一种药用白芨组织培养种苗繁育方法

摘要

本发明公开了一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，旨在提供一种具有繁殖速度快，质量高、适合规模化种苗繁育等优点的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其技术方案要点是，包括以下培育步骤：S1：外植体选取，S2：增殖培养，S3：壮苗培养，S5：生根诱导，通过以上步骤，能够克服药用白芨种子萌发率低，种苗培育难；繁殖速度慢等瓶颈；能够快速、优质、高效的进行种苗繁育，以满足大规模种植的需要，使白芨能够工厂化和规模化培育。

权利要求

1.一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：外植体选取，选择无菌裸胚萌发并生根的组培苗为外植体，保持外植体处于无菌状态；

S2：增殖培养，将无菌状态外植体的叶片和根系切除部分或全部，接种于固体增殖培养基中，培养温度为 20～30℃，进入暗培养阶段培养 2～7 天，然后进入光照培养阶段增殖培养 8～16 周，光照强度为 1500～3000 勒克斯，光周期为 12～20/8h，将增殖率控制在 

3 倍，增殖获得团芽；

所述固体增殖培养基按以下组分和配比调配而成：花宝一号  1～2.5g/L

20-20-20速效平衡肥  1 2.5g/ L~

6-BA  1.0～3.5mg/L椰子汁  50～100ml/L蔗糖      20～30g/L琼脂      5.0～7.0g/LpH值为5.50～6.00；

S3：壮苗培养，每 12 周，将经过增殖阶段培养的团芽进行分割成单芽，并切除部分或全部叶片，转接到预制好的壮苗培养基中，暗培养 2～7 天，然后光照培养 2～4 周；

所述壮苗培养基按以下组分和配比调配而成：

1/2MS   2.35 g/L

蔗糖     20～30/L

琼脂     5.0～7.0g/L

活性炭  0.5～1.0g/L

pH 值为  5.50～6.00；

S4：生根诱导，壮苗培养得到的高度为 2cm 以上的无根组培苗，从壮苗培养基中取出并接种于生根培养基中，暗培养 2～7 天，光照培养 4～8 周，至植株具有有效健壮根 1～

3 条，完成生根；

所述生根培养基按以下组分和配比调配而成：MS  4.7g/L生长素 NAA    1～3.0mg/L活性炭  0.5～1.0g/L蔗糖      15～30g/L琼脂     5.0～7.0g/LpH 值为5.50～6.00。

2.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于：所述 S2 中，暗培养时间为 7 天，光照培养时间为 8 周，光照强度为 2000 勒克斯，光周期为 

16/8h。

3.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于，所述固体增殖培养基的 pH 值为 5.90。

4.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于，所述 S3 中暗培养时间为 7 天，光照培养时间为 3 周，光照强度 2000～3000 勒克斯，光周期 

12～20/8h，环境温度为 10～30℃。

5.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于，所述 S3 中光照强度为 2000 勒克斯，光周期为 16/8h，环境温度为 28℃。

6.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于，所述壮苗培养基的 pH 值为 5.90。

7.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于：所述 S4 中暗培养时间为 7 天，光照培养时间为 8 周，光照强度 1000～3000 勒克斯，光周期为 10～30/8h，环境温度为 10～30℃。

8.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于：所述 S4 中光照强度为 2000 勒克斯，光周期为 16/8h，环境温度为 25℃。

9.根据权利要求 1 所述的一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其特征在于，所述生根培养基的 pH 值为 5.90。

说明书

一种药用白芨组织培养种苗繁育方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物繁殖技术领域，特别涉及一种药用白芨组织培养种苗繁育方法。

背景技术

[0002] 白芨是兰科白芨属的一种，也称白及。多年生草本，高20～50厘米，叶4～5枚，基部互相套叠成茎状，中央抽出花葶。总状花序具数朵花；花紫色或淡红色，直径约5厘米，由3枚萼片、2枚花瓣和1枚特化的唇瓣组成；唇瓣3裂，上面有纵褶片；雄蕊与花柱合生而成合蕊柱，合蕊柱顶端有一个花药，前上方有一个柱头凹穴。地下有粗厚的根状茎，如鸡头状，富粘性，含白及胶质，即白及甘露聚糖，可供药用，有止血补肺、生肌止痛之效，也可供作糊料。

[0003] 白芨花色艳丽，出入药外，其也是一种很好的景观植物，因此市场对白芨的需求十分旺盛。由于市场需求的扩大，近年来我国大部分地区的野生白芨遭到过度采挖，导致其野生自然资源急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一。

