截短型人乳头瘤病毒16型L1蛋白及其应用转让专利
申请号 : CN201710153290.7
文献号 : CN107188932B
文献日 : 2020-02-11
发明人 : 许雪梅 , 张婷 , 陈雪 , 刘洪洋 , 周艳 , 望朔
申请人 : 中国医学科学院基础医学研究所
摘要 :
本发明涉及截短型人乳头瘤病毒16型L1蛋白及其应用。具体地，本发明涉及一种截短型HPV16 L1蛋白、编码其的核苷酸、包含所述核苷酸的载体、重组Bacmid、重组杆状病毒、包含所述重组杆状病毒的昆虫细胞、由所述HPV16L1蛋白组成的病毒样颗粒、含该病毒样颗粒和疫苗佐剂的疫苗、以及其在预防HPV感染或HPV感染相关疾病中的用途。
权利要求 :
1.一种采用昆虫细胞表达体系表达的截短型HPV16 L1蛋白，其中所述截短型HPV16 L1蛋白与野生型HPV16 L1蛋白相比，N端截短了2、3、5或7个氨基酸和C端截短了29、31或33个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的截短型HPV16 L1蛋白，其中所述截短型HPV16 L1蛋白在NCBI数据库AAC09292.1序列基础上进行截短；所述截短型HPV16L1蛋白选自HPV16 L1ΔN2C29、HPV16 L1ΔN3C29、HPV16 L1ΔN5C29、HPV16 L1ΔN7C29、HPV16 L1ΔN2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1或2所述的截短型HPV16 L1蛋白。
4.一种载体，其包含如权利要求3所述的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的载体，其中所述载体是重组杆状病毒。
6.一种昆虫细胞，其包含如权利要求4或5所述的载体。
7. 一种HPV16 L1病毒样颗粒，其中所述HPV16 L1病毒样颗粒含有如权利要求1或2所述的截短型HPV16 L1蛋白。
8. 一种HPV16 L1病毒样颗粒，其中所述HPV16 L1病毒样颗粒由如权利要求1或2所述的截短型HPV16L1蛋白组成。
9. 一种疫苗，其用于预防HPV感染或HPV感染相关疾病，其中所述疫苗包含如权利要求
7或8所述的HPV16 L1病毒样颗粒以及赋形剂或佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗还包含至少一种选自其他嗜黏膜组及嗜皮肤组的HPV的病毒样颗粒。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其中所述疫苗还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14或15种选自HPV2、5、6、7、11、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、
51、52、53、56、57、58、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的L1病毒样颗粒。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂为铝佐剂、水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激剂的佐剂组合物。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
14.根据权利要求9-11中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂为MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
15. 根据权利要求1或2所述的截短型HPV16 L1蛋白、根据权利要求7或8所述的HPV16 L1病毒样颗粒、或根据权利要求9-14中任一项所述的疫苗在制备预防HPV感染及HPV感染相关疾病的药物中的应用。
说明书 :
截短型人乳头瘤病毒16型L1蛋白及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新的截短型人乳头瘤病毒16型L1蛋白、由其组成的病毒样颗粒、含该病毒样颗粒和疫苗佐剂的疫苗及其在预防HPV感染或HPV感染相关病变中的用途。
背景技术
[0002] 目前已分离鉴定了200多型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，分为嗜黏膜组和嗜皮肤组。黏膜组的HPV主要感染泌尿生殖道、肛门肛周及口咽部的黏膜及周围皮
肤，诱发各种良恶性病变。根据诱发病变的性质不同，可分为诱发恶性肿瘤的高危型(包括
HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等)、可疑高危型(HPV26,30,53,66,67,69,
70,73,82,85等)、尚未确定型(HPV34,42,43,54,71,81,83,97,102,114等)，及诱发疣状增
生等良性病变的低危型(HPV6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,
90,91,106等)。嗜皮肤组主要感染上述部位之外的皮肤组织，诱发皮肤疣状增生，并与某些
皮肤癌的发生密切相关。
肤，诱发各种良恶性病变。根据诱发病变的性质不同，可分为诱发恶性肿瘤的高危型(包括
HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68等)、可疑高危型(HPV26,30,53,66,67,69,
70,73,82,85等)、尚未确定型(HPV34,42,43,54,71,81,83,97,102,114等)，及诱发疣状增
生等良性病变的低危型(HPV6,7,11,13,32,40,42,44,61,62,72,74,81,83,84,86,87,89,
90,91,106等)。嗜皮肤组主要感染上述部位之外的皮肤组织，诱发皮肤疣状增生，并与某些
皮肤癌的发生密切相关。
[0003] 高危型HPV感染相关的恶性肿瘤目前已确定的有：宫颈癌、阴道癌、阴唇癌、阴茎癌、肛门肛周癌、口咽癌、扁桃体癌、口腔癌，其中以宫颈癌的危害最大。宫颈癌是世界范围第三高发的妇女恶性肿瘤，年发病率约52.7万，其中亚洲地区28.5万；中国的年发病数7.5
万。
万。
[0004] 研究发现病毒的主要外壳蛋白L1体外表达后可组装成L1病毒样颗粒(VLP)，L1 VLP的结构及形态与病毒颗粒的天然结构类似，具有很强的免疫原性。目前国外上市的三种
HPV预防性疫苗均为HPV L1 VLP疫苗，包括葛兰素史克的HPV16/18双价疫苗、默沙东的
HPV16/18/6/11四价疫苗及HPV16/18/58/52/31/33/45/6/11九价疫苗，人群免疫后，免疫活
性好、预防感染及感染相关疾病的保护效率高。鉴于HPV16是世界范围内的优势流行病毒
