本发明公开了一种鉴定柿属植物的方法，涉及生物技术领域，包括如下步骤：1)以待测柿属植物的基因组DNA为模板，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；2)将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测柿属植物的核苷酸分子式；3)将步骤2)所得的核苷酸分子式与对应的若干个柿属植物的核苷酸分子式进行比对，从而确定所述待测柿属植物。实验证明，该方法精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监控水平，有效弥补以往方法的不足；另外，该方法同时实现了非花期(如苗期)的鉴定。本方法对于促进柿属植物的育种、城市园林绿化事业的发展以及环境保护具有重要意义。
一种鉴定柿属植物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定植物品种的方法。
背景技术
[0002] 柿是柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)的乔木树种。柿属植物共有约500种、1000多个栽培品种。柿的果实是中国、韩国和日本的重要传统食物。柿的树皮、叶、果实和种子是药物的来源。柿也是城市园林绿化的重要乔木树种。柿树通常根据果实和花的特征进行分类，果期和花期以外的时间存在鉴定难的问题。由于表型标记和DNA分子标记的数量少，现有标记灵敏度有限，存在同物异名和同名异物现象，柿属植物的鉴定仍然是全球研究的难点。柿属植物种质资源的精确鉴定对于育种和利用以及众多领域的科学研究是重要的基础工作。
发明内容
[0003] 本发明设计了可用于柿属植物PCR扩增的引物，鉴别方法操作简单，易于推广，提供待测柿属植物的核苷酸分子式通式，为实现上述效果，本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测柿属植物的方法，是利用泛素连接酶基因序列中的变异位点构建核苷酸分子式，进而鉴定或辅助鉴定待测柿属植物的方法，具体包括如下步骤：
[0004] (1)以待测柿属植物的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0005] (2)将所述PCR产物测序，截掉所述PCR产物序列自5’端起的第53个核苷酸记为第1位，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前52个核苷酸以及第749个(含)以后的核苷酸，得到长度为696bp的DUB序列；
[0006] (3)将所述DUB序列与DNA序列数据库中的全部序列放在一起，进行比对，自动生成一个DNA比对序列矩阵；
[0007] 所述DNA序列库为如下(a1)或(a2)：
[0008] (a1)由序列表中序列3至序列6中的至少一种组成；
[0009] (a2)由序列表中序列3至序列6中的至少一种，和序列7至序列14中的至少一种组成。
[0010] (4)根据所述DNA比对序列矩阵列出所述待测柿属植物的核苷酸分子式；
[0011] 所述待测柿属植物的核苷酸分子式的通式为：
[0012] B4B9B39B42B162B186B196B201B225B227B274B299B321B340B344B628；
[0013] 在所述通式中，所述B4、所述B9、所述B39、所述B42、所述B162、所述B186、所述B196、所述B201、所述B225、所述B227、所述B274、所述B299、所述B321、所述B340、B344和B628，依次表示在所述DNA序列比对数据矩阵中的第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628个位点；
[0014] 在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种或两种；
[0015] 当所述待测柿属植物为纯合型时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种，在测序时显示单一峰；当所述待测柿属植物为杂合型时，在所述通式中，每一个B可能为A、T、C和G中的两种，在测序时会得到明显的叠加双峰。
[0016] (5)将步骤(4)所得所述待测柿属植物的核苷酸分子式与核苷酸分子式组I进行比对；
[0017] 所述核苷酸分子式组I由如下a1)-a12)共12种核苷酸分子式组成：
[0018] a1)C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0019] a2)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0020] a3)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628；
[0021] a4)C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0022] a5)T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628；
[0023] a6)C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628；
[0024] a7)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628；
[0025] a8)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628；
[0026] a9)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628；
[0027] a10)C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0028] a11)C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0029] a12)C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0030] 在a1)-a12)中，Y表示T和C；R表示A和G(即所述待测柿属植物的相应位点为杂合型)；
[0031] (6)根据步骤(5)的比对结果，按照如下方法对所述待测柿属植物进行品种鉴定：
[0032] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a1)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为台湾乌木；
[0033] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a2)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿x3号；
[0034] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a3)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿5号；
[0035] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a4)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为老鸦柿；
[0036] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a5)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为金枣柿；
[0037] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a6)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿164号；
[0038] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a7)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿873号；
[0039] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a8)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子4号；
[0040] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a9)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子8号；
