美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用转让专利
申请号 : CN201710426033.6
文献号 : CN107177680B
文献日 : 2019-02-05
发明人 : 姜顺日 , 耿福能 , 刘彬 , 吴桃清
申请人 : 四川好医生攀西药业有限责任公司
摘要 :
本发明属于生物技术领域，具体提供了美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。本发明根据美洲大蠊mtDNA的保守序列，设计了一对美洲大蠊特异性COI引物JmF1和JmR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，经检测，该引物仅对美洲大蠊具有特异性扩增能力，扩增产物大小为452bp，灵敏度DNA浓度检出限为0.390625ng/uL。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。
权利要求 :
1.美洲大蠊特异性COI引物，其特征在于：其序列是：正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；
反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。
2.用于检测美洲大蠊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.根据权利要求1所述引物或者权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测美洲大蠊中的应用。
6.美洲大蠊的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试品前处理；
2)提取样品DNA；
3)以步骤2)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物JmF1和JmR1进行PCR扩增反应，PCR反应体系以25ul计为：10×PCR含Mg2+缓冲液2.0ul、10×dNTPs 2.0ul、5单位/ul Taq酶0.2ul、模板DNA 2.0ul、5umol/L的正，反向引物各1.0ul、无菌双蒸水补足至25ul；
4)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性
5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环。
说明书 :
美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。
背景技术
[0002] 美洲大蠊(Periplaneta Americana L.)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，是我国重要的传统药材。其入药始载于《神农本草经》，并把它列为中品，谓“味咸、寒，有毒，治：血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。《本草纲目》上记载其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”。《中国药学大辞典》、《中药大辞典》、《中国药用动物志》、《全国中草药汇编》等近、现代药学专著均记载蜚蠊有“活血、散瘀、化积、消疳、解毒、利尿、消肿”等功能。现代药理研究表明美洲大蠊具有多种药理作用，比如抗肿瘤、改善微循环、提高免疫力和促进组织修复等作用。
[0003] 对美洲大蠊品种的鉴定是入药的基础，目前对药用美洲大蠊的鉴定大多采用的是活体鉴别的方法，主要是依据其外部形态特征进行判断。但是由于昆虫类药材大多外部形态相似，组织特征无特异性，而且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出物种本身的形态和颜色，给准确的药材鉴定带来许多困难，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。
[0004] 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、高速快速等特点，再加上特异性引物可扩增得到物种特异性的条带，用此检测方法可不受形态的控制。本发明即提供了一种高效便捷的分子检测方法，利用特异性引物，根据预期DNA条带的有无来鉴定美洲大蠊，为准确、快速鉴定美洲大蠊药材提供有效手段支撑。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供美洲大蠊特异性COI引物、含有其的试剂盒及应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明根据美洲大蠊的线粒体DNA序列，设计筛选得到一对美洲大蠊特异性COI引物，其包括：
[0007] 正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；
[0008] 反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。
[0009] 本发明还提供含有引物JmF1和JmR1的用于检测美洲大蠊的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。优先地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0010] 本发明还提供含有引物JmF1和JmR1，以及含有引物JmF1和JmR1的试剂盒在检测美洲大蠊中的应用。
[0011] 本发明还提供一种美洲大蠊的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤：
[0012] 1)供试品前处理；
[0013] 2)提取样品DNA；
[0014] 3)以步骤2)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物JmF1和 JmR1进行PCR扩增反应；
[0015] 4)分析PCR产物。
[0016] PCR扩增反应体系以25ul计为：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.0ul、10× dNTPs 2.0ul、Taq酶(5单位/ul)0.2ul、模板DNA 2.0ul、正，反向引物(5umol/L) 各1.0ul、无菌双蒸水16.8ul。
[0017] PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s， 72℃延伸45s，共35个循环。
[0018] 对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为452bp的DNA条带(SEQ ID No.3)，则判定样品为美洲大蠊。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 本发明根据GenBank中公布的美洲大蠊线粒体COI基因序列(Accesion No.HM577152.1)，设计一对特异性COI引物，该引物具有物种特异性，仅对美洲大蠊具有扩增效果、扩增产物大小为452bp，灵敏度DNA浓度检出限为 0.390625ng/uL，而对其它蜚蠊目物种如澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱叶斑蠊、双纹小蠊、德国小蠊、中华拟歪尾蠊、苏里南蔗蠊、多毛真鳖蠊、中华真地鳖无扩增能力。
[0021] 本发明在美洲大蠊药材检测方面具有很高的价值，尤其当美洲大蠊药材处于粉末状态的情况下，本发明不仅节约时间而且准确性高，在实际应用中具有重要的意义。本发明利用PCR检测技术，由特异性引物扩增得到特异性单一条带，操作简单，具有高效、价廉、特异性强的特点，提高了检测的准确性。