株，约53.5％的宫颈癌是由HPV16感染引起的，其余46.5％的宫颈癌由其它约22种高危型和
可疑高危型HPV感染引起。因此深入研究HPV16 L1VLP疫苗具有意义。
HPV预防性疫苗均为HPV L1 VLP疫苗，包括葛兰素史克的HPV16/18双价疫苗、默沙东的
HPV16/18/6/11四价疫苗及HPV16/18/58/52/31/33/45/6/11九价疫苗，人群免疫后，免疫活
性好、预防感染及感染相关疾病的保护效率高。鉴于HPV16是世界范围内的优势流行病毒
株，约53.5％的宫颈癌是由HPV16感染引起的，其余46.5％的宫颈癌由其它约22种高危型和
可疑高危型HPV感染引起。因此深入研究HPV16 L1VLP疫苗具有意义。
[0005] 目前多种不同的表达体系，包括昆虫细胞表达体系、酵母表达体系、大肠杆菌表达体系及植物表达体系，均可用于HPV16 L1VLP的表达生产。研究发现HPV16 L1全长蛋白
(White W,Wilson S,et al.J.Virol.1999；73(6):4882-4889.)、N端截短的突变体蛋白
(Chen XS,Casini G,et al.J.Mol.Biol.2011；307:173-182.)、C端截短的突变体(专利
CN1976718A，CN102586287，CN104418942A)、及联合N端截10个氨基酸及C端截短22个氨基酸
的突变体蛋白(Varsani A,Williamson AL,et al.Vir.Res.2006；122:154-163.)，采用特
定的技术均可以组装成HPV16L1 VLP(全长HPV16 L1蛋白序列为NCBI数据库AAC09292.1序
列，N端截短从N端第一个氨基酸M开始)。研究还发现了多种提高HPV16 L1蛋白表达水平的
方法，如C端截短31氨基酸可以使表达水平提高1.58倍，消除N端前129个核苷酸内的抑制性
DNA序列，亦可提高表达水平，联合采用密码子优化、消除潜在转录终止位点、消除潜在剪切位点、简化mRNA二级结构等方法也可以提高表达水平。
(White W,Wilson S,et al.J.Virol.1999；73(6):4882-4889.)、N端截短的突变体蛋白
(Chen XS,Casini G,et al.J.Mol.Biol.2011；307:173-182.)、C端截短的突变体(专利
CN1976718A，CN102586287，CN104418942A)、及联合N端截10个氨基酸及C端截短22个氨基酸
的突变体蛋白(Varsani A,Williamson AL,et al.Vir.Res.2006；122:154-163.)，采用特
定的技术均可以组装成HPV16L1 VLP(全长HPV16 L1蛋白序列为NCBI数据库AAC09292.1序
列，N端截短从N端第一个氨基酸M开始)。研究还发现了多种提高HPV16 L1蛋白表达水平的
方法，如C端截短31氨基酸可以使表达水平提高1.58倍，消除N端前129个核苷酸内的抑制性
DNA序列，亦可提高表达水平，联合采用密码子优化、消除潜在转录终止位点、消除潜在剪切位点、简化mRNA二级结构等方法也可以提高表达水平。
[0006] 目前有关N端截短2、3、5或7个氨基酸的HPV16 L1突变体是否能形成VLP，以及N端截短1-9个氨基酸联合C端截短的1-34个氨基酸的HPV16 L1突变体是否能形成VLP，尚未见
有报道。因此，上述方法获得的截短型突变体的表达量的分析也不明确。研究发现，HPV16
L1蛋白中即使出现1个或几个氨基酸的差异，均可显著影响其表达水平，C端截短不同长度
的L1突变体表达水平有明显差异，其中C端截短34个氨基酸的L1突变体比野生型的表达水
平显著提高。
有报道。因此，上述方法获得的截短型突变体的表达量的分析也不明确。研究发现，HPV16
L1蛋白中即使出现1个或几个氨基酸的差异，均可显著影响其表达水平，C端截短不同长度
的L1突变体表达水平有明显差异，其中C端截短34个氨基酸的L1突变体比野生型的表达水
平显著提高。
[0007] 本发明采用的C端截短的氨基酸数目与该研究不同，截短蛋白的表达水平是无法预测的；另外联合N端截短不同长度的氨基酸，获得的HPV16 L1突变体氨基酸序列组成与目
前已报道的方法差异更大，其表达水平如何及是否能组装成VLP亦是无法预测的，需依靠具
体的实验研究才能确定。因此，本发明设计的多种HPV16L1突变体在HPV16 L1VLP疫苗中的
研究价值需要实验探索后才能确定。
前已报道的方法差异更大，其表达水平如何及是否能组装成VLP亦是无法预测的，需依靠具
体的实验研究才能确定。因此，本发明设计的多种HPV16L1突变体在HPV16 L1VLP疫苗中的
研究价值需要实验探索后才能确定。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种新的截短型HPV16 L1蛋白、由其组成的病毒样颗粒及含该病毒样颗粒的疫苗，并研究该疫苗在预防HPV感染和感染相关疾病中的用途。
[0009] 本发明人经研究出人意料地发现，适当地对HPV16 L1蛋白的N端和/或C端进行截短，可提高HPV16 L1蛋白在昆虫细胞表达系统中的表达量，该截短蛋白可组装成VLP，并可
诱发针对HPV16的保护性免疫反应。本发明基于以上发现，现已完成，在本文实施例中提供
数据。
诱发针对HPV16的保护性免疫反应。本发明基于以上发现，现已完成，在本文实施例中提供
数据。
[0010] 因此，本发明第一方面涉及一种与野生型HPV16 L1蛋白(例如起始ATG同NCBI数据库AAC09292.1序列)相比N端截短了2、3、5或7个氨基酸，C端保留完整读码框编码的氨基酸
或截短了29、31、33个氨基酸的HPV16L1蛋白。优选地该截短蛋白选自HPV16 L1ΔN2、HPV16 L1ΔN3、HPV16 L1ΔN5、HPV16 L1ΔN7、HPV16 L1ΔN2C29、HPV16 L1ΔN3C29、HPV16 L1Δ
N5C29、HPV16L1ΔN7C29、HPV16 L1ΔN2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
或截短了29、31、33个氨基酸的HPV16L1蛋白。优选地该截短蛋白选自HPV16 L1ΔN2、HPV16 L1ΔN3、HPV16 L1ΔN5、HPV16 L1ΔN7、HPV16 L1ΔN2C29、HPV16 L1ΔN3C29、HPV16 L1Δ
N5C29、HPV16L1ΔN7C29、HPV16 L1ΔN2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
[0011] 具体地，本发明提供了一种截短型HPV16 L1蛋白，其中所述截短型HPV16L1蛋白与野生型HPV16 L1蛋白相比，N端截短了2、3、5或7个氨基酸；其中所述截短型HPV16 L1蛋白与野生型HPV16 L1蛋白相比，C端保留完整读码框编码的氨基酸或截短了29、31或33个氨基
酸。
酸。
