一种基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子

摘要

本发明公开了一种基于转录组测序构建棒状杆菌组成型表达载体启动子的方法，本发明还公开了基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子、含有该启动子的表达载体以及该表达载体转化宿主细胞谷氨酸棒状杆菌获得的重组菌株。用本发明获得的启动子构建的表达载体，对数期目的基因蛋白表达量低，但稳定期目的蛋白表达量相对于对数期大幅度提高，且对宿主菌生长影响低，质粒传代稳定性高，适合于对数期不需要表达，而稳定期需要高度表达的目的基因的载体构建，尤其适合于氨基酸发酵用工程菌株的构建。

权利要求

1.一种基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种棒状杆菌组成型表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的启动子。

3.如权利要求2所述的棒状杆菌组成型表达载体，其特征在于：它是在质粒HY-P19的酶切位点插入目的基因和权利要求1所述的启动子构建而成，所述质粒HY-P19的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.权利要求3所述的表达载体电转化宿主细胞谷氨酸棒状杆菌获得的重组菌株。

5.权利要求4所述的重组菌株在生产异亮氨酸中的应用。

说明书

一种基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及棒状杆菌组成型表达载体启动子及其构建方法，本发明还涉及含有所述该启动子的表达载体及重组菌株。

背景技术

[0002] 棒状杆菌是一类革兰氏阳性菌，棒状杆菌的三个主要代表：谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，已经被广泛用于生产氨基酸和核苷酸等多种化学物质(Liebl等，1991)。经过物理或化学方法诱变处理得到的棒状杆菌突变株具有较强的合成目的有用物质的能力，而通过遗传工程和代谢工程对棒状杆菌野生菌株或突变株进行改造，可以获得具有更高生产强度的菌株。代谢工程改造即是在棒杆菌的多种代谢途径中寻找关键的代谢酶，通过基因工程改造调控关键代谢酶的基因表达。通常基因都是在启动子的控制下表达，其表达强度依赖于启动子元件。来自大肠杆菌、链霉菌和枯草芽孢杆菌的启动子能够在棒状杆菌属细菌中表达，可应用于棒状杆菌的载体系统构建，如应用来源于大肠杆菌的qPtac、Ptrc启动子构建的表达质粒PXMJ19，PEC-XK99E，基因在lacI 的控制下进行诱导表达，但表达量低，且在生产过程中需要添加诱导剂IPTG，而IPTG相当昂贵，不适于用做大规模生产目的产品的基因表达诱导剂；乳糖能够用来替代IPTG作为诱导物应用于大规模的生产，而对于绝大多数的棒状杆菌菌株而言，乳糖都不能进入其细胞中(Brabetz等,1991)，这也限制了诱导型表达系统在棒状杆菌中的应用。

[0003] 组成型启动子不需诱导等特殊条件即可在菌体存活期持续不断地表达外源基因，从而简化了操作过程、且具有相对较高的安全性，因此更适合在实际生产中应用。在不同细菌的管家基因中应用PCR扩增DNA探针等手段筛选并纯化具有强表达性的组成型基因，筛选出组成型的强启动子，用于重组载体的构建(Jensen P R et al.,Appl  Environ Microbiol,1998,64(1):82-87.)。杨柳等利用谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的内源强启动子Pgro有效促使外源基因xylA在谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中的表达(杨柳等，新能源进展，2014,5(2):353-357)，王小元等通过突变得到转录启动功能的tac-M启动子，构建组成型表达载体PDXW-10，在棒状杆菌中，该载体表达外源蛋白的水平适中(CN：200910210962.9)。组成型启动子表达虽然具有很多优点，但目前筛选方法复杂，且如何选择合适的启动子进行调控，以避免因为过量的蛋白表达而导致宿主菌生长停滞或代谢障碍，或使宿主能量耗竭以及质粒丢失是工业化生产亟待解决的问题。目前存在使用如Pgro作为启动子，与目的基因一起构建组成表达型质粒，这类质粒在细菌对数生长期也进行目的基因的表达，导致质粒在稳定期之前丢失严重，从而降低了表达效果。

