅无毒副作用，而且还对细胞增殖和组织再生具有促进作用，在生物材料领域的应用引起大家的广泛关注(Vaz CM,de  Graaf LA,Reis RL, Cunha AM.Polym.Degrad.Stabil.,2003,81,65-74.；Santin M,Morris C,Standen G, Nicolais L,Ambrosio L.Biomacromolecules,2007,8(9),2706-2711.)。目前纤维素及其衍生物羟乙基纤维素和大豆蛋白质在生物医学材料学领域内的应用还没有充分发挥出来，我们曾制备出羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合膜材料(Yanteng Zhao, Meng He,Lei Zhao,Shiqun Wang,Yinping Li,Li Gan,Mingming Li,Li Xu, Peter R.Chang,Debbie P.Anderson,and Yun Chen.ACS Appl.Mater.Interfaces 2016, 8,2781-2795)。该复合膜材料虽然适合于细胞粘附和增殖，但由于材料本身比较致密，不能作为三维支架材料应用于组织工程领域且不具有良好的形状记忆功能。且还未见到有关制备羟乙基纤维素与大豆分离蛋白复合海绵材料的报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种具有水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵及其制备方法，通过该方法可控合成具有多孔结构、良好的亲水性、体内降解性和独特的水敏感形状记忆功能的复合海绵材料。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0006] 一种具有水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵的制备方法，它是将羟乙基纤维素和大豆蛋白质先分别溶解在去离子水和4～5wt％氢氧化钠水溶液中，然后按比例共混，羟乙基纤维素和大豆蛋白质的质量比为0:100～ 90:10，搅拌得到均匀的共混液，向上述共混溶液中加入羟乙基纤维素和大豆蛋白质总质量的10-50％的环氧氯丙烷或乙二醇二缩水甘油醚室温下搅拌混匀进行交联反应，经离心脱气后置于-20℃下放置12h，再转入-80℃下放置24h冷冻干燥，然后用稀醋酸中和至pH为7，清水漂洗即得复合海绵。

[0007] 所述的大豆蛋白质溶液优选通过如下方法制备得到：往大豆蛋白质中加入去离子水，混匀；再加入4％～5％NaOH溶液，混匀，其中，大豆蛋白质、去离子水与4％～5％NaOH溶液的质量比优选为1:6:3。

[0008] 所述的交联的条件优选为加入环氧氯丙烷(ECH)或乙二醇二缩水甘油醚 (EDGE)交联，在室温下搅拌混匀30min。

[0009] 交联完成后所述的离心脱气的条件优选为5000rpm离心8～10min。

[0010] 所述的稀醋酸溶液的浓度优选为4％～5％。

[0011] 一种具有水敏感形状记忆功能的羟乙基纤维素/大豆蛋白质复合海绵，通过上述方法制备得到。

[0012] 进一步地，上述大豆蛋白质优选为大豆分离蛋白。

[0013] 本发明可以通过控制羟乙基纤维素与大豆蛋白质的比例，在混合溶液中对羟乙基纤维素和大豆蛋白质进行化学交联改性，从而控制复合材料的结构与性能。还可以改变成型过程中的温度，以及在混合溶液中添加不同的成孔剂等，改变复合材料的孔结构及其性能。

[0014] 本发明具有如下优点和有益效果：(1)生产工艺简单、成本低廉，所采用的高分子原料均为天然高分子或天然高分子衍生物，来源广泛，无毒害；(2)通过改变材料组成与含量，可以改变材料的结构和理化性能及生物学性能；(3)所制备的这种海绵在一定条件下，形变为原来体积的1/20时，遇水还能够恢复原来本身所具有的体积和形态结构；(4)该材料吸水、吸血性好，可能用作吸水或与血液接触的生物材料；(5)这种材料有良好的生物相容性，能够用于人体软组织的塌陷或缺损，由于其形状具有大程度的可变性，所以，手术时体表伤口比较小；(6) 这种材料具有多种优良的性能使得其在天然高分子和生物医学领域具有广泛的用途。所以，该复合海绵不仅可以作为新型生物材料，而且与原来我们报道的复合膜材料具有不同的结构、性能、功能和应用范围。

附图说明

[0015] 图1为实施例1中EDGE交联四个浓度的复合海绵材料表面与断面的电镜照片。EDHSS-10、EDHSS-30、EDHSS-50和EDHSS-70分别代表大豆分离蛋白含量分别占10％、30％、
50％和70％，A为复合海绵材料表面的电镜照片，B为复合海绵材料断面的电镜照片。