[0012] 优选地，本发明所述截短型HPV16 L1蛋白在NCBI数据库AAC09292.1序列基础上进行截短；特别优选地，所述截短型HPV16 L1蛋白选自HPV16 L1ΔN5C31(SEQ ID No.1)及
HPV16 L1ΔN7C33(SEQ ID No.2)。
HPV16 L1ΔN7C33(SEQ ID No.2)。
[0013] 野生型HPV16 L1蛋白也可来自但不限于HPV16Phi1、Tha7、Alg1、Sen32、Fra25、Fra63、114K、114B、Z-1194等变异株的L1蛋白(Touze A,Mehdaoui SE,et
al.J.Clin.Micr.1998；36(7):2046-2051)，相应变异株的截短型L1蛋白为在上述截短型
HPV16 L1蛋白等同位置截短，如通过序列比较来评价。
al.J.Clin.Micr.1998；36(7):2046-2051)，相应变异株的截短型L1蛋白为在上述截短型
HPV16 L1蛋白等同位置截短，如通过序列比较来评价。
[0014] 本发明第二方面涉及编码本发明截短型HPV16 L1蛋白的多核苷酸。
[0015] 本发明第三方面涉及含有上述第二方面所述多核苷酸的载体，优选地，所述载体选自质粒、重组Bacmid和重组杆状病毒。
[0016] 本发明第四方面涉及包含上述载体的昆虫细胞。
[0017] 本发明第五方面涉及一种HPV16 L1病毒样颗粒，该病毒样颗粒含有上述第一方面所述的HPV16L1蛋白，或由上述第一方面所述的HPV16 L1蛋白组成。
[0018] 本发明第六方面涉及一种预防HPV感染或HPV感染相关病变的疫苗，该疫苗含有第五方面所述的HPV16 L1病毒样颗粒，其中HPV16 L1病毒样颗粒的含量为能诱发保护性免疫
反应的有效量。优选地，该疫苗还可包含至少一种选自其他嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的HPV
的病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。上述疫苗
通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
反应的有效量。优选地，该疫苗还可包含至少一种选自其他嗜黏膜组和/或嗜皮肤组的HPV
的病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。上述疫苗
通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
[0019] 优选地，所述疫苗含有第五方面所述的HPV16 L1病毒样颗粒以及至少1种选自HPV2、5、6、7、11、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、51、52、53、56、57、
58、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
58、59、61、66、67、68、69、70、73、74、77、81、82、83、85、91的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0020] 进一步优选地，所述疫苗含有第五方面所述的HPV16 L1病毒样颗粒以及HPV18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68及73的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0021] 进一步优选地，所述疫苗含有第五方面所述的HPV16L1病毒样颗粒以及HPV18、31、33、35、39、45、52及58的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0022] 进一步优选地，所述疫苗含有第五方面所述的HPV16L1病毒样颗粒以及HPV18、52及58的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0023] 进一步优选地，所述疫苗含有第五方面所述的HPV16 L1病毒样颗粒以及HPV18及58的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0024] 特别优选地，所述疫苗含有第五方面所述的HPV16 L1病毒样颗粒以及HPV18的L1病毒样颗粒，这些病毒样颗粒的含量分别为能诱发保护性免疫反应的有效量。
[0025] 本发明第七方面涉及一种包含第六方面所述疫苗及佐剂的可进一步提高免疫反应的新型疫苗。优选地，所使用的佐剂为包含铝佐剂、水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激
剂的佐剂组合物。
剂的佐剂组合物。
[0026] 进一步优选地，所使用的佐剂为包含氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
[0027] 进一步优选地，所使用的佐剂为包含MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
[0028] 特别地，本发明涉及的复合佐剂为实施方案中所述的聚肌苷酸-聚胞苷酸及稳定剂(PIKA)联合氢氧化铝佐剂组成的复合物，或聚肌苷酸-聚胞苷酸及稳定剂(PIKA)联合
MF59佐剂组成的复合物，两种复合佐剂与HPV VLP疫苗联合使用均可有效提高疫苗的免疫
活性。
MF59佐剂组成的复合物，两种复合佐剂与HPV VLP疫苗联合使用均可有效提高疫苗的免疫
活性。
[0029] 本发明第八方面涉及第六方面及第七方面所述疫苗在预防HPV感染或HPV感染相关疾病中的用途。
[0030] 相关术语的说明及解释
[0031] 根据本发明，术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组Bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞，在此举例但不限于：Sf9，Sf21，High Five。
[0032] 根据本发明，术语“野生型HPV16 L1蛋白”的例子包括但不限于NCBI数据库中编号为AAC09292.1的蛋白等长的全长L1蛋白。
[0033] “截短型HPV16 L1蛋白”的基因片段指的是其与野生型HPV16 L1蛋白基因相比，在其5’端和/或3’端缺失编码1个或多个氨基酸的核苷酸，其中“野生型HPV16 L1蛋白”的全长序列例如但不限于NCBI数据库中的如下序列:AAC09292.1、AIQ82817.1、AAC61736.1等。
[0034] 根据本发明，表述“ΔNX”代表“N端截短X个氨基酸的蛋白质”，是指以起始甲硫氨酸为第1位氨基酸来计数，从N末端截去X个氨基酸之后，在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸作为起始位点的蛋白质。例如“HPV16 L1ΔN5”代表N端截短了5个氨基酸的HPV16 L1蛋