[0004] 本发明的目的就是建立一种方法，寻找细菌对数生长期沉默，细菌生长停滞期高效表达的启动基因，用它来构建组成型高效表达质粒。在本发明中，我们应用转录组测序的分析数据，寻找一类能调控目的基因在对数期表达弱，而稳定期大量表达的启动子，一般这类启动子都是可调控型启动子，我们截取这些启动子不同的基因片段，构建了一系列棒状杆菌组成型表达载体，该系列表达载体应用绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因，探测各启动子片段活性强弱，且考核各探测质粒传代稳定性，从而筛选出一系列对数期启动子活力低、稳定期启动活力高的启动子，并考核含各启动子的质粒传代稳定性，进一步筛选出使质粒稳定的启动子。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是：目前的组成型启动子筛选方法复杂，而且筛选的启动子构建的表达质粒在宿主生长中容易丢失，还会影响宿主的生长与代谢。如何建立一个组成型启动子的快速筛选方法，且筛选出稳定期启动活力高的内源启动子，且启动子构建的质粒在菌体生长的稳定期能保证质粒的稳定性是我们需要解决的问题。

[0006] 本方面所采用的技术方案是：

[0007] 一种基于转录组测序构建棒状杆菌组成型表达载体启动子的方法，分析棒状杆菌在对数期与稳定期各基因的转录水平，通过对各基因在两个时期的转录丰度分析，筛选出一类对数期转录水平低，而稳定期转录水平高的基因，通过启动子预测软件分析基因的启动子区域，使用PCR扩增这类基因的启动子片段，并将启动子的DNA片段连入表达载体中，插入标记基因，构建启动子探测载体，电转化探测载体到宿主细胞中，培养宿主细胞到对数期和稳定期，多功能酶标仪检测细菌生长的OD与荧光蛋白表达情况，同时在无抗性压力的情况下，进行连续传代，选择探测载体对数期荧光值低、稳定期荧光值高且连续传代50代而质粒不丢失的宿主细胞，其含有的启动子即为棒状杆菌组成型表达载体启动子。

[0008] 一种基于转录组测序构建的棒状杆菌组成型表达载体启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0009] 一种棒状杆菌组成型表达载体，含有以上所述的启动子。

[0010] 所述的棒状杆菌组成型表达载体，它是在质粒HY-P19的酶切位点插入以上所述的启动子和目的基因构建而成，所述质粒HY-P19的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0011] 所述的表达载体电转化宿主细胞谷氨酸棒状杆菌获得的重组菌株。

[0012] 所述的重组菌株在生产异亮氨酸中的应用。

[0013] 本发明的有益效果：此类启动子构建的表达载体，对数期目的基因蛋白表达量低，但稳定期目的蛋白表达量相对于对数期大幅度提高，且对宿主菌生长影响低，质粒传代稳定性高，适合于对数期不需要表达，而稳定期需要高度表达的目的基因的载体构建。尤其适合于氨基酸发酵用工程菌株的构建。

[0014] 本发明构建的启动子、表达载体和重组菌株在发酵生产异亮氨酸时，可提高产酸量和糖酸转化率，降低杂酸含量，具有很高的应用前景。

附图说明

[0015] 图1是启动子探测载体HY-P19-Promoter-EGFP的构建流程图。

具体实施方式

[0016] 下面通过实施例对本发明进行详细地说明。

[0017] 实施例1

[0018] 1、转录组测序样本制备与转录信息分析：

[0019] 细菌培养：挑一环不带质粒的生产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌(H5菌株，从保藏中心获得，保藏编号为CCTCC NO：M2016609)，在LB培养基中，31℃培养过夜，将菌液取出离心，用等体积的无菌水重悬，以5％的接种量接入LBG新鲜灭菌的培养基中，31℃，200rpm培养至对数期中期与稳定期前期，取出发酵液，迅速与等体积 Bacteria Reagent(QIAGEN)混合，5000rpm离心10min，称量100mg湿菌体，迅速放入液氮中保存。

[0020] RNA提取：将液氮中保存的样品放入用液氮预冷的研钵中，加入适量液氮，保证研钵中的液氮不干，将样品研磨成粉末状，然后按照QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit的实验步骤进行RNA提取。提取后的样品跑1％的琼脂糖凝胶检测，要求无蛋白污染，即琼脂糖胶的胶孔无明显亮带。用NanoDrop Spectrophotometer进行核酸浓度检测，对数期样品浓度421ng/ul，稳定期样品浓度237ng/ul，达到送样无明显蛋白污染、核酸浓度>60ng/ul测序要求。