[0041] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a10)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-80号；
[0042] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a11)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-82号；
[0043] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a12)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为油柿20-75号。
[0044] 进一步，以上本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测柿属植物的方法，其操作步骤可转化为如下：
[0045] (1)以待测柿属植物的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0046] (2)将所述PCR产物测序，将测序结果与核苷酸序列组I进行比对；
[0047] 所述核苷酸序列组I由序列表中序列3-14，共12个序列组成；
[0048] (3)根据步骤(2)的比对结果，按照如下方法对所述待测柿属植物进行鉴定：
[0049] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列3，则所述待测柿属植物为或候选为台湾乌木；
[0050] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列4，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿x3号；
[0051] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列5，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿5号；
[0052] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列6，则所述待测柿属植物为或候选为老鸦柿；
[0053] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列7，则所述待测柿属植物为或候选为金枣柿；
[0054] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列8，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿164号；
[0055] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列9，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿873号；
[0056] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列10，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子4号；
[0057] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列11，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子8号；
[0058] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列12，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-80号；
[0059] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列13，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-82号；
[0060] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列14，则所述待测柿属植物为或候选为油柿20-75号。
[0061] 在上述方法中，所述待测柿属植物为如下12种植物中的任一种：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0062] 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测柿属植物的试剂盒。
[0063] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测柿属植物的试剂盒，具体可包括引物对、记载有核苷酸分子式组I的对比卡；
[0064] 所述引物对具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；
[0065] 所述核苷酸分子式组I具体由如下a1)-a12)共12种核苷酸分子式组成：
[0066] a1)C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0067] a2)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0068] a3)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628；
[0069] a4)C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0070] a5)T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628；
[0071] a6)C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628；
[0072] a7)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628；
[0073] a8)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628；
[0074] a9)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628；
[0075] a10)C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0076] a11)C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0077] a12)C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0078] 在a1)-a12)中，Y表示T和C；R表示A和G(即所述待测柿属植物的相应位点为杂合型)；
[0079] 所述待测柿属植物可为如下12种植物中的任一种：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0080] 所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测柿属植物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0081] 所述待测柿属植物为如下12种植物中的任一种：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0082] 本发明的目的还在于提供一种柿属植物的核苷酸分子式通式，所述核苷酸分子式通式是B4B9B39B42B162B186B196B201B225B227B274B299B321B340B344B628，所述B4、所述B9、所述B39、所述B42、所述B162、所述B186、所述B196、所述B201、所述B225、所述B227、所述B274、所述B299、所述B321、所述B340、B344和B628是DNA序列中第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628个核苷酸位点，所述B是A、G、T、C中任意一种或任意两种。
[0083] 作为优选方案，所述DNA序列是待测序列，所述待测序列是通过以待测柿属植物基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物进行PCR扩增，得到PCR产物，对PCR产物进行测序，将所述PCR产物自5’端起的第53个核苷酸记为第1位，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前52个核苷酸以及第749个(含)以后的核苷酸，得到的待测序列。