白，即删除从起始甲硫氨酸开始的5个氨基酸之后，在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸
所获得的蛋白质。
白，即删除从起始甲硫氨酸开始的5个氨基酸之后，在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸
所获得的蛋白质。
[0035] 根据本发明，表述“ΔCY”代表“C端截短Y个氨基酸的蛋白质”，是指从HPV16 L1第505位氨基酸开始计数，截短Y个氨基酸的蛋白质。例如“HPV16 L1ΔC1”代表C端截短第505
位1个氨基酸所获得的蛋白质。
位1个氨基酸所获得的蛋白质。
[0036] 根据本发明，表述“ΔNXCY”代表“N端截短X个氨基酸同时C端截短Y个氨基酸的蛋白质”，是指以起始甲硫氨酸为第1位氨基酸来计数，从N末端截去X个氨基酸之后，在剩余序列的N端再补加一个甲硫氨酸作为起始位点，同时从HPV16 L1第505位氨基酸开始计数，截
短Y个氨基酸的蛋白质。例如“HPV16L1ΔN5C31”代表N端截短了5个氨基酸同时C端截短31个
氨基酸的HPV16 L1蛋白，即删除从起始甲硫氨酸开始的5个氨基酸之后，在剩余序列的N端
再补加一个甲硫氨酸，并且同时删除C端第475-505位共计31个氨基酸的蛋白质。
短Y个氨基酸的蛋白质。例如“HPV16L1ΔN5C31”代表N端截短了5个氨基酸同时C端截短31个
氨基酸的HPV16 L1蛋白，即删除从起始甲硫氨酸开始的5个氨基酸之后，在剩余序列的N端
再补加一个甲硫氨酸，并且同时删除C端第475-505位共计31个氨基酸的蛋白质。
[0037] 根据本发明，术语“赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂，举例但不限于聚山梨酯80(Tween-80)，离子强
度增强剂举例但不限于氯化钠。
度增强剂举例但不限于氯化钠。
[0038] 根据本发明，术语“佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂，包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合
物。
物。
[0039] 根据本发明，术语“乳剂”是指由水相成分、油相成分及乳化剂按适当比例混合，经乳化后形成的非均相液体分散体系。其中水相成分包括但不限于磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲系统；油相成分为可代谢脂类，包括但不限于植物油、鱼油、动物油、合成油及其他脂类成分(例如但不限于角鲨烯、生育酚)；乳化剂为适宜的表面活性剂，例如但不限于山梨
醇酐三油酸酯(Span-85)、聚山梨酯80(Tween-80)。
醇酐三油酸酯(Span-85)、聚山梨酯80(Tween-80)。
[0040] 根据本发明，术语“稳定剂”是指可与佐剂中的聚肌苷酸-聚胞苷酸结合并起到稳定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、无机盐
(例如但不限于氯化钙、氯化镁、磷酸钙)、阳离子的有机复合物(例如但不限于硬脂酸钙、葡萄糖酸钙)。
(例如但不限于氯化钙、氯化镁、磷酸钙)、阳离子的有机复合物(例如但不限于硬脂酸钙、葡萄糖酸钙)。
[0041] 根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
[0042] 根据本发明，本发明疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中截短型HPV16L1蛋白病毒样颗粒的剂量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。
附图说明
[0043] 图1显示了本发明实施例4中截短型HPV16L1在昆虫细胞中的表达鉴定。结果显示，16种截短型HPV16 L1均可在昆虫细胞中高水平表达。
[0044] 1至16分别表示HPV16 L1ΔN2、HPV16 L1ΔN3、HPV16 L1ΔN5、HPV16 L1ΔN7、HPV16 L1ΔN2C29、HPV16 L1ΔN3C29、HPV16 L1ΔN5C29、HPV16 L1ΔN7C29、HPV16 L1Δ
N2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
N2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
[0045] 图2A至图2B显示了本发明实施例6中纯化后获得的HPV16 L1ΔN5及HPV16 L1ΔN5C31突变体蛋白的动态光散射分析结果。结果显示HPV16 L1ΔN5及HPV16 L1ΔN5C31重组
蛋白形成的病毒样颗粒水化动力学直径分别为129.6nm和128nm，颗粒组装的百分比均为
100％。
蛋白形成的病毒样颗粒水化动力学直径分别为129.6nm和128nm，颗粒组装的百分比均为
100％。
[0046] 图2A表示HPV16 L1ΔN5；图2B表示HPV16 L1ΔN5C31。
[0047] 图3A至3P显示了本发明实施例7中纯化后获得的16种截短型HPV16 L1 VLP的透射电镜观察结果。视野中可见大量的直径为55nm左右的病毒样颗粒，颗粒的大小与理论值相
符，均一度好。Bar＝200nm。
符，均一度好。Bar＝200nm。
[0048] 图3A至3P分别表示HPV16 L1ΔN2、HPV16 L1ΔN3、HPV16L1ΔN5、HPV16 L1ΔN7、HPV16 L1ΔN2C29、HPV16 L1ΔN3C29、HPV16 L1ΔN5C29、HPV16 L1ΔN7C29、HPV16 L1Δ
N2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
N2C31、HPV16 L1ΔN3C31、HPV16 L1ΔN5C31、HPV16 L1ΔN7C31、HPV16 L1ΔN2C33、HPV16 L1ΔN3C33、HPV16 L1ΔN5C33和HPV16 L1ΔN7C33。
[0049] 图4显示了本发明实施例8中的HPV16 L1ΔN5及HPV16 L1ΔN5C31 VLP接种小鼠后免疫血清HPV16中和抗体滴度的分析。
[0050] 图5显示了本发明实施例9中的HPV16 L1ΔN5C31 VLP蛋白联合含PIKA的复合佐剂接种小鼠后免疫血清中和抗体滴度的分析，*：与无佐剂组相比，P<0.05；**：与无佐剂组相比，与P<0.01；***：与无佐剂组相比，与P<0.001；#：与单纯PIKA组相比，与P<0.05；###：与单纯PIKA组相比，与P<0.001；&：与单纯Alum组相比，与P<0.05；&&&：与单纯Alum组相比，与P<
0.001。
0.001。
具体实施方式
[0051] 下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面
的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。