[0021] 2、转录组测序：提取RNA样品委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。测序流程如下：样品检测合格后，通过Ribo-zero试剂盒去除rRNA来富集mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs(dNTP中的dTTP用dUTP取代)和DNA polymerase I和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA，之后用USER酶降解含有U的cDNA第二链。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度(insert size)进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq/MiSeq测序。

[0022] 3、生物信息分析流程：测序结果委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行信息分析。获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，进行生物信息分析。生物信息分析主要流程如下：

[0023] 原始序列数据→测序数据质量评估→参考序列比对分析→基因表达水平分析→RNA-seq整体质量评估→基因差异表达分析→差异基因GO富集分析、差异基因KEGG富集分析。

[0024] 本发明样本的生物信息分析参考物种为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(购自上海复祥生物科技有限公司)，参考基因组在ncbi上链接为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006958.1。根据对最终提供的信息分析数据表，对各基因在对数期与稳定期的表达丰度分析，筛选得到表一的10个基因与转录分析信息，这10个基因的一致特点为：对数期转录水平低，稳定期转录水平高，通过对操纵子预测，基因CGTRNA_RS10085、CGTRNA_RS10080属于同一个操纵子，CGTRNA_RS07920、CGTRNA_RS07925、CGTRNA_RS07930属于同一个操纵子、CGTRNA_RS00965、CGTRNA_RS00970属于同一个操纵子，同一个操纵子共用一个启动子。

[0025] 表一：谷氨酸棒杆菌转录组分析S期转录丰度高L期丰度低基因

[0026]基因名称 Strand start end length S1_fpkm L1_fpkm
CGTRNA_RS10085 - 2142201 2143517 1317 27347.52 148.9929
CGTRNA_RS10080 - 2141798 2142136 339 24497.2 543.2887
CGTRNA_RS10840 + 2320501 2321934 1434 13058.69 838.0642
CGTRNA_RS07910 - 1672737 1673144 408 7453.836 37.12523
CGTRNA_RS07920 - 1674757 1675572 816 3383.739 15.18759
CGTRNA_RS07925 - 1675587 1676735 1149 2442.069 7.789865
CGTRNA_RS07930 - 1676732 1678090 1359 5493.98 22.03821
CGTRNA_RS00965 + 195241 199773 4533 6137.992 54.29964
CGTRNA_RS00970 + 199773 201293 1521 4023.859 33.94991
CGTRNA_RS04670 + 988209 989480 1272 2037.631 8.931068

[0027] 4、启动子区域筛选：通过NCBI blast功能，将预测出来的基因片段与实验室测序出来的谷氨酸棒状杆菌基因组进行比对，找到相应的基因序列。通过查阅文献或应用启动子预测软件，预测各基因的启动子区域，每个基因的启动子区域根据预测的功能区选择2-3个片段进行启动子活性检测。

[0028] (1)基因CGTRNA_RS10085的启动子区片段：

[0029] RS10085seq1:

[0030] CTATTGAAATTAGTTTCTGTAGGTCTATAGTTAGAGCTGGTTCAAGGGGTGTCAATCCCAAAAGGCACTCCTTGAACTCATGAAAAAGCTTGACAAAACTTCAACGTCAAAGGAGGTCATCCACGCT

[0031] RS10085seq2:

[0032] CTATTCTATAGATCTATTGAAATTAGTTTCTGTAGGTCTATAGTTAGAGCTGGTTCAAGGGGTGTCAATCCCAAAAGGCACTCCTTGAACTCATGAAAAAGCTTGACAAAACTTCAACGTCAAAGGAGGTCATCCACGCT[0033] RS10085seq3:

[0034] ACTTAACAATTCATTAAATTACCTGTTAAACTATAGAAAATATCCAAAACCCTCCAAAACCTATTCTATAGATCTATTGAAATTAGTTTCTGTAGGTCTATAGTTAGAGCTGGTTCAAGGGGTGTCAATCCCAAAAGGCACTCCTTGAACTCATGAAAAAGCTTGACAAAACTTCAACGTCAAAGGAGGTCATCCACGCT