[0004] 为保护白芨野生资源，人工繁育和栽培白芨势在必行。

[0005] 目前，公告号为CN106416972A的中国专利公开了一种快速培养白芨种苗的方法，它包括将白芨的种子经萌发培养、原球茎分化培养、鳞茎诱导培养和驯化后，得到白芨幼苗的方法。

[0006] 这种快速培养白芨种苗的方法虽然整齐性较好，但原球茎退化快、变异比例高，种苗弱小，移栽成活率低,无法满足大规模种植需求。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，其具有繁殖速度快，质量高、适合规模化种苗繁育等优点。

[0008] 本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，包括以下步骤：S1：外植体选取，选择无菌裸胚萌发并生根的组培苗为外植体，保持外植体处于无菌状态；

[0009] S2：增殖培养，将无菌状态外植体的叶片和根系切除部分或全部，接种于固体增殖培养基中，进入暗培养阶段培养2～7天，然后进入光照培养阶段增殖培养8～16周，将增殖率控制在3倍，增殖获得团芽；

[0010] S3：壮苗培养，每12周，将经过增殖阶段培养的团芽进行分割成单芽，并切除部分或全部叶片，转接到预制好的壮苗培养基中，暗培养2～7天，然后光照培养2～4周；S5：生根诱导，优选壮苗培养得到的高度为2cm以上的无根组培苗，从壮苗培养基中取出并接种于生根培养基中，暗培养2～7天，光照培养4～8周，至植株具有有效健壮根1～3条，完成生根。

[0011] 通过采用上述技术方案，由于白芨的种子非常小，而且是没有胚乳的裸胚，因此在自然状况下很难萌发和生长，实生苗的栽培比较困难，常用的方法主要是靠根状茎分株繁殖，而分株繁殖的繁殖系数低，繁殖速度慢，无法满足大规模的种植需求。

[0012] 而本方法是将外植体的根系、叶片切除后，在高浓度细胞分裂素作用下，促使休眠腋芽萌发并不断诱导出丛生团芽，然后将丛生团芽分割成单个芽，转接入壮苗培养基进行复壮培养，再转接入生根培养基中进行生根诱导，能够大大提高繁育培养的效率，降低繁殖周期，增加繁育速度，减少耗种量，以满足大规模种植的需要，使白芨能够工厂化和规模化培育。

[0013] 由于白芨种子是没有胚乳、不具种皮的裸胚，常规播种很容易使种子散失生命力，而通过无菌播种，诱导种子无菌萌发，并以此为外植体进行组织培养快速扩繁，以使出苗率大大提高，且通过本方法能够促使萌芽快速生长出苗，出苗速度快并且壮大，保证植株拥有较高的存活率。

[0014] 进一步设置：所述S2中培养温度为20～30℃，暗培养时间优选为7天，光照培养时间优选为6周，光照强度为1500～3000勒克斯，优选为2000勒克斯，光周期为12～20/8h，优选16/8h。

[0015] 通过采用上述技术方案，暗培养的作用是使植株进行呼吸作用以诱导愈伤组织活动，而光照培养的作用是进行光合作用以诱导植株分化，通过控制光照培养期间的光照轻度和光照周期，能够得到较为良好的团芽培育效果，使团芽上分出单芽的数量尽可能增加，进一步提升白芨繁育的效率。

[0016] 进一步设置，所述固体增殖培养基按以下组分和配比调配而成：花宝一号 1～2.5g/L

[0017] 20-20-20速效平衡肥 1～2.5 g/L

[0018] 6-BA  1.0～3.5mg/L

[0019] 椰子汁   50～100ml/L

[0020] 蔗糖   20～30g/L

[0021] 琼脂  5.0～7.0g/L

[0022] PH值为5.50～6.00，优选为5.90。

[0023] 该配方能够保障腋芽增殖人为可控，增殖倍率为3～4倍，且芽体健壮。

[0024] 进一步设置：所述S3中暗培养时间优选为7天，光照培养时间优选为3周，光照强度2000～3000勒克斯，优选为2000勒克斯，光周期12～20/8h，优选16/8h，环境温度为10～30℃，优选为28℃。

[0025] 进一步设置，所述壮苗培养基按以下组分和配比调配而成：

[0026] 1/2MS   2.35g/L

[0027] 蔗糖   20～30/L琼

[0028] 脂   5.0～7.0g/L

[0029] 活性炭  0.5～1.0g/L

[0030] PH值为5.50～6.00，优选5.90。

[0031] 通过采用上述技术方案，该配方能够保障单个芽生长健壮，并且生长高度达到5cm，获得健壮的无根组培苗，便于后续转瓶生根诱导。

[0032] 进一步设置：所述S4中暗培养时间优选为7天，光照培养时间优选为8周，光照强度1000～3000勒克斯，优选为2000勒克斯，光周期10～30/8h，优选16/8h，环境温度为10～30℃，优选为25℃。