本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界
定在所附的权利要求中。
的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。
本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界
定在所附的权利要求中。
[0052] 除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本
说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述
实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如
无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于
此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。
说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述
实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如
无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本说明书中所提到的所有公开文献均被并入于
此作为参考，以揭示并说明所述公开文献中的方法和/或材料。
[0053] 实施例1：截短型HPV16 L1基因的扩增及表达载体构建
[0054] 用做模版的全长HPV16L1基因由上海生工生物工程技术服务有限公司全基因合成(SEQ ID NO：3)，其对应的氨基酸序列为NCBI数据库中编号为AAC09292.1的序列。
[0055] 用于构建截短型HPV16L1基因的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体如下：
[0056] 16N2F：5’-GAATTCGCCGCCACCATGCTCTGGTTGCCATCCGAAGC-3’；
[0057] 16N3F：5’-GAATTCGCCGCCACCATGTGGTTGCCATCCGAAGCTAC-3’；
[0058] 16N5F：5’-GAATTCGCCGCCACCATGCCATCCGAAGCTACAGTCTATC-3’；16N7F：5’-GAATTCGCCGCCACCATGGAAGCTACAGTCTATCTCCC-3’；
[0059] 16CR：5’-TCTAGATTACAGCTTACGTTTTTTGCG-3’；
[0060] 16C29R：5’-TCTAGAATTAGGCCTTGAGACCAGCTTGCA AC-3’
[0061] 16C31R：5’-TCTAGAATTAGAGACCAGCTTGC-3’；
[0062] 16C33R：5’-TCTAGAATTAAGCTTGCAAC AGGAATTTC-3’,
[0063] 上述引物序列显示于序列表SEQ ID NO：6-13中。
[0064] 以SEQ ID NO：3为模版，使用16N2F/16CR为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2基因；使用16N3F/16CR为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3基因；使用16N5F/16CR为引物，PCR扩增HPV16 L1
ΔN5基因；使用16N7F/16CR为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN7基因；使用16N2F/16C29R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2C29基因；使用16N3F/16C29R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3C29基因；
使用16N5F/16C29R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN5C29基因；使用16N7F/16C29R为引物，PCR
扩增HPV16 L1ΔN7C29基因；使用16N2F/16C31R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2C31基因；使
用16N3F/16C31R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3C31基因；使用16N5F/16C31R为引物，PCR扩
增HPV16 L1ΔN5C31基因(SEQ ID NO：4)；使用16N7F/16C31R为引物，PCR扩增HPV16 L1Δ
N7C31基因；使用16N2F/16C33R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2C33基因；使用16N3F/16C33R
为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3C33基因；使用16N5F/16C33R为引物，PCR扩增HPV16 L1Δ
N5C33基因；使用16N7F/16C33R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN7C33基因(SEQ ID NO：5)。PCR
扩增的方法都是公知的，例如专利CN 101293918B。
ΔN5基因；使用16N7F/16CR为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN7基因；使用16N2F/16C29R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2C29基因；使用16N3F/16C29R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3C29基因；
使用16N5F/16C29R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN5C29基因；使用16N7F/16C29R为引物，PCR
扩增HPV16 L1ΔN7C29基因；使用16N2F/16C31R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2C31基因；使
用16N3F/16C31R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3C31基因；使用16N5F/16C31R为引物，PCR扩
增HPV16 L1ΔN5C31基因(SEQ ID NO：4)；使用16N7F/16C31R为引物，PCR扩增HPV16 L1Δ