[0035] (2)基因CGTRNA_RS10840的启动子区片段

[0036] RS10840seq1:

[0037] TCAAAGGTCAGCAATTGTGAACAAAGCTACAAATAAACCGTTCCACCCATGTCAATGAGGAGTCACC[0038] RS10840seq2:

[0039] GCAGTCAAAAGGCGTTGCTTTTCGACGTCGCAAAGCGCAATTTCCTACCTTTAAGATCCTAATCTGTTGAGGTCAGCCACAATTTTTCAGAAAAGTTTTGATAGATCGACAGGTAATGCTTTATACTGACAACGTCGCAAGGACTACATTTGCAGCCAAGTCTACTACTTGATCTTCAAAGGTCAGCAATTGTGAACAAAGCTACAAATAAACCGTTCCACCCATGTCAATGAGGAGTCACC

[0040] (3)基因CGTRNA_RS07910的启动子区片段

[0041] RS07910seq1:

[0042] ACTTGGTTCCTGCCCAACAACCCAGTGGACTTCCAGCCGGAAAATCTGCCATGCTTCATCCGTGACCGTG

[0043] RS07910seq2:

[0044] GCGATCACGTAGTCATCCAAGCAGGCGAAGAAACCACAATCGTGGACCGCGTTATCGTCACCACCGGCAGCTGGACAAGCGAGCTCGTGCCCTCCATCGCGCCACTGCTTGAAGTGCGACGCCTAGTGCTCACTTGGTTCCTGCCCAACAACCCAGTGGACTTCCAGCCGGAAAATCTGCCATGCTTCATCCGTGACCGTG

[0045] (4)基因CGTRNA_RS07930的启动子区片段

[0046] RS07930seq1:

[0047] CGGAATAGAAAATACTCCGCTCGACAGCATCACTTAGCTGAAAGGCCTTTAAC

[0048] RS07930seq2:

[0049] GAAACTGGACTAGGTTTATCTATAGCGGAATAGAAAATACTCCGCTCGACAGCATCACTTAGCTGAAAGGCCTTTAAC

[0050] RS07930seq3:

[0051] GCAGGTTAAAACGCTGCCATAGGGGATTTTTCGGCTGGGGAGACGTGGTGTAAGTGCGGGTTAAAAACGTGACCTTCGTTATAAAAACAGAAATCTATAGAACGATAGGTAGAAACTGGACTAGGTTTATCTATAGCGGAATAGAAAATACTCCGCTCGACAGCATCACTTAGCTGAAAGGCCTTTAAC

[0052] (5)基因CGTRNA_RS00965的启动子区片段

[0053] RS00965seq1:

[0054] CTTGCGTTGCAGGTAGTGCGCCTGATTTTCTTATTATCGAACGATTGATAGAAACAG GATTAAAGTGAGGTATCCCGC

[0055] RS00965seq2:

[0056] TTTTATCTTCTTTCACGGGGTGGATAGGCGAACATCTTCTACCATATCCTGTGATGTGTAACACAGGAGCGTAATCTGACCTCCCGTTTTCCTATAGATTGATCGAAAGTAACCCTTTTGTTACTTGCGTTGCAGGTAGTGCGCCTGATTTTCTTATTATCGAACGATTGATAGAAACAGGATTAAAGTGAGGTATCCCGC

[0057] (6)基因CGTRNA_RS04670的启动子区片段

[0058] RS04670seq1:

[0059] AGGCTGACAGAAACTCTAAAAACTATAGAGCTATAGAAACCTTAACTTCGGAGGTATCC[0060] RS04670seq2:

[0061] GTGGGCGCTGGGCCATAGTCGCCCCAGCTCAGCGAAGTTGTACGCCGGCGTTGCCTGCTTGTCGACGTTTTTTGCCACTTCCCTTAATTCGGGGGTGGCTGAAATGTAAGACACGTCACTACATTTAAGCTCAAAAACAACTACCTATAGGCTGACAGAAACTCTAAAAACTATAGAGCTATAGAAACCTTAACTTCGGAGGTATCC

[0062] 5、启动子探测载体构建及荧光检测：

[0063] (1)引物合成：通过snapgene软件对引物进行设计，委托武汉天一辉远进行引物合成。各合成引物序列见下表二。

[0064] 表二：构建探测载体的各引物序列

[0065]