[0084] 进一步，所述核苷酸分子式通式的应用步骤如下：
[0085] (1)以待测柿属植物的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0086] (2)将所述PCR产物测序后，所述PCR产物序列自5’端起的第53个核苷酸记为第1位，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前52个核苷酸以及第749个(含)以后的核苷酸，得到待测序列，读取待测序列第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、
321、340、344和628个核苷酸位点，列出所述待测柿属植物的DNA序列的核苷酸分子式；
[0087] (3)将所述待测柿属植物的DNA序列的核苷酸分子式，核苷酸分子式组I进行比对；
[0088] 所述核苷酸分子式组I由如下a1)-a12)共12种核苷酸分子式组成：
[0089] a1)C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0090] a2)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0091] a3)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628；
[0092] a4)C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0093] a5)T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628；
[0094] a6)C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628；
[0095] a7)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628；
[0096] a8)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628；
[0097] a9)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628；
[0098] a10)C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0099] a11)C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0100] a12)C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0101] 在a1)-a12)中，Y表示T和C；R表示A和G；
[0102] (4)根据步骤(3)的比对结果，按照如下方法对所述待测柿属植物进行鉴定：
[0103] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a1)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为台湾乌木；
[0104] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a2)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿x3号；
[0105] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a3)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿5号；
[0106] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a4)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为老鸦柿；
[0107] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a5)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为金枣柿；
[0108] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a6)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿164号；
[0109] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a7)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿873号；
[0110] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a8)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子4号；
[0111] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a9)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子8号；
[0112] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a10)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-80号；
[0113] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a11)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-82号；
[0114] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a12)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为油柿20-75号。
[0115] 进一步，所述待测柿属植物为如下12种中的任一种：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0116] 有益效果
[0117] 本发明以柿属植物的鉴定过程为例，实验证明，本发明所提供的利用该分子式鉴定植物(如柿属植物)的方法较为精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监控水平，有效弥补以往方法的不足，并提供了柿属植物的核苷酸分子式的通式，简化了鉴别程序；另外，该方法同时实现了非花期果期(如苗期)的精准鉴定；提供一种便于柿属植物鉴定的试剂盒，试剂盒包含引物对、记录核苷酸分子式的对比卡。本方法对于促进柿属植物的育种、柿产业和城市园林绿化事业的发展及环境保护具有重要意义。
具体实施方式
[0118] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0119] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0120] 柿属植物：台湾乌木的幼叶采自北京植物园；乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号的幼叶采自陕西省杨陵市国家柿种质资源圃。
[0121] 实施例1、利用核苷酸分子式鉴定柿属植物方法的建立及其应用
[0122] 为了构建能够用于有效鉴定柿属植物的核苷酸分子式，本发明的发明人从以下柿属植物系列中获得泛素连接酶基因的一段非保守区DNA序列，并对其中的多态位点进行了统计分析。作为供试材料的柿属植物共12种，具体如下：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0123] 一、引物设计
[0124] 根据泛素连接酶基因的一段非保守区DNA序列两端的保守区，设计如下引物：
[0125] 正向引物：5’-ACTTAGGGTAGGGAGGTTGC-3’(序列1)；
[0126] 反向引物：5’-GGATAGCCAGGAAGGGTGA-3’(序列2)。
[0127] 二、PCR扩增及PCR产物的序列测定