N7C31基因；使用16N2F/16C33R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN2C33基因；使用16N3F/16C33R
为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN3C33基因；使用16N5F/16C33R为引物，PCR扩增HPV16 L1Δ
N5C33基因；使用16N7F/16C33R为引物，PCR扩增HPV16 L1ΔN7C33基因(SEQ ID NO：5)。PCR
扩增的方法都是公知的，例如专利CN 101293918B。
[0065] 采用EcoRI/Xba I酶切位点，分别对上述PCR扩增得到的基因进行酶切，并分别插入商业化表达载体pFastBac1(Invitrogen公司生产)中，得到包含截短型HPV16L1基因的重
组表达载体：pFastBac1-16L1ΔN2、pFastBac1-16L1ΔN3、pFastBac1-16L1ΔN5、
pFastBac1-16L1ΔN7、pFastBac1-16L1ΔN2C29、pFastBac1-16L1ΔN3C29、pFastBac1-16L1
ΔN5C29、pFastBac1-16L1ΔN7C29、pFastBac1-16L1ΔN2C31、pFastBac1-16L1ΔN3C31、
pFastBac1-16L1ΔN5C31、pFastBac1-16L1ΔN7C31、pFastBac1-16L1ΔN2C33、pFastBac1-
16L1ΔN3C33、pFastBac1-16L1ΔN5C33、pFastBac1-16L1ΔN7C33。上述酶切、连接及克隆构建的方法都是公知的，例如专利CN101293918B。
组表达载体：pFastBac1-16L1ΔN2、pFastBac1-16L1ΔN3、pFastBac1-16L1ΔN5、
pFastBac1-16L1ΔN7、pFastBac1-16L1ΔN2C29、pFastBac1-16L1ΔN3C29、pFastBac1-16L1
ΔN5C29、pFastBac1-16L1ΔN7C29、pFastBac1-16L1ΔN2C31、pFastBac1-16L1ΔN3C31、
pFastBac1-16L1ΔN5C31、pFastBac1-16L1ΔN7C31、pFastBac1-16L1ΔN2C33、pFastBac1-
16L1ΔN3C33、pFastBac1-16L1ΔN5C33、pFastBac1-16L1ΔN7C33。上述酶切、连接及克隆构建的方法都是公知的，例如专利CN101293918B。
[0066] 实施例2：截短型HPV16 L1基因的重组Bacmid及重组杆状病毒的构建体
[0067] 分别使用包含截短型HPV16L1基因的重组表达载体pFastBac1-16L1ΔN2、pFastBac1-16L1ΔN3、pFastBac1-16L1ΔN5、pFastBac1-16L1ΔN7、pFastBac1-16L1Δ
N2C29、pFastBac1-16L1ΔN3C29、pFastBac1-16L1ΔN5C29、pFastBac1-16L1ΔN7C29、
pFastBac1-16L1ΔN2C31、pFastBac1-16L1ΔN3C31、pFastBac1-16L1ΔN5C31、pFastBac1-
16L1ΔN7C31、pFastBac1-16L1ΔN2C33、pFastBac1-16L1ΔN3C33、pFastBac1-16L1Δ
N5C33、pFastBac1-16L1ΔN7C33转化大肠杆菌DH10Bac感受态，筛选获得重组Bacmid，然后
用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid的筛选及重组杆
状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利CN 101148661B。
N2C29、pFastBac1-16L1ΔN3C29、pFastBac1-16L1ΔN5C29、pFastBac1-16L1ΔN7C29、
pFastBac1-16L1ΔN2C31、pFastBac1-16L1ΔN3C31、pFastBac1-16L1ΔN5C31、pFastBac1-
16L1ΔN7C31、pFastBac1-16L1ΔN2C33、pFastBac1-16L1ΔN3C33、pFastBac1-16L1Δ
N5C33、pFastBac1-16L1ΔN7C33转化大肠杆菌DH10Bac感受态，筛选获得重组Bacmid，然后
用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid的筛选及重组杆
状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利CN 101148661B。
[0068] 实施例3：截短型HPV16 L1基因在Sf9细胞中的表达
[0069] Sf9细胞分别接种16种截短型HPV16 L1基因的重组杆状病毒，进行截短型HPV16 L1蛋白的表达，27℃培养约88h后收发酵液，3000rpm离心15min，弃上清，用PBS洗涤细胞后，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，例如专利CN 101148661B。
[0070] 实施例4：截短型HPV16 L1的表达鉴定
[0071] 取实施例3中所述表达不同截短型HPV16 L1的细胞各1×106个，重悬于200μl PBS溶液中，加入6×Loading buffer 50μl，75℃变性8分钟，分别取10μl进行SDS-PAGE电泳及
Western blot鉴定。结果如图1所示，16种截短型HPV16 L1蛋白均可在昆虫细胞中高水平表
达，其中HPV16 L1ΔN2、HPV16 L1ΔN3、HPV16 L1ΔN5、HPV16 L1ΔN7大小约55kDa，其余12种蛋白大小约50kDa。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定的方法是公开的，例如专利CN
101148661B。
Western blot鉴定。结果如图1所示，16种截短型HPV16 L1蛋白均可在昆虫细胞中高水平表
达，其中HPV16 L1ΔN2、HPV16 L1ΔN3、HPV16 L1ΔN5、HPV16 L1ΔN7大小约55kDa，其余12种蛋白大小约50kDa。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定的方法是公开的，例如专利CN
101148661B。
[0072] 实施例5：截短型HPV16 L1蛋白与野生型HPV16 L1蛋白的表达量比较
[0073] 取实施例3中所述表达截短型HPV16L1蛋白及野生型HPV16L1的细胞各1×106个，重悬于200μl PBS溶液中，采用超声破碎法(宁波新芝超声破碎仪，2#探头，100W，超声5s，间隔7s，总时间3min)破碎细胞，12000rpm高速离心10分钟。收取裂解上清，采用夹心ELISA法