[0066]

[0067] (2)基因组提取：挑取一环谷氨酸棒杆菌H5，接种于LB培养基中，31℃培养过夜，离心去上清，菌体基因组提取使用天根基因组提取试剂盒的步骤进行提取，提取后的基因组使用NanoDrop Spectrophotometer进行核酸浓度检测，控制进行PCR扩增的核酸浓度在100-200ng/ul之间。

[0068] (3)PCR扩增：将各合成引物加水稀释到终浓度10uM，，使用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase进行扩增，PCR体系为：基因组模板1ul，正向引物(10uM)1ul，反向引物(10uM)1ul，5*TransStart FastPfu FlyBuffer 10ul，2.5mM Dntps 4ul，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 1ul，ddH2O 32ul。PCR扩增过程为95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s-1min，72℃5min，循环数为32个，得到扩增DNA片段分别为带重组接头的RS10085seq1、RS10085seq2、RS10085seq3、RS10840seq1、RS10840seq2、RS07910seq1、RS07910seq2、RS07930seq1、RS07930seq2、RS07930seq3、RS00965seq1、RS00965seq2、RS04670seq1、RS04670seq2、EGFP。

[0069] (4)质粒酶切与DNA合成：使用原始质粒是PXMJ19，用NEB限制性内切酶NarI与HindIII进行双酶切，去掉原始的lacIq和启动子Ptac，酶切体系为50ul体系：质粒5-10ul，NarI1ul，HindIII 1ul，cutsmart 5ul，ddH2O 33-38ul。

[0070] 委托武汉天一辉远合成DNA序列：hy-dna1

[0071] gcatccggggctgatccccggcgcctaactaactaactcgagcttaagaggcctaagcttgcatgcctgcaggtcgact

[0072] (5)DNA琼脂糖电泳回收：将PCR产物与酶切产物加入10*loading buffer，点样50ul于1.5％琼脂糖凝胶，以takara 2000DL DNA marker为对照，在70V电压下电泳40min。
根据marker条带回收PCR扩增条带。回收使用takara DNA回收试剂盒进行回收，DNA片段分别为带重组接头的RS10085seq1(167bp)、RS10085seq2(180bp)、RS10085seq3(240bp)、RS10840seq1(107bp)、RS10840seq2(282bp)、RS07910seq1(110bp)、RS07910seq2(241bp)、RS07930seq1(93bp)、RS07930seq2(118bp)、RS07930seq3(229bp)、RS00965seq1(118bp)、RS00965seq2(241bp)、RS04670seq1(99bp)、RS04670seq2(247bp)、EGFP(760bp)。

[0073] (6)体外重组：使用Vazyme one Step Cloning Kit试剂盒将酶切产物与合成的DNA片段hydna1进行体外重组，重组产物直接转化大肠杆菌。

[0074] (7)大肠杆菌感受态制备：大肠杆菌感受态DH5α制备使用碧云天细菌超级感受态试剂盒进行感受态制备，制备后感受态保存于-80℃冰箱备用。

[0075] (8)转化：在冰上缓慢融解感受态细胞DH5α，将体外重组产物加入感受态细胞内，轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和重组产物，冰浴或冰水浴放置30分钟，42℃水浴，热休克2分钟。热休克后立即置于冰水浴中，2分钟。加入900微升LB，37℃200rpm培养1小时。离心去上清，将菌体涂布于含氯霉素25ug/ml的LB固体平板中，37℃培养过夜。

[0076] (9)转化子验证与质粒提取：将转化后在抗性平板上长出来的转化子，送武汉天一辉远进行测序分析，序列正确的转化子转接5ml LB试管中加入终浓度25ug/ml的氯霉素，37℃摇床，200rpm培养过夜，使用takara plasmid kit试剂盒进行质粒提取，使提取的质粒浓度在200-400ng/ul之间，构建的质粒命名为HY-P19，序列为SEQ ID NO：2。

