一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法

摘要

本发明公开了一种咪唑‑4‑乙酸的生物合成方法，该方法包括以下步骤：以L‑组氨酸为底物，在膜联L‑氨基酸脱氨酶的催化下，进行脱氨反应，得到含有中间产物3‑(4‑咪唑)‑2‑氧丙酸的反应液；向所述反应液中加入过氧化氢溶液，进行反应，反应结束后，得到咪唑‑4‑乙酸。本发明方法步骤简单，反应条件温和，原料来源广泛、生物催化剂易于制备、设备要求低，底物转化率高，且不需要使用有机溶剂和有毒试剂，相对于现有的化学法具有高效、成本低和环境友好的特点。

权利要求

1.一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以L-组氨酸为底物，在膜联L-氨基酸脱氨酶的催化下，进行脱氨反应，得到含有中间产物3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的反应液；

(2)向所述反应液中加入过氧化氢溶液，进行反应，反应结束后，得到咪唑-4-乙酸，所述膜联L-氨基酸脱氨酶的氨基酸序列的登陆号为BAA90864。

2.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述脱氨反应中的催化剂为表达膜联L-氨基酸脱氨酶的工程菌。

3.如权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌Rosstta(DE3)。

4.如权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，以细胞干重计，反应液中所述工程菌的密度为0.1～1.5g/L，底物浓度为10～150mM。

5.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述脱氨反应的pH值为6.0～11.0。

6.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述脱氨反应的温度为10～60℃。

7.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过氧化氢在反应液的終浓度为0.1～2％，反应时间为1～60min。

说明书

一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物化学工程领域，尤其涉及一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法。

背景技术

[0002] 咪唑-4-乙酸(imidazole-4-acetic acid,IAA)是一种重要的咪唑衍生物。它是中枢神经系统内主要抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的构象限制性类似物，具有安眠、降压和抗氧化等药理作用。与此同时，咪唑-4-乙酸也被用来合成蛋白酶抑制剂、孕尿翳受体抗结剂、以及抗癌化合物等。此外，IAA还可以通过其自身的羧基基团、咪唑基团与过渡态金属形成配位化合物。最近，IAA也被用来制备咪唑修饰的壳聚糖纳米颗粒，而这种颗粒被认为是良好的siRNA药物载体。

[0003] 目前，商业化的IAA都是通过化学合成法制备获得；例如：α-羟基-β-咪唑基-4丙酸氧化法(Knoop,Beitraege zur Chemischen Physiologie and Pathologie,1907,10,119；Pyman F.L.,A new synthesis of 4(or 5-)-β-Aminoethylglyoxaline,one of the active principles of Ergot.Journal of the Chemistry Society Transactions,
1911,99:668)和4-腈甲基咪唑水解法(Pyman F.L.,A new synthesis of 4(or 5-)-β-Aminoethylglyoxaline,one of the active principles of Ergot.Journal of the Chemistry Society Transactions,1911,99:668)等。但是，上述化学合成法的反应条件苛刻、原料成本高、产物复杂且环境污染大。

[0004] 因此，开发高效、低成本且环境友好的IAA制备方法具有重要的现实意义。

发明内容

[0005] 本发明针对上述现有技术中的不足，提供一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法，该方法反应条件温和、无需使用有机溶剂和有毒试剂且底物转化率高。

[0006] 本发明提供了一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法，包括以下步骤：

[0007] (1)以L-组氨酸为底物，在膜联L-氨基酸脱氨酶的催化下，进行脱氨反应，得到含有中间产物3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的反应液；

[0008] (2)向所述反应液中加入过氧化氢溶液，进行反应，反应结束后，得到咪唑-4-乙酸。

[0009] 上述生物合成过程如式(1)所示：

[0010]

[0011] 在于自然界中，氨基酸脱氨酶主要以分泌型形式存在，而来源于Proteus,Providencia,Morganellas等细菌的氨基酸脱氨酶则是与细胞膜进行偶联。与分泌型L-氨基酸脱氨酶相比，膜联L-氨基酸脱氨酶具有易于异源表达，不产生对细胞和酶有毒产物的特点，更适于工作催化的应用。

[0012] 作为优选，所述膜联L-氨基酸脱氨酶的氨基酸序列的登陆号为BAA90864。该膜联L-氨基酸脱氨酶来源于普通变形杆菌IAM12003(Proteus vulgaris IAM12003)，其序列登陆号为BAA90864，该特定序列的酶对于侧链集团较大的氨基酸如组氨酸、酪氨酸和异亮氨酸等具有较好的催化活力。该基因序列可以通过PCR扩增得到或者化学合成得到。

[0013] 进一步地，所述脱氨反应中的催化剂为表达膜联L-氨基酸脱氨酶的工程菌。膜联氨基酸脱氨酶必须与细胞膜偶联才能发挥其完整催化效力，如果离开细胞膜游离表达便会丧失部分功能。

[0014] 本发明通过常规的基因工程技术先合成普通变形杆菌IAM12003(Proteus vulgaris IAM12003)的L-氨基酸脱氨酶的基因序列，再将合成的基因连入表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞中，得到所述工程菌。

