本发明属于EPA‑EE的制备领域，尤其涉及一种从鱼油中制备高纯度EPA‑EE的方法，首先通过二级分子蒸馏方法蒸馏乙酯化的粗鱼油，得到EPA‑EE、DHA‑EE、ARA‑EE的混合物；其次将步骤1)分子蒸馏得到的产品通过柱层析纯化，制备得到EPA‑EE粗产品，所述EPA‑EE粗产品含极少的DHA‑EE、ARA‑EE或不含DHA‑EE、ARA‑EE；最后将柱层析纯化后的粗EPA‑EE通过硝酸银络合法纯化，利用温度差异除杂，得到EPA‑EE产品。本发明依次通过分子蒸馏、柱层析、银离子络合步骤分离提取乙酯化的粗鱼油中的EPA‑EE，最终得到纯度为96％以上的产品，操作简单、成本低廉、可实现工业化生产的制备。
1.一种从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过二级分子蒸馏方法蒸馏乙酯化的粗鱼油，得到EPA-EE、DHA-EE、ARA-EE的混合物；
2)将步骤1)分子蒸馏得到的产品通过柱层析纯化，制备得到EPA-EE粗产品，所述EPA-EE粗产品含极少的DHA-EE、ARA-EE或不含DHA-EE、ARA-EE；
3)将柱层析纯化后的粗EPA-EE通过硝酸银络合法纯化，利用温度差异除杂，得到EPA-EE产品；
所述步骤3)具体为：将步骤2)柱层析后的粗EPA-EE加入到50-60％硝酸银水溶液中，其中硝酸银水溶液的质量为粗EPA-EE质量的3-8倍，用环己烷低温萃取，其中环己烷的质量为粗EPA-EE质量的3-5倍，分取环己烷相，作为副产物；水相再用3-5倍量的环己烷高温萃取两次，然后迅速降温，分取并合并两次环己烷相；向环己烷相中加入硅胶，过滤，除掉溶液中的银离子，浓缩滤液，既得最终产品EPA-EE。
2.根据权利要求1所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：设置一级分子蒸馏蒸发面温度为90-120℃，冷凝面温度为10-35℃，进料保温温度为
35-60℃，挂膜转速为200-250转/分钟，进料速度为3-7L/min，压力为10-20Pa，进行一级分子蒸馏，弃去馏分；
设置二级分子蒸馏蒸发面温度为120-140℃，冷凝面温度为10-35℃，进料保温温度为
35-60℃，挂膜转速为200-250转/分钟，进料速度为3-7L/min，压力为5-15Pa，进行二级分子蒸馏，收集馏分用于步骤2)中。
3.根据权利要求2所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：设置一级分子蒸馏蒸发面温度为120℃，冷凝面温度为25℃，进料保温温度为45℃，挂膜转速为230转/分钟，进料速度为5L/min，压力为15Pa，进行一级分子蒸馏，弃去馏分；
设置二级分子蒸馏蒸发面温度为140℃，冷凝面温度为20℃，进料保温温度为45℃，挂膜转速为230转/分钟，进料速度为5L/min，压力为5Pa，进行二级分子蒸馏，收集馏分用于步骤2)中。
4.根据权利要求1所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：将步骤1)得到的产品加入反相硅胶柱，使用甲醇水或者乙醇水体系作为洗脱剂洗脱。
5.根据权利要求4所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述反相硅胶柱为C-18反相硅胶柱；所述反相硅胶柱高径比为20-30。
6.根据权利要求1所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：将步骤1)得到的产品加入正相硅胶柱，使用石油醚、己烷、乙酸乙酯、丙酮体系作为洗脱剂洗脱。
7.根据权利要求6所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述正相硅胶柱的高径比为20-30。
8.根据权利要求1所述的从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，其特征在于：所述步骤3)具体为：将步骤2)柱层析后的粗EPA-EE加入到50-60％硝酸银水溶液中，其中硝酸银水溶液的质量为粗EPA-EE质量的5倍，用环己烷在0-15℃萃取1-2分钟，其中环己烷质量为粗EPA-EE质量的4倍，分取环己烷相，作为副产物；水相再用4倍量的环己烷50-70℃萃取两次，每次
10-15分钟，然后迅速降温至20-30℃，分取并合并两次环己烷相；向环己烷相中加入原料一半量的硅胶，过滤，除掉溶液中的银离子，浓缩滤液，既得最终产品EPA-EE。
从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法
技术领域
[0001] 本发明属于EPA-EE的制备领域，尤其涉及一种从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法。
背景技术