[0077] 将HY-P19使用NEB限制性内切酶XbaI和EcoRI，在37℃水浴锅内进行双酶切1h，酶切质粒量为1ug，酶切体系为50ul体系:质粒5-10ul,XbaI 1ul，EcoRI1ul，cutsmart 5ul，ddH2O 33-38ul。回收HY-P19的酶切产物，使用Vazyme one Step Cloning Kit试剂盒将酶切产物与各启动子片段与EGFP片段进行体外重组，其他实验步骤同上(7)-(9)。

[0078] 绿色荧光蛋白EGFP的片段DNA seq：720bp

[0079] ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA

[0080] 构建出一系列含有不同启动子的探测载体的质粒HY-P19-promoter-EGFP(流程图见附图1)，含各启动子片段的探测载体分别命名为PRS10085seq1、PRS10085seq2、PRS10085seq3、PRS10840 seq1、PRS10840 seq2、PRS07910 seq1、PRS07910 seq2、PRS07930 seq1、PRS07930 seq2、PRS07930 seq3、PRS00965 seq1、PRS00965 seq2、PRS04670 seq1、PRS04670 seq2。

[0081] (10)谷氨酸棒状杆菌电转感受态细胞的制备：

[0082] ①从新鲜的LB(大约培养12h)平板上面挑取一个单菌落，接入到装有5mL LBG液体的试管中，30℃，220rpm过夜振荡培养。

[0083] ②取2mL菌体培养液接入到装有100mL EPO(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Nacl10g/L，甘氨酸25g/L，吐温1g/L)培养基的1L三角瓶中，30℃振荡培养至OD为1.0-1.5之间(约为4-5h)。

[0084] ③无菌条件下把培养液全部转移到4℃预冷的50mL离心管中，在冰上放置2分钟。

[0085] ④4℃，7000rpm冷冻离心20分钟。去除上清液之后，倒置离心管于无菌的滤纸上面吸收残留的Epo培养基。

[0086] ⑤用40mL 4℃预冷的10％甘油溶液重悬菌体并轻轻摇匀，7000rpm冷冻离心10分钟。倒去上清液。

[0087] ⑥重复第5步2次。

[0088] ⑦移液器吸取1mL预冷的10％甘油溶液，加入到离心管中并轻轻吹打重悬菌体。

[0089] ⑧最后将感受态细胞用1.5mL的无菌EP管分装，每管0.1mL。放入超低温冰箱中-80℃保存。

[0090] (11)谷氨酸棒杆菌的电转化：

[0091] ①取出一支-80℃保存的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，插在冰上直到融化。

[0092] ②加入样品质粒DNA到融化的感受态细胞中，用手指轻弹EP管，确保DNA和感受态细胞混合均匀。

[0093] ③用移液器将含有DNA质粒的感受态细胞吸入到预冷的电击杯(孔径2mm)中，用卫生纸迅速擦干。

[0094] ④将电击杯放置到电转仪中，1800V电穿孔5毫秒。

[0095] ⑤迅速将细胞液吸入到46℃预热的装有5mL LBHIS的EP管中，精确计时热击6分钟。

[0096] ⑥EP管于30℃，200rpm振荡培养，细胞复苏60分钟。

[0097] ⑦7000rpm室温离心2分钟，弃去大部分上清液，用剩余培养基重悬菌体，用玻璃棒涂布在添加10ug/mL氯霉素的LBHIS固体培养基上。

[0098] ⑧室温放置1小时左右待表面液体被充分吸收后，倒置平板于30℃恒温培养箱培养36h，长出来的转化子即为含各探测载体的菌株。

[0099] (12)谷棒转化子荧光检测

[0100] 将含有不同启动子片段的谷棒转化子，转接5ml LBG试管培养基中，30℃培养至OD600分别为2.0(对数期)、3.2(稳定期)。取出菌体，离心去上清后，用PBS溶液洗涤两次，用同体积的PBS进行重悬，重悬后的菌体，吸取200ul加入黑底96孔板中，使用多功能酶标仪TECANM1000进行荧光值检测。各探测质粒在宿主菌中对数期与稳定期检测荧光值见表三。从表中我们可以得出；同一个基因启动子，选取不同的启动子片段进行荧光值检测，得到不同的启动子活力数据，这与基因启动子区域的调控有关，我们需要筛选的即为对数期荧光值低、稳定期荧光值高的启动子片段。启动子片段RS10085seq2、RS10085seq3、RS10840seq2、RS07910seq2、RS07930seq3、RS00965seq2、RS04670seq2在探测载体的表达中，表现出我们所需的筛选特征。