[0033] 通过采用上述技术方案，同样的，在组培苗生长时，够使每个植株具有有效健壮根1～3条，根长20～40mm，根粗1～2mm，苗高4～6CM，获得生根组培苗，其生根率达100％。

[0034] 进一步设置，所述生根培养基按以下组分和配比调配而成：

[0035] MS 4.7g/L

[0036] 生长素NAA  1～3.0mg/L

[0037] 活性炭   0.5～1.0g/L

[0038] 蔗糖   15～30g/L

[0039] 琼脂  5.0～7.0g/L

[0040] PH值为5.50～6.00，优选5.90。

[0041] 通过采用上述技术方案，该配方和操作方式能够保障种苗充分生根。

[0042] 作为优选，所述S2和S4中，植体和团芽上的根系与叶片优选为全部切除。

[0043] 通过采用上述技术方案，将植体和团芽上的根系与叶片全部切除可以避免植株和单芽在培育过程中由于根系和叶片的存在直接进行生根发育，同时避免根系和叶片吸收养分较多而影响培育的效果。

[0044] 综上所述，本发明具有以下有益效果：能够克服药用白芨种子萌发率低，种苗培育难；繁殖速度慢等瓶颈；能够快速、优质、高效的进行种苗繁育，以满足大规模种植的需要，使白芨能够工厂化和规模化培育。

具体实施方式

[0045] 实施例1：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，包括如下培养步骤：S1：外植体选取，选择无菌裸胚萌发并生根的组培苗为外植体，保持外植体处于无菌状态；S2：增殖培养，将无菌状态外植体的叶片和根系切除部分或全部，接种于固体增殖培养基中，进入暗培养阶段培养2天，然后进入光照培养阶段增殖培养8周，将增殖率控制在3倍，增殖获得团芽；

[0046] S3：壮苗培养，每12周，将经过增殖阶段培养的团芽进行分割成单芽，并切除部分或全部叶片，转接到预制好的壮苗培养基中，暗培养2天，然后光照培养2周；S4：生根诱导，优选壮苗培养得到的高度为2cm以上的无根组培苗，从壮苗培养基中取出并接种于生根培养基中，暗培养2天，光照培养4周，至植株具有有效健壮根1～3条，完成生根。

[0047] 固体增殖培养基按以下组分和配比调配而成：

[0048] 花宝一号   1.5g/L

[0049] 20-20-20速效平衡肥 1.5 g/L

[0050] 6-BA   3.5mg/L

[0051] 椰子汁   100ml/L

[0052] 蔗糖   30g/L

[0053] 琼脂   6.0g/L

[0054] PH值为5.90。

[0055] 所述花宝一号，源于市售进口分装花宝公司的通用肥料，花宝1号的N:P:K比例为7:6:19；所述20-20-20平衡肥，来自美国peters公司通用水溶肥，中文名为花多多1号；所述椰子汁为来源于市售泰国进口5KG/箱食用纯椰子汁，并以巴氏灭菌法灭菌，常温储藏。

[0056] 壮苗培养基按以下组分和配比调配而成：

[0057] 1/2MS   2.35 g/L

[0058] 蔗糖   30/L

[0059] 琼脂   6g/L

[0060] 活性炭  0.5g/LPH值为5.90。

[0061] 生根培养基按以下组分和配比调配而成：

[0062] MS   4.7g/L

[0063] 生长素NAA  3.0mg/L

[0064] 活性炭   1.0g/L

[0065] 蔗糖   15g/L

[0066] 琼脂  6.0g/L

[0067] PH值为5.90。

[0068] 实施例2：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，与实施例1的不同之处在于，S2：增殖培养，将无菌状态外植体的叶片和根系切除部分或全部，接种于固体增殖培养基中，将温度维持在25℃，进入暗培养阶段培养2天，然后进入光照培养阶段增殖培养8周，光照强度控制在1500Lux，光周期为12/8h，并将增殖率控制在3倍，增殖获得团芽；S3：壮苗培养，每12周，将经过增殖阶段培养的团芽进行分割成单芽，并切除部分或全部叶片，并将团芽转移到壮苗培养基中，将温度维持在28℃，暗培养2天，光照培养8周，光照强度控制在2000Lux，光周期为12/8h，取生长健壮的单芽作为壮苗培养的组培苗；S4：生根诱导，优选壮苗培养得到的高度为2cm以上的组培苗，从壮苗培养基中取出并接种于生根培养基中，将温度维持在25℃，暗培养2天，光照培养8周，光照强度控制在1000Lux，光周期为12/8h，至植株具有有效健壮根1～3条，完成生根。

