REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用

摘要

本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用，属于生物医药领域。本发明所述应用提供了一个治疗和/或预防视网膜细胞凋亡新的作用蛋白，所述REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。本发明提供的应用没有发现有毒副作用；具有用量小、安全、长期稳定，机体无排除反应等优点，适用于临床治疗。

权利要求

1.REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用；所述视网膜细胞凋亡是由光照诱导产生；

所述的视网膜细胞为感光细胞和视网膜色素上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物的剂型包括注射剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述注射剂包括REG1A蛋白和注射剂可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在视网膜细胞离体培养中，所述注射剂中REG1A蛋白的浓度为0.625～2.5mg/ml。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的辅料包括0.9％氯化钠溶液。

说明书

REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。

背景技术

[0002] 光作用于视觉器官，使其感受细胞兴奋，其信息经视觉神经系统加工后便产生视觉。通过视觉，人和动物感知外界物体的大小、明暗、颜色、动静，获得对机体生存具有重要意义的各种信息，至少有80％以上的外界信息经视觉获得，视觉是人和动物最重要的感觉。视觉器官眼睛的视网膜上亿的神经细胞排列成三层，通过突触组成一个处理信息的复杂网络。第一层是光感受器，第二层是中间神经细胞，包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞等，第三层是神经节细胞。它们间通过突触连接，无论视网膜上的哪种细胞发生变性或病变都会影响正常视觉，进而给患者的正常生活造成影响。

[0003] 随着对视网膜细胞凋亡诱导诱导因素基因调控等方面的深入研究，发现视网膜细胞的凋亡与眼底病变关系密切，常见的视网膜细胞凋亡导致的疾病有很多，例如老年性黄斑变性，视网膜色素膜变性，椎体杆体细胞营养不良和青光眼等。针对视网膜细胞凋亡导致的病变，通过预防或防治视网膜细胞凋亡的发生，将可能成为防治疾病的可靠途径。

[0004] 目前，针对视网膜细胞凋亡疾病的治疗手段较多，例如，视网膜的移植，但是该方法可能会造成慢性排斥反应，同时对患者的生理和心理造成很大的创伤。另外，基因治疗是利用载体、化学或物理方法将正常基因导入眼组织相应细胞内让其表达，但是基因治疗的机理尚不能完全明确，并且目的基因有效转染、功能基因的长期持续表达等问题也有待解决，因此，基因治疗方法还需要深入研究才能够应用于临床。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用，使该应用作用机理清楚，治疗效果显著。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。

[0008] 优选的，REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。

[0009] 优选的，所述的视网膜细胞包括感光细胞和视网膜色素上皮细胞。

[0010] 优选的，药物的剂型包括注射剂。

[0011] 优选的，所述注射剂包括REG1A蛋白和可接受的辅料。

[0012] 优选的，所述注射剂中REG1A蛋白的浓度为0.6～2.5mg/ml。

[0013] 优选的，所述的辅料包括0.9％氯化钠溶液。

[0014] 本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。本发明所述应用提供了一个治疗和/或预防视网膜细胞凋亡新的作用蛋白，所述REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。本发明提供的应用没有发现有毒副作用；具有用量小、安全、长期稳定，机体无排除反应等优点，适用于临床治疗。

[0015] 进一步的，本发明提供的应用能够治疗和/或预防感光细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡引起的视网膜变性。