[0101] 表三：各探测质粒在宿主菌中两个时期荧光检测情况与质粒传代统计表[0102]

[0103]

[0104] 注：传代稳定性指质粒有90％以上菌体含有质粒，传代50次，指传50次，质粒还稳定90％以上。

[0105] 6、各启动子探测载体的质粒传代稳定性

[0106] 将含有各启动子探测载体的重组菌，接入LBG培养基中，在无抗性压力的条件下，30℃旋转摇床，190rpm培养24h为一代；传代的接种量为5％，连续进行传代培养，每代培养的细菌进行稀释涂平板，稀释相同的浓度分别涂布于含氯霉素和不含氯霉素的平板中，质粒丢失率＝(不含氯霉素的平板菌体个数-含氯霉素的平板菌体个数)/不含氯霉素的平板菌体个数×100％,质粒丢失率≤10％，我们定义为此传代质粒稳定，当质粒丢失率>10％则认为此代质粒已不稳定。含各探测质粒的菌体的稳定传代代数见表三。

[0107] 从表三我们可以得出质粒PRS10085seq2、PRS10085seq3、PRS10840seq2、PRS07910seq2、PRS07930seq3、PRS00965seq2、PRS04670seq2传到50代，质粒丢失率≤10％，表现出良好的稳定性。

[0108] 实施例2应用启动子片段RS10085seq2构建的表达载体及其应用

[0109] 1、表达载体HY-P19-RS10085seq2-ilvA的构建

[0110] 谷氨酸棒杆菌异亮氨酸代谢关键基因为苏氨酸脱水酶，其基因代号为ilvA(序列如SEQ ID NO：3所示)，使用筛选出来的启动子片段RS10085seq2作为启动子，ilvA为目的基因，构建表达载体HY-P19-RS10085seq2-ilvA。

[0111] DNA片段扩增：使用质粒PRS10085seq2为模板，上下游引物为：

[0112] RS10085seq2Fp:tgcctgcaggtcgactctagaCTATTCTATAGATCTATTG

[0113] RS10085seq2Rp:AGCGTGGATGACCTCCTTTGA

[0114] 扩增DNA片段RS10085seq2，使用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase进行扩增，PCR体系为：PRS10085seq2模板1ul，正向引物(10uM)1ul，反向引物(10uM)1ul，5*TransStart FastPfu FlyBuffer 10ul，2.5mM Dntps 4ul，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 1ul，ddH2O 32ul。PCR扩增过程为95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10smin，72℃5min，循环数为32个。

[0115] 以菌株H5基因组为模板，上下游引物为：

[0116] ilvAFP：AAAGGAGGTCATCCACGCTATGAGTGAAACATACGTGTCTGAG

[0117] ilvARP：caaaacagccaagctgaattcTTAGGTCAAGTATTCGTACTCAG

[0118] 扩增DNA片段ilvA，使用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase进行扩增，PCR体系为：基因组模板1ul，正向引物(10uM)1ul，反向引物(10uM)1ul，5*TransStart FastPfu FlyBuffer 10ul，2.5mM Dntps 4ul，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase 1ul，ddH2O 32ul。PCR扩增过程为95℃2min，95℃20s，58℃20s，72℃30s，72℃5min，循环数为32个。

[0119] 质粒酶切：使用的质粒是PXMJ19去掉原始的lacIq和promoter改造后的HY-P19。将HY-P19使用NEB限制性内切酶XbaI和EcoRI，在37℃水浴锅内进行双酶切1h，酶切质粒量为1ug，酶切体系为50ul体系：质粒5ul，XbaI 1ul,EcoRI1ul，cutsmart 5ul，ddH2O 38ul。

[0120] DNA琼脂糖电泳回收：将PCR产物与酶切产物加入10*loading buffer，点样50ul于1.5％琼脂糖凝胶，以takara 2000DL DNA marker为对照，在70V电压下电泳40min。根据marker条带回收PCR扩增160bp、1347bp条带。回收使用takara DNA回收试剂盒进行回收。