[0015] 进一步地，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌；其中，所述大肠杆菌可以为大肠杆菌(E.coli)BL21、大肠杆菌(E.coli)BLR、大肠杆菌(E.coli)Origami、大肠杆菌(E.coli)、BL21plysS、大肠杆菌(E.coli)NovaBlue或大肠杆菌(E.coli)Rosetta。

[0016] 更进一步地，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌Rosstta(DE3)。通过对比转化有pET28-laad的不同大肠杆菌如BL21(DE3)，Origami(DE3)等的催化活力，发现以大肠杆菌Rosstta(DE3)为宿主的重组工程菌表达活性较高。所述表达载体可以为pET-28a、pET-29、pET-30、pET-32、pRSET等。更优选，所述表达载体为pET28a。

[0017] 进一步地，以细胞干重计，反应液中所述工程菌的密度为0.1～1.5g/L，底物浓度为10～150mM；进一步地，所述底物浓度为50～100mM。

[0018] 作为优选，所述脱氨反应的pH值为6.0～11.0；更优选，所述pH值为8.0。

[0019] 作为优选，所述脱氨反应的温度为10～60℃；更优选，所述温度为30～45℃。

[0020] 进一步地，步骤(2)中，所述过氧化氢在反应液的終浓度为0.1～2％，反应时间为1～60min。更优选，所述过氧化氢在反应液的終浓度为1％，反应时间为10min。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0022] 本发明提供了一种新的咪唑-4-乙酸的生物合成方法，该方法通过膜联L-氨基酸脱氨酶和过氧化氢的连续作用，将组氨酸转化为咪唑-4-乙酸。本发明方法步骤简单，反应条件温和，原料来源广泛、生物催化剂易于制备、设备要求低，底物转化率高，且不需要使用有机溶剂和有毒试剂，相对于现有的化学法具有高效、成本低和环境友好的特点。

具体实施方式

[0023] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

[0024] 实施例1膜联L-氨基酸脱氨酶工程菌的构建

[0025] 根据普通变形杆菌IAM12003膜联L-氨基酸脱氨酶的基因序列(其序列登陆号为BAA90864)，进行全基因合成，通过BamHI和XhoI的酶切位点，将合成基因(LAAD)连入pET20(b)+中，转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET20b-laad。此外，通过Nco I和BamHI的酶切位点，将LAAD基因连入pET28a(+)中，转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选阳性克隆，得到重组质粒pET28a-laad。

[0026] 将两种重组质粒转化Rosstta(DE3)，其中Rosstta(DE3)/pET20b-laad表达的LAAD带有PelB信号肽，采用保守分泌途径(conserved secretory pathway)进行细胞周质表达，而Rosstta(DE3)/pET28a-laad采用自身带有的双精氨酸转运信号肽(twin-arginine translocation pathway)进行细胞周质表达。发现两种重组菌的催化活力相当，但Rosstta(DE3)/pET28a-laad的可以获得更高的生物量。将重组质粒pET28a-laad用常规方法转化入其它大肠杆菌表达系统如大肠杆菌Bl21(DE3)、Bl21(DE3)plysS等。其中以大肠杆菌Rosstta(DE3)为宿主的重组工程菌表达活性较高。

[0027] 实施例2利用膜联L-氨基酸脱氨酶工程菌合成咪唑-4-乙酸

[0028] 具体步骤如下：

[0029] (1)从活化的LB固体培养基上挑取工程菌(E.coli Rosstta(DE3)/pET28a-laad，单克隆菌体接入含卡那霉素(50μg·mL-1)的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，获得种子液。

[0030] (2)将种子液按体积分数2％接种量接种到含有卡那霉素(50μg·mL-1)的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD600 0.6时，加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，30℃，150r/min诱导培养6h。

[0031] (3)离心收集工程菌菌体，弃上清，用0.2mM磷酸缓冲液(pH 7.5)清洗菌体。将清洗后的工程菌加入到含50mM L-组氨酸的磷酸缓冲液(0.2mM，pH 7.5)中，溶液中菌体的密度为0.5g/L(细胞干重)。将反应液置于37℃，200r/min的条件下培养15h，待L-组氨酸完全转化，获得含有3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的溶液。

[0032] (4)向制备的3-(4-咪唑)-2-氧丙酸溶液中加入终浓度为1％的H2O2，反应10min，得到含量为22.3mM的咪唑-4-乙酸溶液，组氨酸到咪唑-4-乙酸的转化率达46％。

[0033] 实施例3利用膜联L-氨基酸脱氨酶工程菌合成咪唑-4-乙酸

[0034] 将实例2步骤(3)中反应液的L-组氨酸浓度调整为100mM，其它条件不变。37℃，200r/min的条件下培养37h，获得含有3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的溶液。向该溶液中加入1％的H2O2，反应10min，得到含量为35.6mM的咪唑-4-乙酸溶液，组氨酸到咪唑-4-乙酸的转化率达
37％。