检测上清中的L1含量，该方法是公知的，例如专利CN104513826A。
检测上清中的L1含量，该方法是公知的，例如专利CN104513826A。
[0074] 使用本发明人制备的HPV16 L1单克隆抗体包被酶标板，80ng/孔，4℃孵育过夜；使用5％BSA-PBST室温封闭2h，再用PBST洗板3次。用PBS将裂解上清进行连续2倍稀释，并且将
HPV16 L1 VLP标准品也进行梯度稀释，浓度从2μg/ml-0.0625μg/ml，分别加入酶标板，每孔
100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HPV16 L1兔多抗，每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μl OPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算裂解上清中
截短型HPV16 L1蛋白及野生型HPV16 L1蛋白的浓度。
HPV16 L1 VLP标准品也进行梯度稀释，浓度从2μg/ml-0.0625μg/ml，分别加入酶标板，每孔
100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HPV16 L1兔多抗，每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μl OPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算裂解上清中
截短型HPV16 L1蛋白及野生型HPV16 L1蛋白的浓度。
[0075] 结果如表1所示，本发明的截短型HPV16 L1蛋白的表达量均高于野生型HPV16 L1蛋白，且高于专利CN104418942A中的C端截短突变体HPV16 L1-498(HPV16 L1ΔC7)及HPV16
L1-483(HPV16 L1ΔC22)。
L1-483(HPV16 L1ΔC22)。
[0076] 表1HPV16L1蛋白表达量分析
[0077]
[0078] 实施例6：截短型HPV16 L1蛋白的纯化及动态光散射粒径分析
[0079] 取截短型HPV16 L1的细胞发酵液50ml，使用10ml PBS重悬细胞，加PMSF至终浓度1mg/ml，超声破碎(宁波新芝超声破碎仪，6#探头，100W，超声5s，间隔7s，总时间5min)，取破碎上清进行纯化，纯化步骤在室温进行。在裂解液中加入4％β-巯基乙醇(w/w)对VLP进行解
聚，然后使用0.22μm滤器过滤样品，依次使用DMAE阴离子交换层析(20mM Tris,180mM
NaCl,4％β-ME,pH 7.9洗脱)、TMAE阴离子交换层析(20mM Tris,180mM NaCl,4％β-ME,pH
7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mM NaH2PO4，30mM NaCl，4％β-ME，pH 6.0洗脱)纯化。纯化产物采用Planova超滤系统进行浓缩，并更换缓冲液(20mM NaH2PO4，500mM NaCl，pH 6.0)促使VLP组装。以上纯化方法均是公开的，例如专利CN101293918B、CN1976718A等。
聚，然后使用0.22μm滤器过滤样品，依次使用DMAE阴离子交换层析(20mM Tris,180mM
NaCl,4％β-ME,pH 7.9洗脱)、TMAE阴离子交换层析(20mM Tris,180mM NaCl,4％β-ME,pH
7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mM NaH2PO4，30mM NaCl，4％β-ME，pH 6.0洗脱)纯化。纯化产物采用Planova超滤系统进行浓缩，并更换缓冲液(20mM NaH2PO4，500mM NaCl，pH 6.0)促使VLP组装。以上纯化方法均是公开的，例如专利CN101293918B、CN1976718A等。
[0080] 取纯化后的截短型HPV16 L1蛋白溶液进行DLS粒径分析(Zetasizer Nano ZS 90动态光散射仪，Malvern公司)，结果如表2所示，其中HPV16 L1ΔN5及HPV16 L1ΔN5C31的
DLS分析图如图2所示。
DLS分析图如图2所示。
[0081] 表2截短型HPV16 L1蛋白DLS分析
[0082]蛋白名称 水力学直径(nm) PDI
HPV16 L1ΔN2 128.4 0.148
HPV16 L1ΔN3 127.2 0.153
HPV16 L1ΔN5 129.6 0.167
HPV16 L1ΔN7 129.1 0.151
HPV16 L1ΔN2C29 128.5 0.146
HPV16 L1ΔN3C29 129.3 0.133
HPV16 L1ΔN5C29 127.4 0.145
HPV16 L1ΔN7C29 126.9 0.138
HPV16 L1ΔN2C31 128.3 0.141
HPV16 L1ΔN3C31 127.8 0.138
HPV16 L1ΔN5C31 128 0.146
HPV16 L1ΔN7C31 128.4 0.129
HPV16 L1ΔN2C33 127.5 0.137
HPV16 L1ΔN3C33 127 0.147
HPV16 L1ΔN5C33 128.8 0.150
HPV16 L1ΔN7C33 128.5 0.138
HPV16 L1ΔN2 128.4 0.148
HPV16 L1ΔN3 127.2 0.153
HPV16 L1ΔN5 129.6 0.167
HPV16 L1ΔN7 129.1 0.151
HPV16 L1ΔN2C29 128.5 0.146
HPV16 L1ΔN3C29 129.3 0.133
HPV16 L1ΔN5C29 127.4 0.145
HPV16 L1ΔN7C29 126.9 0.138
HPV16 L1ΔN2C31 128.3 0.141
HPV16 L1ΔN3C31 127.8 0.138
HPV16 L1ΔN5C31 128 0.146
HPV16 L1ΔN7C31 128.4 0.129
HPV16 L1ΔN2C33 127.5 0.137
HPV16 L1ΔN3C33 127 0.147
HPV16 L1ΔN5C33 128.8 0.150
HPV16 L1ΔN7C33 128.5 0.138
[0083] 实施例7：截短型HPV16 L1VLP的透射电镜观察
[0084] 按实施例6所述的层析纯化方法，对截短型HPV16 L1VLP分别进行纯化，使用透析后的VLP制备铜网，并用1％醋酸铀进行染色，充分干燥后使用JEM-1400电镜(奥林巴斯)进
行观察。结果如图3所示，截短型HPV16 L1VLP直径约为55nm，大小均匀，形状规则。铜网制备及电镜观察的方法均是公开的，例如专利CN 101148661 B。
行观察。结果如图3所示，截短型HPV16 L1VLP直径约为55nm，大小均匀，形状规则。铜网制备及电镜观察的方法均是公开的，例如专利CN 101148661 B。