[0121] 体外重组：使用Vazyme one Step Cloning Kit试剂盒进行体外重组，重组产物直接转化大肠杆菌。

[0122] 大肠杆菌感受态制备:同启动子探测载体构建。

[0123] 转化：在冰上缓慢融解感受态细菌，将10ul体外重组产物加入100ul感受态细胞内，轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和重组产物。冰浴或冰水浴放置30分钟。42℃水浴，热休克2分钟。热休克后立即置于冰水浴中，2分钟。加入900微升LB，37℃200rpm培养1小时。离心去上清，将菌体涂布于含氯霉素25ug/ml的LB固体平板中，37℃培养过夜。

[0124] 转化子验证与质粒提取：将转化后在抗性平板上长出来的转化子，送武汉天一辉远进行测序分析，挑取序列正确的转化子转接5ml LB试管中加入终浓度25ug/ml的氯霉素，37℃摇床，200rpm培养过夜，使用takara plasmid kit试剂盒进行质粒提取，表达质粒HY-P19-RS10085seq2-ilvA浓度为269ng/ul.

[0125] 2、含表达载体HY-P19-RS10085seq2-ilvA的菌株的构建

[0126] 谷氨酸棒杆菌电转感受态细胞的制备：同启动子探测载体构建。

[0127] 表达质粒HY-P19-RS10085seq2-ilvA电转化宿主细胞谷氨酸棒杆菌H5：同启动子探测载体构建。

[0128] 将电转后的菌液离心浓缩，用玻璃棒涂布在添加10ug/mL氯霉素的LBHIS固体培养基上，30℃培养箱中培养36h，长出来的转化子即为带质粒HY-P19-RS10085seq2-ilvA的菌株，菌株命名为H5-RS10085seq2-ilvA。

[0129] 3、菌株H5-RS10085seq2-ilvA与H5在5L发酵罐发酵产酸

[0130] 5L发酵罐发酵培养基：玉米浆15ml/L，葡萄糖140g/L(分消，0.075MPa湿热灭菌15min)，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，七水硫酸镁0.6g/L，生物素0.1mg/L，VB1 0.1mg/L，玉米油1ml/L，安琪酵母粉1g/L，消泡剂1ml/L,121℃0.01MPa湿热灭菌25min；灭菌后加入初糖，用氨水调pH为7.0。

[0131] 培养方法：将菌种接入种子培养基(种子培养基配方：葡萄糖17g/L，玉米浆10ml/L，尿素1g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾1g/L，酵母膏0.1g/L，生物素0.1mg/L，维生素B10.1mg/L，玉米油0.1g/100ml，碳酸钙1g/100ml；用NaOH调pH7.0)，31℃旋转摇床，200rpm,培养16h后，以10％接种量接入含有发酵培养基的5L自动控制发酵罐中，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧：0-8h为30-，8-24h为25％，24-56h为12％，通过自动流加15％的氨水控制pH在7.0，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在3％左右，发酵56h结束。

[0132] 放罐时，发酵液通过HPLC检测(依力特C18色谱柱，5μm，4.6*250mm，流动相为0.015mol/L的磷酸氢二铵及0.005mol/L pH7.20的混合水溶液。流速为0.5ml/min。柱温为
23℃。检测器为紫外检测器，波长199nm。对照菌H5发酵产酸22.0g/L，杂酸含量6.3g/L，糖酸转化率12.83％，工程菌H5-RS10085seq2-ilvA发酵产酸41.2g/L，杂酸含量6.8g/L，糖酸转化率18.79％。

[0133] 4、菌株H5-RS10085seq2-ilvA 5L发酵罐发酵质粒稳定性

[0134] 将56h放罐菌进行稀释涂平板，稀释10-6、10-7、10-8、10-9的梯度浓度，每个浓度梯度分别吸取50ul菌液，涂布于含氯霉素和不含氯霉素的平板中，放置于31℃培养箱中培养36h，根据无抗性平板和抗性平板上长出的菌落数计算质粒丢失率，质粒丢失率＝(不含氯霉素的平板菌体个数-含氯霉素的平板菌体个数)/不含氯霉素的平板菌体个数×100％。在
10-8稀释梯度的平板上，含氯霉素平板长出151个菌落，无氯霉素平板长出167个菌落，质粒丢失率仅为9.58％，质粒在发酵中稳定。