附图说明

[0016] 图1为实施例1中小鼠各个组织器官中REG1A的表达量的电泳图；

[0017] 图2为实施例2中小鼠视网膜中REG1A的定位的免疫荧光图片；

[0018] 图3为实施例3中分析重组蛋白His-REG1A表达的SDS-PAGE电泳图；

[0019] 图4为实施例4中REG1A蛋白对光照诱导的感光细胞凋亡的影响趋势；

[0020] 图5为实施例4中REG1A抑制661W细胞光损伤的细胞形态图片；

[0021] 图6为实施例5中重组REG1A蛋白对RPE细胞活力的影响趋势；

[0022] 图7为实施例6中REG1A的受体EXTL3在661W细胞及ARPE-19细胞中表达的电泳图；

[0023] 图8为实施例6中REG1A的受体EXTL3在视网膜光感受器的外节表达的免疫荧光图片；

[0024] 图9为实施例7中REG1A蛋白抑制离体培养视网膜细胞凋亡结果；

[0025] 图10显示纯化后的REG1A蛋白和商业化REG1A蛋白电泳条带。

具体实施方式

[0026] 本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。

[0027] 本发明中，所述视网膜细胞凋亡优选是由光照诱导产生的。

[0028] 本发明中，所述REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。

[0029] 本发明中，所述的视网膜细胞优选包括感光细胞和视网膜色素上皮细胞。

[0030] 本发明中，药物的剂型优选包括注射剂。

[0031] 本发明中，所述注射剂优选包括REG1A蛋白和可接受的辅料。

[0032] 本发明中，所述REG1A蛋白的来源是由北京义翘神州生物技术有限公司合成。所述REG1A蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No 10所示。

[0033] 本发明中，所述注射剂中REG1A蛋白的浓度优选为0.6～2.5mg/m1，更优选为0.625mg/ml。

[0034] 本发明中，所述的辅料优选包括无菌0.9％氯化钠溶液。

[0035] 本发明还提供了所述药物的制备方法，包括以下步骤：将0.6～2.5mg粉末状REG1A蛋白制剂溶于0.1ml无菌0.9％氯化钠溶液，重复溶解后，得到药物。所述药物作为添加剂加入离体视网膜培养系统，终浓度为0.6～2.5mg/ml，能明显减少视网膜细胞的凋亡。

[0036] 下面结合实施例对本发明提供的REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0037] 实施例1

[0038] 神经分泌因子reg1a基因在小鼠视网膜中表达情况

[0039] 取小鼠各部位作为实验材料，包括胰腺、肾脏、心脏、皮肤、小肠组织、大脑、睾丸、脉络膜、肝脏、脾脏、肺、额下腺、角膜、视网膜及晶状体。将上述材料采用试剂盒法提取各材料的mRNA。

[0040] 将提取的mRNA经过质量检测后，将完整性高的mRNA进行半定量PCR检测。具体是采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，对REG1A基因进行半定量PCR反应，以GAPDH作为内参基因，EG1A基因和mGAPDH的引物序列见表1，PCR反应体系见表2，PCR程序见表3。

[0041] 表1 REG1A基因和GAPDH的引物序列

[0042]

[0043] 表2 reg1a基因和GAPDH的PCR扩增体系

[0044]成分 体积
2×Power Taq PCR MasterMix 10μl
Primer(F+R) 2μl
cDNA 2μl
ddH2O 6μl
总体系 20μl

[0045] 表3 reg1a基因和GAPDH的PCR反应条件

[0046]

[0047]

[0048] PCR反应结束，将PCR产物在0.1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，经过EB染色后再凝胶成像系统下观察并拍照，电泳图如图1所示。

[0049] 由图1中可以看出，reg1a在肾脏、小肠和胰腺中有很高的表达量，而且在眼睛的不同组织也有表达，包括角膜、视网膜及晶状体，这说明在视网膜组织内表达regla基因。