[0128] 以作为供试材料的台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号和油柿20-75号等12种柿属植物的幼嫩叶片为实验材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒(中国天根生物技术(北京)有限公司产品，其产品目录号为DP305)提取各样品材料的基因组DNA。以所得基因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物对进行PCR扩增。结果显示，每份柿属植物均可得到一条长度约为8222-824bp的PCR产物。
[0129] 对纯化后的各PCR产物进行测序，获得了含有若干多态位点的长度为696bp的DNA序列，记为DUB序列。根据供试的12种柿属植物的测序结果，将DUB序列定义为所述PCR产物的核苷酸序列自5’端起的第53-748位(696bp)。将所述PCR产物的核苷酸序列自5’端起的第
53个核苷酸记为第1位。这个变异的高频率发生区域，未来也可能出现较长或较短的序列变化，可能会因待测样品的不同而略有变化，届时可根据实际情况获得比对序列矩阵，确定后面的多态位点的位置顺序编号。
[0130] 结果显示，台湾乌木的DUB序列为序列表中序列3；
[0131] 乌柿x3号的DUB序列为序列表中序列4；
[0132] 乌柿5号的DUB序列为序列表中序列5；
[0133] 老鸦柿的DUB序列为序列表中序列6；
[0134] 金枣柿的DUB序列为序列表中序列7；
[0135] 浙江柿164号的DUB序列为序列表中序列8；
[0136] 浙江柿873号的DUB序列为序列表中序列9；
[0137] 君迁子4号的DUB序列为序列表中序列10；
[0138] 君迁子8号的DUB序列为序列表中序列11；
[0139] 美洲柿20-80号的DUB序列为序列表中序列12；
[0140] 美洲柿20-82号的DUB序列为序列表中序列13；
[0141] 油柿20-75号的DUB序列为序列表中序列14。
[0142] 三、序列比对
[0143] 将步骤二所得的12种柿属植物的DUB序列进行比对，DNA比对序列矩阵是根据特定的计分规则，将两个或多个序列按位置比较排列后产生的数据集，最大限度地反映了序列间的相似性。其中涉及到的特定的计分规则和算法等相关常识和原理在“生物序列分析”方面的专著中均有记载。所述DNA比对序列矩阵可直接反映各序列在同一核苷酸位点之间是否存在差异，以及存在怎样的差异。找到核苷酸字母有差异的列在所述DNA比对序列矩阵中的位置，核准该位置位于所述DNA比对序列矩阵5’端起的位置顺序编号，即确定了一个多态位点。
[0144] 利用ClustalX或Mega等软件比对，获得DNA比对序列矩阵(aligned sequence matrix)，如表1中的柿属植物鉴定用16个单核苷酸多态位点。
[0145] 表1 12种柿属植物的DUB序列中的单核苷酸多态位点
[0146]
[0147]
[0148] 注：Y表示T和C；R表示A和G。即当所述待测柿属植物为纯合型时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种，在测序时显示单一峰；当待测柿属植物的相应位点为杂合型，在测序时相应杂合位点会检测到明显的叠加双峰。“多态位点的位置编号”为在所述DNA比对序列矩阵中的位置编号。
[0149] 只有通过比对排序，才能显示出样品间序列差异的规律性，这是生物信息学理论和原理的组成部分。图1为12种柿属植物的DUB DNA比对序列矩阵的部分截图。
[0150] 图1 12种柿属植物的DNA对比序列矩阵的部分截图
[0151]
[0152] 四、用于柿属植物鉴定的核苷酸分子式构建
[0153] 根据表1中所列的柿属植物的每个多态位点的核苷酸字母及其在DNA比对序列矩阵中的位置，列出各柿属植物相应的核苷酸分子式，具体如下：
[0154] 台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0155] 台湾乌木的核苷酸分子式为C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0156] 乌柿x3号的核苷酸分子式为C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0157] 乌柿5号的核苷酸分子式为C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628；
[0158] 老鸦柿的核苷酸分子式为C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0159] 金枣柿的核苷酸分子式为T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628；
[0160] 浙江柿164号的核苷酸分子式为
[0161] C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628；
[0162] 浙江柿873号的核苷酸分子式为
[0163] C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628；
[0164] 君迁子4号的核苷酸分子式为C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628；
[0165] 君迁子8号的核苷酸分子式为C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628；
[0166] 美洲柿20-80号的核苷酸分子
[0167] 式:C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0168] 美洲柿20-82号的核苷酸分子式:C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0169] 油柿20-75号的核苷酸分子式为C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0170] 以上各核苷酸分子式中的Y均表示T和C；R均表示A和G。即核苷酸分子式中含有的Y或R为柿属植物基因组内的杂合位点，在测序时会得到明显的叠加双峰。
[0171] 五、用核苷酸分子式鉴定柿属植物
[0172] (1)以待测柿属植物的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0173] (2)将所述PCR产物测序后，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前52个核苷酸(所述52个核苷酸为PCR产物5’端的保守区序列；当然也可以同时截掉PCR产物3’端的第749个(含)以后的核苷酸)，剩余序列作为待比对序列，即DUB序列(非保守区)；
[0174] (3)将所述待比对序列即DUB序列与DNA序列库中的全部序列放在一起进行比对，得到DNA比对序列矩阵；
[0175] 所述DNA序列库为如下(a1)或(a2)：
[0176] (a1)由序列表中序列3至序列6中的至少一种组成；
[0177] (a2)由序列表中序列3至序列6中的至少一种，和序列7至序列14中的至少一种组成，序列3-6为长度695bp的序列；序列8为长度694bp的序列；序列7，9-14为长度696bp的序列；
[0178] (4)根据所述DNA比对序列矩阵列出所述待测柿属植物的核苷酸分子式；
[0179] 所述待测柿属植物的核苷酸分子式的通式，即多态性位点的组合式的通式为：
[0180] B4B9B39B42B162B186B196B201B225B227B274B299B321B340B344B628；
[0181] 在所述通式中，所述B4、所述B9、所述B39、所述B42、所述B162、所述B186、所述B196、所述B201、所述B225、所述B227、所述B274、所述B299、所述B321、所述B340、B344和B628，依次表示在所述DNA序列比对数据矩阵中的第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和628个位点(对应DUB序列的第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、
340、344和628个核苷酸位点)；
[0182] 在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种或两种(当所述待测柿属植物的具体核苷酸位点为纯合型位点时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种，在测序时显示单一峰；当所述待测柿属植物的具体核苷酸位点为杂合型位点时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的两种，在测序时会得到明显的叠加双峰)。
[0183] (5)按照如下方法对所述待测柿属植物进行鉴定：