[0016] 图2为实施例1中四种浓度EDHSS-10、EDHSS-30、EDHSS-50和EDHSS-70 复合海绵材料与红细胞孵育后的扫描电镜图。

[0017] 图3为实施例1中四种EDHSS-10、EDHSS-30、EDHSS-50和EDHSS-70 不同浓度海绵材料与L929细胞接触培养后的荧光共聚焦结果。

[0018] 图4为实施例1中四种EDHSS-10、EDHSS-30、EDHSS-50和EDHSS-70 不同浓度海绵材料与L929细胞接触培养后的扫描电镜照片。

[0019] 图5为实施例1中EDHSS-50海绵材料与医用纱布用于SD大鼠皮肤损伤修复的结果，左边为EDHSS-50海绵组，右边为医用纱布组。

[0020] 图6为实施例6中环氧氯丙烷交联的EHSS-50(SPI含量为50％)海绵材料与纤维素大豆蛋白质海绵材料(CSS-50)的热压前后及浸泡入水后的光镜图。

[0021] 图7为实施例6中EHSS-70海绵热压前后植入SD大鼠皮下的手术过程图。

[0022] 图8为实施例7中植入皮下的热压和未热压两种海绵分别在体内植入5d、 15d、30d和60d后的扫描电镜结果。

具体实施方式

[0023] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

[0024] 【实施例1】

[0025] 将羟乙基纤维素溶解于去离子水中，浓度为2％。将大豆分离蛋白溶解于5％的NaOH溶液中，浓度为10％。将两者溶液混匀，大豆分离蛋白所占羟乙基纤维素/大豆分离蛋白两者的干重比在10％-70％之间，用乙二醇二缩水甘油醚(EDGE)交联，EDGE占羟乙基纤维素/大豆分离蛋白两者干重的50％，在室温下搅拌混匀30min，离心去气泡。将溶液倒入模具中，先在-20℃下冷冻12h，在-80℃下冷冻24h，然后放入冷冻真空干燥箱内干燥成型。将制成的复合海绵，剪成1×1cm的片状，放入液氮冷冻10min然后用扫描电镜对复合海绵的表面结构进行观察，再将复合海绵剪成1×2cm的大小，用锡箔纸包裹放入液氮中冷冻10min，然后用夹子将其从中折断，观察复合海绵的断面结构。

[0026] 图1A和图1B为实施例1所获得的海绵材料的表面结构扫描电镜图片，如图所见，复合海绵不管是表面还是断面都有均一大小的孔洞，并且孔与孔之间相通。

[0027] 【实施例2】

[0028] 将实施例1中制好的材料剪成1×1×0.2cm大小的片状，每个浓度(大豆分离蛋白所占羟乙基纤维素/大豆分离蛋白两者的干重比为10％、30％、50％、 70％)的材料剪3片，用生理盐水清洗三遍，然后再加入10mL的生理盐水，于 37℃中30min，备用；从新西兰兔子心脏取血4mL，与生理盐水按1:1.25的比例混匀，然后向浸泡在生理盐水中每份材料内加入200uL稀释血液，同时进行阳性与阴性对照试验，并以去离子水为阳性对照，生理盐水为阴性对照，均温育 30min，经1500rpm转速离心10min，通过紫外分光光度计于紫外光545nm处测量吸光度值，计算溶血率。

[0029] 下列表1为实施例2所获得的一系列羟乙基纤维素/大豆分离蛋白(大豆分离蛋白含量为10％、30％、50％和70％)的溶血测试结果，从表格可以看出各样品的溶血率(HR)<5％，表明该复合膜材料符合医疗器材溶血性能的要求。

[0030] 表1

[0031]

[0032] 图2为将各比例材料与红细胞直接孵育30min，之后通过扫描电子显微镜 SEM观察，发现红细胞的形态没有发生变化。

[0033] 【实施例3】

[0034] 将实施例1制好的海绵材料分别剪成1cm×1cm×0.3cm的薄块，用锡箔纸包裹做好标记，于121℃高压灭菌21min。取出高压灭菌的样品，分别放入 24孔细胞培养板中。在复合材料表面滴加一定浓度的含10％血清细胞悬液1mL，在空白孔中加入同样浓度同体积的细胞作为阴性对照组。放入37℃CO2细胞培养箱中培养72h，在48h时更换液体。72h之后将24孔板取出，将培养基吸出，用PBS漂洗3次，再用适量的4wt％甲醛溶液在4℃下固定过夜，然后将液体吸出再用PBS洗3次，加入配好的10ug/ml的DiO细胞膜荧光染液，暗室内染色15-20min，再用PBS洗3次，用荧光显微镜观察。