[0002] 鱼油，英文名称为Fats and Glyceridic oils，CAS号为8016-13-5，是鱼体内的全部油类物质的总称，来源于大型海洋鱼类的身体，其主要成分为Omega-3脂肪酸，包括DHA、EPA、ARA等，是一种多元不饱和脂肪酸。
[0003] EPA是Eicosapentaenoic Acid即二十碳五烯酸的英文缩写，是人体不可缺少的重要营养素，具有降低胆固醇和甘油三酯的含量，促进体内饱和脂肪酸代谢的作用，防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病。虽然亚麻酸在人体内可以转化为EPA，但此反应在人体中的速度很慢且转化量很少，远远不能满足人体对EPA的需要，因此必须从食物中直接补充。
[0004] 高纯度的二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)可以作为原料药，应用于医药领域。美国Amarin公司研制的用于治疗高甘油三酯血症和血脂异常症的药物，就是采用纯度大于96％的二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)，目前已进入三期临床，将成为美国唯一治疗高甘油三酯血症和血脂异常症的omega-3(Ω-3)脂肪酸处方药。因此，高纯度二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)未来必将广泛的应用于原料药和医药中间体。
[0005] 目前，已报道的从鱼油制备二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)的方法很多，主要包括以下几种：尿素包合法、低温冷冻法、金属盐沉淀法、真空蒸馏法、超临界萃取法、高效液相色谱法、柱层析法等。这些方法都各有优缺点，但大部分方法还是停留在简单地去除鱼油中色素、胆固醇和部分饱和脂肪酸的水平，无法制备得到高纯度二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)或者制备得到的产品不达标，无法应用。采用制备色谱可以制备得到高纯度二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)，但是处理量小且需要特殊设备，成本高，很难实现工业化生产。因此研究开发简单可控、容易操作、成本低廉、可实现工业化生产的制备高纯度二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)的方法势在必行。
发明内容
[0006] 为了实现高纯度二十碳五烯酸乙酯(EPA-EE)的工业化生产，本发明提供一种从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，本方法同时利用了分子蒸馏、柱层析、银离子络合三种方法来提高产品的纯度，除去产品里的有害杂质。
[0007] 本发明的技术解决方案是提供一种从鱼油中制备高纯度EPA-EE的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)通过二级分子蒸馏方法蒸馏乙酯化的粗鱼油，得到EPA-EE、DHA-EE、ARA-EE的混合物；
[0009] 2)将步骤1)分子蒸馏得到的产品通过柱层析纯化，制备得到EPA-EE粗产品，所述EPA-EE粗产品含极少的DHA-EE、ARA-EE或不含DHA-EE、ARA-EE；
[0010] 3)将柱层析纯化后的粗EPA-EE通过硝酸银络合法纯化，利用温度差异除杂，[0011] 得到EPA-EE产品。
[0012] 优选地，上述步骤1)具体为：
[0013] 设置一级分子蒸馏蒸发面温度为90-120℃，冷凝面温度为10-35℃，进料保温温度为35-60℃，挂膜转速为200-250转/分钟，进料速度为3-7L/min，压力为10-20Pa，进行一级分子蒸馏，弃去馏分；
[0014] 设置二级分子蒸馏蒸发面温度为120-140℃，冷凝面温度为10-35℃，进料保温温度为35-60℃，挂膜转速为200-250转/分钟，进料速度为3-7L/min，压力为5-15Pa，进行二级分子蒸馏，收集馏分用于步骤2)中。
[0015] 更进一步地，上述步骤1)具体为：
[0016] 设置一级分子蒸馏蒸发面温度为120℃，冷凝面温度为25℃，进料保温温度为45℃，挂膜转速为230转/分钟，进料速度为5L/min，压力为15Pa，进行一级分子蒸馏，弃去馏分；
[0017] 设置二级分子蒸馏蒸发面温度为140℃，冷凝面温度为20℃，进料保温温度为45℃，为挂膜转速230转/分钟，进料速度为5L/min，压力为5Pa，进行二级分子蒸馏，收集馏分用于步骤2)中。
[0018] 优选地，上述步骤2)具体为：
[0019] 将步骤1)得到的产品加入反相硅胶柱，使用甲醇水或者乙醇水体系作为洗脱剂洗脱。
[0020] 优选地，上述反相硅胶柱为C-18反相硅胶柱；所述反相硅胶柱高径比为20-30。
[0021] 上述步骤2)也可以具体为：
[0022] 将步骤1)得到的产品加入正相硅胶柱，使用石油醚、己烷、乙酸乙酯、丙酮体系作为洗脱剂洗脱。