[0184] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为台湾乌木；
[0185] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿x3号；
[0186] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿
5号；
[0187] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为老鸦柿；
[0188] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为金枣柿；
[0189] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿164号；
[0190] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿873号；
[0191] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子4号；
[0192] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子8号；
[0193] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-80号；
[0194] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-82号；
[0195] 若 所 述 待 测 柿 属 植 物 的 核 苷 酸 分 子 式 为C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628，则所述待测柿属植物为或候选为油柿
20-75号。
[0196] 六、柿属植物的新分类检索表
[0197] 根据步骤五所得各样品的核苷酸分子式编制出12种柿属植物的新分类检索表，见表2。
[0198] 表2 12种柿属植物的新分类检索表
[0199]
[0200] 七、一种用于鉴定待测柿属植物的试剂盒
[0201] 本发明同时提供了一种用于鉴定待测柿属植物的试剂盒包括引物对、记载有核苷酸分子式组I的对比卡；
[0202] 用于PCR扩增的引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；
[0203] 核苷酸分子式组I由如下a1)-a12)共12种核苷酸分子式组成：
[0204] a1)C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0205] a2)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0206] a3)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628；
[0207] a4)C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0208] a5)T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628；
[0209] a6)C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628；
[0210] a7)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628；
[0211] a8)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628；
[0212] a9)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628；
[0213] a10)C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0214] a11)C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0215] a12)C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0216] 在a1)-a12)中，Y表示T和C；R表示A和G；
[0217] 待测柿属植物为如下12种植物中的任一种：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0218] 八、一种柿属植物的核苷酸分子式通式及应用方法
[0219] 一种柿属植物的核苷酸分子式通式，其特征在于所述核苷酸分子式通式是B4B9B39B42B162B186B196B201B225B227B274B299B321B340B344B628，所述B4、所述B9、所述B39、所述B42、所述B162、所述B186、所述B196、所述B201、所述B225、所述B227、所述B274、所述B299、所述B321、所述B340、B344和B628是DNA序列中第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、321、340、344和
628个核苷酸位点，所述B是A、G、T、C中任意一种或任意两种。
[0220] DNA序列是待测序列，待测序列是通过以待测柿属植物基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物进行PCR扩增，得到PCR产物，对PCR产物进行测序，将所述PCR产物自5’端起的第53个核苷酸记为第1位，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前52个核苷酸以及第749个(含)以后的核苷酸，得到的待测序列。
[0221] 核苷酸分子式通式的应用方法，步骤如下：
[0222] (1)以待测柿属植物的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对其进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0223] (2)将所述PCR产物测序后，所述PCR产物序列自5’端起的第53个核苷酸记为第1位，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5’末端起的前52个核苷酸以及第749个(含)以后的核苷酸，得到待测序列，读取待测序列第4、9、39、42、162、186、196、201、225、227、274、299、
321、340、344和628个核苷酸位点，列出所述待测柿属植物的DNA序列的核苷酸分子式；
[0224] (3)将所述待测柿属植物的DNA序列的核苷酸分子式，核苷酸分子式组I进行比对；
[0225] 所述核苷酸分子式组I由如下a1)-a12)共12种核苷酸分子式组成：
[0226] a1)C4T9A39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0227] a2)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0228] a3)C4C9G39C42A162C186A196T201G225C227C274G299Y321A340C344T628；
[0229] a4)C4C9G39C42R162Y186G196T201G225C227C274G299C321A340C344T628；
[0230] a5)T4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274A299C321A340C344T628；
[0231] a6)C4T9G39C42A162C186G196T201C225T227C274G299C321A340C344T628；
[0232] a7)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340T344T628；
[0233] a8)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340Y344T628；
[0234] a9)C4T9G39C42A162C186G196C201C225C227C274G299C321A340C344T628；
[0235] a10)C4T9G39C42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0236] a11)C4T9G39Y42A162C186G196T201G225T227G274G299C321A340C344T628；
[0237] a12)C4Y9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628；