[0085] 实施例8：截短型HPV16 L1VLP的小鼠免疫及中和抗体滴度测定
[0086] 取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组4只，分别用PBS、截短型HPV16 L1VLP及HPV16 L1wtVLP免疫小鼠。肌肉注射，L1VLP的免疫剂量为0.1μg，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
[0087] 使用HPV16假病毒对免疫血清的HPV16中和抗体滴度进行检测，结果如图4所示，HPV16 L1ΔN5VLP(16 L1ΔN5)、HPV16 L1ΔN5C31VLP(16 L1ΔN5C31)及HPV16 L1wtVLP(16
L1wt)免疫小鼠后均可有效诱发中和抗体，且中和抗体滴度无统计学差异。本发明包括的其
他14种截短型HPV16 L1突变体VLP采用上述策略免疫小鼠后，诱发的HPV16中和抗体水平均
在400-1600之间，与HPV16 L1wtVLP相比亦无差异。假病毒制备及假病毒中和实验的方法均
是公开的，例如专利CN 104418942A。
L1wt)免疫小鼠后均可有效诱发中和抗体，且中和抗体滴度无统计学差异。本发明包括的其
他14种截短型HPV16 L1突变体VLP采用上述策略免疫小鼠后，诱发的HPV16中和抗体水平均
在400-1600之间，与HPV16 L1wtVLP相比亦无差异。假病毒制备及假病毒中和实验的方法均
是公开的，例如专利CN 104418942A。
[0088] 实施例9：HPV16 L1ΔN5C31 VLP联合佐剂免疫小鼠及中和抗体滴度测定
[0089] 取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分11组，分别用HPV16 L1ΔN5C31VLP联合聚肌苷酸-聚胞苷酸注射液(PIKA，南国药业)及氢氧化铝佐剂或MF59佐剂(4.3％角鲨烯，0.5％
Tween-80，0.5％Span-85)免疫小鼠，具体分组及免疫剂量如表3所示。皮下注射，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
Tween-80，0.5％Span-85)免疫小鼠，具体分组及免疫剂量如表3所示。皮下注射，于第0，2周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
[0090] 表3佐剂实验小鼠分组及剂量
[0091] 组名 疫苗成分及剂量无佐剂组 HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg
Alum HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg
PIKA HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，PIKA 25μg
Alum+PIKA 1μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 1μg
Alum+PIKA 10μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 10μg
Alum+PIKA 25μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 25μg
Alum+PIKA 50μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 50μg
MF59+PIKA 1μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 1μg
MF59+PIKA 10μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 10μg
MF59+PIKA 25μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 25μg
MF59+PIKA 50μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 50μg
Alum HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg
PIKA HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，PIKA 25μg
Alum+PIKA 1μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 1μg
Alum+PIKA 10μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 10μg
Alum+PIKA 25μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 25μg
Alum+PIKA 50μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，Al(OH)3 1μg，PIKA 50μg
MF59+PIKA 1μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 1μg
MF59+PIKA 10μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 10μg
MF59+PIKA 25μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 25μg
MF59+PIKA 50μg HPV16 L1ΔN5C31 VLP 0.1μg，MF59 100μl，PIKA 50μg
[0092] 使用HPV16假病毒对免疫血清的HPV16中和抗体滴度进行检测，结果如图5所示，单独使用氢氧化铝佐剂或聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂(PIKA佐剂)对HPV16 L1VLP诱发的中和抗
体水平无明显增强效果，但使用氢氧化铝或MF59联合PIKA佐剂可显著提高VLP诱发的中和
抗体水平，且与单独使用氢氧化铝或单独使用PIKA佐剂相比，中和抗体水平亦有明显提高。
表明Alum/PIKA复合佐剂或MF59/PIKA复合佐剂可显著提高疫苗的免疫活性，具有应用前景
(使用SPSS软件，One-way ANOVA分析)。
体水平无明显增强效果，但使用氢氧化铝或MF59联合PIKA佐剂可显著提高VLP诱发的中和
抗体水平，且与单独使用氢氧化铝或单独使用PIKA佐剂相比，中和抗体水平亦有明显提高。
表明Alum/PIKA复合佐剂或MF59/PIKA复合佐剂可显著提高疫苗的免疫活性，具有应用前景
(使用SPSS软件，One-way ANOVA分析)。