[0050] 实施例2

[0051] 免疫染色步骤：

[0052] 解剖小鼠视网膜，放入4％多聚甲醛中固定1h，经15％和30％葡萄糖脱水处理后，放入OCT包埋剂中包埋，制备冰冻切片；

[0053] 清洗，将视网膜切片放入DPBS中，置于摇床上缓慢漂洗3遍，每次5分钟。

[0054] 漂洗结束，每孔加入500μl用DPBS配制的0.5％的Triton X-100穿透液，室温通透细胞10分钟，吸去穿透液。

[0055] 重复步骤3，每孔加入500μl用DPBS配制的3％的H2O2，室温10min，去除过氧化物酶的影响。

[0056] 吸去H2O2，重复步骤3。用4％BSA(用DPBS配制)室温封闭30min。

[0057] 吸去BSA后，重复步骤3。将REG1A抗体按1∶100稀释后，加入培养皿内，4℃孵育过夜。

[0058] 回收一抗，重复步骤3。将FITC标记的荧光二抗按1∶200稀释后加入细胞培养皿内，锡箔纸包被避光，室温孵育1小时。

[0059] 吸去二抗，DPBS漂洗3次，加入DAPI染色液，进行复染。并将盖玻片盖在滴有防淬灭剂的视网膜切片上面，盖玻片周围用指甲油封闭。

[0060] 待干燥后，在荧光显微镜下观察，拍片并分析结果。以IgG作为对照，按照上述方法进行免疫荧光实验。视网膜中免疫荧光结果如图2所示。

[0061] 由图2可知，用免疫荧光染色的方法研究小鼠视网膜中REG1A的定位，发现REG1A特异性的表达在小鼠视网膜的神经节细胞层，而在视网膜其他细胞中均未见表达。

[0062] 实施例3

[0063] 重组REG1A蛋白的表达纯化

[0064] 将reg1a基因按照实施例1中PCR扩增方法，得到reg1a基因片段的经过琼脂糖凝胶电泳，胶回收后得到大量reg1a基因片段。利用连接试剂盒，将回收的reg1a基因片段与pET28a载体进行酶切连接，得到重组载体。将重组载体转化到大肠杆菌菌株BL-1中，摇床培养，培养得到的菌落经过菌落PCR验证阳性菌。向阳性菌种加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，离心收集菌体，加入缓冲液，制成菌体混悬液，超声波破碎，离心收集蛋白质。比较添加IPTG前后细菌中蛋白表达变化，将提取的蛋白质进行PAGE凝胶电泳，结果如图3所示，其中Marker代表低分子量标准蛋白；+IPTG：加入0.1mMIPTG诱导的质粒pET28a-His-REG1A转化的BL21全菌；-IPTG表示未经IPTG诱导的质粒pET28a-His-REG1A转化的BL21全
2+
菌；R1-3表示经Ni -NTAagaros纯化的His-REG1A洗脱液1，2，3。

[0065] 从图3中可以得到，加入IPTG诱导后的菌落提取的蛋白质经过电泳分离，在20kDa的位置有明显的融合蛋白表达条带，而未经IPTG诱导的样品对应位置无明显条带。这说明reg1a基因片段在重组菌种成功表达REG1A蛋白。

[0066] 实施例4

[0067] 661W细胞是鼠源感光细胞系，根据专利号为ZL 2013 1 0631831.4的专利公开的″温度与光照可控型视网膜光损伤定量研究装置″成功建立了光损伤661W细胞模型。用0.625mg/ml，1.25mg/ml和2.5mg/ml的重组REG1A蛋白预处理光损伤的661W细胞2h，然后予以10000lux光照刺激，此方案为实验组。以未加入重组REG1A蛋白的一组作为对照。对实验组和对照组进行形态学观察并在光学显微镜下拍照，并且通过Cell counting kit检测重组REG1A蛋白处理实验组和对照组的细胞活力，两组细胞活力见图4，两组细胞的形态如图5所示。

[0068] 由图4可以看出，发现光照后，未加入重组REG1A蛋白组，细胞活力显著下降，约为实验组的50％。但是加入不同浓度的REG1A蛋白均对细胞凋亡具有抑制作用，而且随着蛋白浓度的增加，细胞活力显著提高。说明REG1A蛋白能够抑制光照引起的感光细胞凋亡。

[0069] 由图5可以看出，611W细胞经过10000lux白光光照8h后，细胞形态发生明显改变，细胞呈扁圆状，贴壁不牢，是明显的细胞凋亡状态，而加入1.25mg/ml的REG1A蛋白的细胞形态与健康611W细胞形态变化不大，未见明显凋亡细胞。从细胞形态可观察到，加有REG1A蛋白处理后光照8h的661W细胞较未加REG1A蛋白的处理的细胞，其细胞状态明显变好。这些结果表明，神经分泌因子REG1A蛋白能够抑制光照诱导的661W细胞凋亡。