[0238] 在a1)-a12)中，Y表示T和C；R表示A和G；
[0239] (4)根据步骤(3)的比对结果，按照如下方法对所述待测柿属植物进行鉴定：
[0240] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a1)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为台湾乌木；
[0241] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a2)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿x3号；
[0242] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a3)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为乌柿5号；
[0243] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a4)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为老鸦柿；
[0244] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a5)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为金枣柿；
[0245] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a6)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿164号；
[0246] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a7)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为浙江柿873号；
[0247] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a8)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子4号；
[0248] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a9)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为君迁子8号；
[0249] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a10)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-80号；
[0250] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a11)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为美洲柿20-82号；
[0251] 若所述待测柿属植物的核苷酸分子式为a12)所示的核苷酸分子式，则所述待测柿属植物为或候选为油柿20-75号。
[0252] 待测柿属植物为如下12种植物中的任一种：台湾乌木、乌柿x3号、乌柿5号、老鸦柿、金枣柿、浙江柿164号、浙江柿873号、君迁子4号、君迁子8号、美洲柿20-80号、美洲柿20-82号、油柿20-75号。
[0253] 实施例2、鉴定柿属的油柿20-76号
[0254] 为了验证实施例1建立的核苷酸分子式对于柿属植物鉴定的有效性和特异性，本发明的发明人还采集了柿属植物油柿20-76号的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了1份柿属植物的DUB序列。其中，油柿20-76号的DUB序列为序列表中序列15所示。
[0255] 将序列15这份柿属植物的DUB序列与前述12种柿属植物的序列放在一起，利用软件(如Mega软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出：油柿20-76号的核苷酸分子式，为：C4C9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628。
[0256] 实施例3、鉴定柿属的德阳柿1101号
[0257] 采集柿属植物德阳柿1101号的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了6份柿属植物的DUB序列。其中，德阳柿1101号的DUB序列为序列表中序列16所示。
[0258] 将序列16这6份柿属植物的DUB序列与前述12种柿属植物的序列放在一起，利用软件(如Mega软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出：油柿20-76号的核苷酸分子式，为：C4C9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628。
[0259] 实施例4、鉴定柿属的德阳柿1115号
[0260] 采集柿属植物德阳柿1115号的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了6份柿属植物的DUB序列。其中德阳柿1115号的DUB序列为序列表中序列17所示。
[0261] 将序列17这份柿属植物的DUB序列与前述12种柿属植物的序列放在一起，利用软件(如Mega软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出：德阳柿1115号的核苷酸分子式，为C4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344T628。
[0262] 实施例5、鉴定柿属的安溪油柿
[0263] 采集柿属植物‘安溪油柿’的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了1份柿属植物的DUB序列。‘安溪油柿’的DUB序列为序列表中序列18所示。
[0264] 将序列18这份柿属植物的DUB序列与前述12种柿属植物的序列放在一起，利用软件(如Mega软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出：‘安溪油柿’的核苷酸分子式，为：C4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321M340C344C628；其中，M表示A和C。
[0265] 实施例6、鉴定柿属的甜宝盖
[0266] 采集柿属植物‘甜宝盖’的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了1份柿属植物的DUB序列。其中‘甜宝盖’的DUB序列为序列表中序列19所示。
[0267] 将序列19这6份柿属植物的DUB序列与前述12种柿属植物的序列放在一起，利用软件(如Mega软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出：‘甜宝盖’的核苷酸分子式，为：C4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274R299T321M340C344C628；其中，M表示A和C；R表示A和G。
[0268] 实施例7、鉴定柿属的怀胎柿
[0269] 采集柿属植物‘怀胎柿’的叶片，并按照实施例1的方法，提取其基因组DNA，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子构成的引物对进行PCR扩增和测序，获得了1份柿属植物的DUB序列。其中‘怀胎柿’的DUB序列为序列表中序列20所示。
[0270] 将序列20这份柿属植物的DUB序列与前述12种柿属植物的序列放在一起，利用软件(如Mega软件)进行比对，获得DNA比对序列矩阵，进一步列出：‘怀胎柿’的核苷酸分子式，为：C4T9G39C42A162C186G196T201G225C227C274G299T321A340C344C628。
[0271] 可见，油柿20-76号、德阳柿1101号、德阳柿1115号、‘安溪油柿’、‘甜宝盖’、‘怀胎柿’这6份柿属植物的核苷酸分子式各不相同，且与实施例1中的12种柿属植物对应的12种核苷酸分子式均不相同。从而证实了本发明方法的有效性和特异性。预示着本方法在未来分类应用方面仍然具有巨大的价值和潜力。
[0272] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