附图说明
[0022] 图1为本发明实施例1中美洲大蠊特异性引物JmF1和JmR1在各蜚蠊物种中的检测结果；其中“M”代表DNA Marker，“-”代表阴性对照。
[0023] 图2为本发明实施例2中美洲大蠊特异性引物JmF1和JmR1的DNA浓度滴度检测结果；其中“M”代表DNA Marker，1-11代表模板DNA浓度依次2 倍稀释浓度滴度；“-”代表阴性对照。
具体实施方式
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规试验条件，如Smabrook等分子克隆实验手册(J Sambrook, David Russell Molecular Cloning A Laboratory Manual Third Edition，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0025] 实施例1美洲大蠊特异性引物JmF1和JmR1对美洲大蠊的扩增效果
[0026] 1、供试品前处理
[0027] 试验样本在基因组制备前，首先使用75％乙醇擦拭样本表面消除外源性污染，待乙醇挥发后，选取腹部肌肉组织进行充分磨碎后作为基因组提取样本。
[0028] 2、美洲大蠊基因组的制备
[0029] 采用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司))提取美洲大蠊模板DNA，用微量分光光度计检测提取的美洲大蠊模板 DNA的浓度，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1ug/ul-0.2ug/ul。
[0030] 3、合成美洲大蠊特异性COI引物序列
[0031] 美洲大蠊特异性COI引物序列序列如下：
[0032] 正向引物JmF1：5’-TGCTGAGCTCGGGCAACCA-3’；
[0033] 反向引物JmR1：5’-CTACTGATCATACGAAAAGGGGA-3’。
[0034] 4、PCR扩增
[0035] 反应体系为25ul，包括：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.0ul、10×dNTPs 2.0 ul、Taq酶(5单位/ul)0.2ul、模板DNA 2.0ul、正，反向引物(5umol/L)各 1.0ul、无菌双蒸水16.8ul。
[0036] PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s， 72℃延伸45s，共35个循环。PCR扩增仪型号为美国Applied Biosystems 9700 型。
[0037] 5、PCR产物鉴定
[0038] 取PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，以其他常见蜚蠊目物种澳洲大蠊、褐斑大蠊、菱叶斑蠊、双纹小蠊、德国小蠊、中华拟歪尾蠊、苏里南蔗蠊、多毛真鳖蠊、中华真地鳖样品(见表1)为对照进行PCR扩增，结果如图1 所示，仅有1泳道对应的美洲大蠊扩增出452bp的目的条带，说明本发明的引物特异性强。回收上述452bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID No.3所示。
[0039] 表1引物特异性检测中所涉及的蜚蠊目昆虫种类
[0040]科 亚科 属 序号 种类 拉丁学名
蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 1 美洲大蠊 Periplaneta americana L.
蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 2 黑胸大蠊 Periplaneta fuliginosa Serville 蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 3 澳洲大蠊 Periplaneta australasiae(Fabricius) 蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 4 褐斑大蠊 Periplaneta brunnea Burmeister 蜚蠊科 蜚蠊亚科 斑蠊属 5 菱叶斑蠊 Neostylopyga rhombifolia(Stoll) 姬蠊科 姬蠊亚科 小蠊属 6 双纹小蠊 Blattella bisignata(Brunner v.W.) 姬蠊科 姬蠊亚科 小蠊属 7 德国小蠊 Blattella germanica L.
姬蠊科 姬蠊亚科 拟歪尾蠊属 8 中华拟歪尾蠊 Episymploce sinensis(Walker) 硕蠊科 蔗蠊亚科 蔗蠊属 9 苏里南蔗蠊 Pycnoscelus surinamensis L. 地鳖蠊科 地鳖蠊亚科 真鳖蠊属 10 多毛真鳖蠊 Eucorydia dasytoides(Walker) 地鳖蠊科 地鳖蠊亚科 真鳖蠊属 11 中华真地鳖 Eupolyphaga sinensis(Walker) [0041] 实施例2引物JmF1和JmR1对美洲大蠊最低检出量的测定。
蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 1 美洲大蠊 Periplaneta americana L.
蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 2 黑胸大蠊 Periplaneta fuliginosa Serville 蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 3 澳洲大蠊 Periplaneta australasiae(Fabricius) 蜚蠊科 蜚蠊亚科 大蠊属 4 褐斑大蠊 Periplaneta brunnea Burmeister 蜚蠊科 蜚蠊亚科 斑蠊属 5 菱叶斑蠊 Neostylopyga rhombifolia(Stoll) 姬蠊科 姬蠊亚科 小蠊属 6 双纹小蠊 Blattella bisignata(Brunner v.W.) 姬蠊科 姬蠊亚科 小蠊属 7 德国小蠊 Blattella germanica L.
姬蠊科 姬蠊亚科 拟歪尾蠊属 8 中华拟歪尾蠊 Episymploce sinensis(Walker) 硕蠊科 蔗蠊亚科 蔗蠊属 9 苏里南蔗蠊 Pycnoscelus surinamensis L. 地鳖蠊科 地鳖蠊亚科 真鳖蠊属 10 多毛真鳖蠊 Eucorydia dasytoides(Walker) 地鳖蠊科 地鳖蠊亚科 真鳖蠊属 11 中华真地鳖 Eupolyphaga sinensis(Walker) [0041] 实施例2引物JmF1和JmR1对美洲大蠊最低检出量的测定。
[0042] 按实施例1提取美洲大蠊基因组DNA，按照实施例1中所述体系反应体系与PCR反应条件进行扩增。然后原模板溶液(DNA溶液浓度为50ng/ul)以2 倍进行递减梯度稀释，取2ul稀释后溶液作为PCR扩增的模板，直接加到PCR 反应体系中，反应体系同实施例1中的描述。直至稀释到检测不到条带为止。
[0043] 利用引物JmF1和JmR1做出最低检出量的测定，以不同稀释倍数的美洲大蠊基因组DNA为模板进行PCR扩增，如图2所示，泳道2的DNA浓度为 50ng/ul，以2倍法递减稀释的DNA模板进行扩增，结果显示泳道9为DNA浓度最低检出限，DNA浓度检出限为0.390625ng/uL(图2)。
[0044] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改和改进，均落入本发明的保护范围内。