[0070] 实施例5

[0071] REG1A蛋白对RPE细胞系ARPE-19细胞凋亡的抑制作用

[0072] 将ARPE-19培养于低糖低血清的培养基中，一个月后，ARPE-19细胞呈明显的六边形，并有少量色素形成，得到与体内的RPE细胞具有类似的特征的ARPE-19细胞。向ARPE-19细胞加入1.25mg/ml的重组REG1A蛋白，测定细胞活力，该组作为实验组，以未加入重组REG1A蛋白细胞活力处理作为对照组，测定细胞活力。ARPE-19细胞经10000lux白光光照8h后加入1.25mg/ml的重组REG1A蛋白，测定细胞活力，该组作为实验组，以未加入重组REG1A蛋白细胞活力处理作为对照组，测定细胞活力。将四组测定的细胞活力建立柱状图，如图6所示。

[0073] 从图6可知，未经光照的实验组和对照组细胞活力稍有差异，而经过光照的实验组比对照组相比存在显著差异，并且加入重组REG1A蛋白后细胞活性显著提高，该结果证明重组REG1A蛋白对RPE细胞也具有明显的保护作用。

[0074] 实施例6

[0075] 神经分泌因子REG1A蛋白干预光照诱导的细胞凋亡的机制

[0076] 检测REG1A的受体EXTL3在661W细胞及ARPE-19细胞中表达情况，以GAPDH作为内参基因，扩增EXTL3和GAPDH基因的引物和PCR反应程序为如表4所示，PCR反应体系如表5所示。扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图7中A部分所示)。

[0077] 按照实施例3中的方法制备重组EXTL3蛋白，并且对重组EXTL3蛋白进行蛋白印迹(如图7中B部分所示)。

[0078] 由图7可知，受体EXTL3在661W细胞及ARPE19细胞中均有表达，而且，免疫荧光结果也证明了，受体EXTL3在小鼠视网膜中，主要在感光细胞中表达。

[0079] 采用实施例2中的免疫荧光检测的方法检测661W细胞及ARPE19细胞中EXTL3的表达情况(如图8)。免疫荧光结果也证明了，受体EXTL3在小鼠视网膜中也表达，主要在视网膜光感受器的外节。

[0080] 基于上述结果，REG1A蛋白是有视网膜神经节细胞的分泌的一种神经营养因子，通过与感光细胞和RPE细胞表面的受体EXTL3结合，发挥作用。起到保护感光细胞和RPE细胞的作用，抑制感光细胞和RPE细胞的凋亡。

[0081] 表4.PCR引物及程序

[0082]

[0083] 表5 hEXTL3基因和GAPDH的PCR扩增体系

[0084]

[0085]

[0086] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0087] 实施例7

[0088] 神经分泌因子REG1A蛋白干预离体培养视网膜

[0089] 解剖刚出生小鼠视网膜(此时小鼠视网膜并未完全发育)，以传统离体视网膜培养方法进行培养(有参考文献)作为对照，将0.625mg/ml的REG1A蛋白添加至离体培养视网膜培养系统作为实验组，将对照组和实验组视网膜培养14天后，分别进行荧光染色和统计视网膜凋亡水平。

[0090] REG1A蛋白抑制离体培养视网膜细胞凋亡结果见图9，其中A为TUNEL检测离体培养视网膜中细胞凋亡情况；B为统计的凋亡细胞数量。对照组和实验组小鼠视网膜培养14天发育成结构稳定的三层结构，但是对照组视网膜细胞凋亡很多，而添加REG1A蛋白的实验组较对照组，细胞凋亡明显减少。由此可知，REG1A蛋白能有效抑制视网膜细胞凋亡。