[0069] 实施例3：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，与实施例1或2的不同之处在于，S2：增殖培养，将无菌状态外植体的叶片和根系切除部分或全部，接种于固体增殖培养基中，将温度维持在25℃，进入暗培养阶段培养7天，然后进入光照培养阶段增殖培养16周，光照强度控制在3000Lux，光周期为20/8h，并将增殖率控制在3倍，增殖获得团芽；S4：壮苗培养，重复S3，将切割后的团芽切除部分或全部叶片，并将团芽转移到壮苗培养基中，将温度维持在28℃，暗培养7天，光照培养16周，光照强度控制在3000Lux，光周期为20/8h，取生长健壮的单芽作为壮苗培养的组培苗；S5：生根诱导，优选壮苗培养得到的高度为2cm以上的组培苗，从壮苗培养基中取出并接种于生根培养基中，将温度维持在25℃，暗培养7天，光照培养16周，光照强度控制在3000Lux，光周期为20/8h，至植株具有有效健壮根1～3条，完成生根。

[0070] 实施例4：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，与实施例1的不同之处在于，固体增殖培养基按以下组分和配比调配而成：

[0071] 花宝一号   1g/L

[0072] 20-20-20速效平衡肥  1g/L

[0073] 6-BA   1mg/L

[0074] 椰子汁   50ml/L

[0075] 蔗糖   20g/L

[0076] 琼脂   5.0g/L

[0077] PH值为5.90。

[0078] 壮苗培养基按以下组分和配比调配而成：

[0079] 1/2MS  2.35g/L

[0080] 蔗糖   20/L

[0081] 琼脂   5.0g/L

[0082] 活性炭 0.5g/L

[0083] PH值为5.90。

[0084] 生根培养基按以下组分和配比调配而成：

[0085] MS   4.7g/L

[0086] 生长素NAA  1.0mg/L

[0087] 活性炭   0.5g/L

[0088] 蔗糖   15g/L

[0089] 琼脂   5.0g/L

[0090] PH值为5.90。

[0091] 实施例5：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，与实施例1或4的不同之处在于，固体增殖培养基按以下组分和配比调配而成：

[0092] 花宝一号   2.5g/L

[0093] 20-20-20速效平衡肥  2.5g/L

[0094] 6-BA   3.5mg/L

[0095] 椰子汁  100ml/L

[0096] 蔗糖   30g/L

[0097] 琼脂   7.0g/L

[0098] PH值为5.90。

[0099] 壮苗培养基按以下组分和配比调配而成：

[0100] 1/2MS   2.35g/L

[0101] 蔗糖   30/L

[0102] 琼脂   7.0g/L

[0103] 活性炭  1.0g/L

[0104] PH值为5.90。

[0105] 生根培养基按以下组分和配比调配而成：

[0106] MS   4.7g/L

[0107] 生长素NAA  3.0mg/L

[0108] 活性炭   1.0g/L

[0109] 蔗糖   30g/L

[0110] 琼脂   7.0g/L

[0111] PH值为5.90。

[0112] 实施例6：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，与实施例1的不同之处在于，培育全程的pH值为5.50。

[0113] 实施例7：一种药用白芨组织培养种苗繁育方法，与实施例1或5的不同之处在于，培育全程的pH值为6.00。

[0114] 按上述实施例1至实施例7将若干外植体进行培育，每个实施例进行100组培养实验，将获得的生根培养组培苗消毒后进行观测，并统计平均结果进行对比，其对比结果如下表：

[0115]编号/项目 有效根数/根 根长/cm 根粗/mm 苗高cm 生根率
实施例1 3 40.00 2.05 6.00 100％
实施例2 1 20.55 1.10 4.25 93％
实施例3 3 35.95 2.00 4.90 96％
实施例4 2 22.60 1.35 4.30 94％
实施例5 3 38.80 1.80 5.60 96％
实施例6 3 36.85 1.50 4.70 97％
实施例7 3 35.75 1.55 4.50 95％

[0116] 由上表可以看出，实施例1为最优选择，获得的生根培养组培苗生根率100％，而通过其他实施例培养的生根培养组培苗生根率最低为93％，可以看出使用这种方法培育的每个植株具有有效健壮根1～3条，根长20～40mm，根粗1～2mm，苗高4～6CM，适用于白芨的大规模、工厂化培育和生产。

[0117] 上述的实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。