[0035] 图3为实施例1中四种EDHSS-10、EDHSS-30、EDHSS-50和EDHSS-70 不同浓度海绵材料与L929细胞接触培养后的荧光共聚焦结果，如图所见，发现细胞在材料上面生长良好、形态正常，并且进入材料内部孔隙中。

[0036] 【实施例4】

[0037] 将实施例3中与L929细胞共培养后的材料取出，用PBS洗3次，然后用液氮冷冻抽干，进行扫描电镜观察，如图4所示，可以更加直观地看出细胞在其表面和内部生长良好。

[0038] 图4为实施例1中四种EDHSS-10、EDHSS-30、EDHSS-50和EDHSS-70 不同浓度海绵材料与L929细胞接触培养后的扫描电镜照片，如图所见，可以更加直观地看出细胞在其表面和内部生长良好。

[0039] 【实施例5】

[0040] 将实施例1制好的海绵材料分别剪成5cm×5cm×0.5cm的薄块，用锡箔纸包裹做好标记，于121℃高压灭菌21min，备用。用7％的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.5mL/100g)，呈俯卧位，碘伏消毒。造成全层皮肤缺损的模型，于大鼠背部制作1个直径为2cm的圆形全层缺损创面，避开血管，深达筋膜。将大鼠随机分为两组，即EDHSS-50海绵敷料组和医用纱布组，将其两组皮肤的修复情况进行分析。

[0041] 图5为实施例1中EDHSS-50海绵材料与医用纱布用于SD大鼠皮肤损伤修复的结果，左边为EDHSS-50海绵组，右边为医用纱布组。通过实验对比可以发现，EDHSS-50组海绵修复皮肤缺损的时间11d左右优于纱布组的14.5d，伤口愈合的效果较好，没有愈合后的疤痕，表明EDHSS-50海绵能够很好地促进伤口修复与治疗。

[0042] 【实施例6】

[0043] 以羟乙基纤维素和大豆蛋白质为原料，通过环氧氯丙烷(ECH)交联，羟乙基纤维素和大豆蛋白质各占干重的50％，在室温下搅拌混匀30min，离心去气泡。将溶液倒入模具中，先在-20℃下冷冻12h，在-80℃下冷冻24h，然后放入冷冻真空干燥箱内干燥成型，制备成EHSS-50复合海绵。同样的方法，以纤维素和大豆蛋白质为主要原料通过ECH为交联剂，制备出纤维素和大豆蛋白质各占干重的50％，在室温下搅拌混匀30min，离心去气泡。将溶液倒入模具中，在-80℃下冷冻24h，然后放入冷冻真空干燥箱内干燥成型，制成CSS-50复合海绵。将制好的海绵材料EHSS-50和CSS-50裁剪成圆形，在130℃，30MPa 作用下热压10min，将其分别命名为EHSS-PT-130和CSS-PT-130。之后与水接触，其结果如图6所示。

[0044] 图6为实施例6中环氧氯丙烷交联的EHSS-50(SPI含量为50％)海绵材料与纤维素大豆蛋白质海绵材料(CSS-50)的热压前后及浸泡入水后的光镜图。通过与纤维素/大豆蛋白质海绵材料对比，可以发现两种海绵经过热压后，由三维多孔结构变为片状致密结构，之后再浸泡入水，EHSS-50海绵基本恢复原来的 95％以上，但是纤维素/大豆蛋白质复合海绵却没有这种明显变化。

[0045] 【实施例7】

[0046] 将实施例6中所制备的EHSS-70海绵分为未处理组和热压处理组，两种海绵材料进行SD大鼠皮下填充实验，其手术操作如图7所示，从图中可以看出，经过热压后的海绵材料体积改变大，容易改变其形状，减小其手术伤口，其填充皮下后，于不同时间，通过SEM观察。

[0047] 图7为实施例6中EHSS-70海绵热压前后植入SD大鼠皮下的手术过程图。

[0048] 图8为实施例7中植入皮下的热压和未热压两种海绵分别在体内植入5d、 15d、30d和60d后的扫描电镜结果。如图所示，复合海绵在体内有良好的相容性，经过热压处理后的薄片海绵能够在体液的作用下恢复原状，大鼠的细胞和组织能够通过孔隙结构进入海绵材料的内部，占据海绵内的孔隙结构。两个月内，不管是热压后还是未热压的海绵材料都能够在体内完全降解。

[0049] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。