[0023] 优选地，上述正相硅胶柱的高径比为20-30。
[0024] 优选地，上述步骤3)具体为：将步骤2)柱层析后的粗EPA-EE加入到50-60％硝酸银水溶液中，其中硝酸银水溶液的质量为粗EPA-EE质量的3-8倍，用环己烷低温萃取，其中环己烷的质量为粗EPA-EE质量的3-5倍，分取环己烷相，作为副产物；水相再用3-5倍量的环己烷高温萃取两次，然后迅速降温，分取并合并两次环己烷相；向环己烷相中加入硅胶，过滤，除掉溶液中的银离子，浓缩滤液，既得最终产品EPA-EE。
[0025] 优选地，上述步骤3)具体为：将步骤2)柱层析后的粗EPA-EE加入到50-60％硝酸银水溶液中，其中硝酸银水溶液的质量为粗EPA-EE质量的5倍，用环己烷在0-15℃萃取1-2分钟，其中环己烷质量为粗EPA-EE质量的4倍，分取环己烷相，作为副产物；水相再用4倍量的环己烷50-70℃萃取两次，每次10-15分钟，然后迅速降温至20-30℃，分取并合并两次环己烷相；向环己烷相中加入原料一半量的硅胶，过滤，除掉溶液中的银离子，浓缩滤液，既得最终产品EPA-EE。
[0026] 本发明的优点是：
[0027] 本发明依次通过分子蒸馏、柱层析、银离子络合步骤分离提取乙酯化的粗鱼油中的EPA-EE，最终得到纯度为96％以上的产品，操作简单、成本低廉、可实现工业化生产的制备。
具体实施方式
[0028] 以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
[0029] 实施例一
[0030] 1、分子蒸馏
[0031] 取乙酯化的粗鱼油5000g，调节分子蒸馏设备参数，一级蒸馏蒸发面温度90℃，冷凝面温度10℃，进料保温温度35℃，挂膜转速200转/分钟，进料速度3L/min，压力10Pa；二级蒸馏蒸发面温度120℃，冷凝面温度10℃，进料保温温度35℃，挂膜转速200转/分钟，进料速度3L/min，压力5Pa，收集二级蒸馏产品400g。
[0032] 2、柱层析纯化
[0033] 取步骤1中得到的产品50g，用65％的甲醇或者乙醇溶解，通过高径比为25的C-18反相硅胶柱分离纯化，收集富含EPA-EE部分流出液，回收溶剂，得到EPA-EE粗产品23g。
[0034] 3、硝酸银络合法纯化
[0035] 取步骤2得到的EPA-EE粗产品20g，加入到60ml55％硝酸银水溶液中，避光振荡5分钟，加入100ml环己烷10℃萃取2分钟，分取环己烷相，作为副产物，水相再用100ml环己烷60℃萃取两次，每次10分钟，然后迅速降温至20-30℃，分取两次环己烷相，合并，经10g硅胶过滤除掉溶液中的银离子，滤液(环己烷相)浓缩，既得10.3g97.2％产品。
[0036] 实施例二
[0037] 1、分子蒸馏
[0038] 取乙酯化的粗鱼油5000g，调节分子蒸馏设备参数，一级蒸馏蒸发面温度120℃，冷凝面温度25℃，进料保温温度45℃，挂膜转速230转/分钟，进料速度5L/min，压力15Pa；二级蒸馏蒸发面温度140℃，冷凝面温度20℃，进料保温温度45℃，挂膜转速230转/分钟，进料速度5L/min，压力10Pa，收集二级蒸馏产品420g。
[0039] 2、柱层析纯化
[0040] 取步骤1中得到的产品50g，用70％的甲醇或者乙醇溶解，通过高径比为25的C-18反相硅胶柱分离纯化，收集富含EPA-EE部分流出液，回收溶剂，得到EPA-EE粗产品25g。
[0041] 3、硝酸银络合法纯化
[0042] 取步骤2得到的EPA-EE粗产品20g，加入到100ml55％硝酸银水溶液中，60ml环己烷0-15℃萃取1分钟，分取环己烷相，作为副产物，水相再用80ml环己烷60℃萃取两次，每次
10-15分钟，然后迅速降温至20-30℃，分取两次环己烷相，合并，经10g硅胶过滤除掉溶液中的银离子，滤液(环己烷相)浓缩，既得10.5g 96.8％产品。
[0043] 实施例三
[0044] 1、分子蒸馏
[0045] 取乙酯化的粗鱼油5000g，调节分子蒸馏设备参数，一级蒸馏蒸发面温度110℃，冷凝面温度35℃，进料保温温度60℃，挂膜转速250转/分钟，进料速度7L/min，压力20Pa；二级蒸馏蒸发面温度140℃，冷凝面温度35℃，进料保温温度60℃，挂膜转速250转/分钟，进料速度7L/min，压力15Pa，收集二级蒸馏产品398g。
[0046] 2、柱层析纯化
[0047] 取步骤1中得到的产品50g，用80％的甲醇或者乙醇溶解，通过高径比为25的C-18反相硅胶柱分离纯化，收集富含EPA-EE部分流出液，回收溶剂，得到EPA-EE粗产品23.5g。
[0048] 3、硝酸银络合法纯化
[0049] 取步骤2得到的EPA-EE粗产品20g，加入到160ml60％硝酸银水溶液中，80ml环己烷0-15℃萃取1-2分钟，分取环己烷相，作为副产物，水相再用80ml环己烷60℃萃取两次，每次
10-15分钟，然后迅速降温至20-30℃，分取两次环己烷相，合并，经10g硅胶过滤除掉溶液中的银离子，滤液(环己烷相)浓缩，既得10.0g 98.7％产品。
