一种附子多糖的制备方法和新用途

摘要

本发明提供了一种附子多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：a、附子生品或炮制品粉碎，过筛，将粉碎后的粉末加入95％乙醇进行温浸3～6小时，过滤，得到滤渣；b、滤渣加纯化水在80～100℃提取1～3小时，过滤，收集滤液；c、重复b步骤1～2次，合并滤液；d、将合并的溶液在55～65℃蒸发至溶液剩余10～20％，冷却至室温；e、加入95％乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终含醇量为65～85％；f、将e步骤的溶液于4℃静置12～24小时，过滤，弃去滤液，收集滤渣；g、滤渣分别用无水乙醇、丙酮和乙醚各洗涤两次，将剩余沉淀在50～60℃真空干燥，得到附子多糖粉末。本发明还提供了该提取方法制备的附子多糖及用途。本发明附子多糖的提取纯化方法简便、提取率高、成本低廉；药效学实验证明本发明附子多糖提取物具有抗脾虚腹泻和增强免疫的作用。

权利要求

1.一种附子多糖在制备调节免疫作用的药物或制备治疗脾阳虚泄泻的药物中的用途；

其中，所述附子多糖降低血清IFN-γ和血清VIP的水平；

所述附子多糖的提取纯化方法包括以下步骤：

a、附子生品或炮制品粉碎，过筛，将粉碎后的粉末加入95％乙醇进行温浸3～6小时，过滤，得到滤渣；

b、滤渣加纯化水在80～100℃提取3小时，过滤，收集滤液；

c、重复b步骤2次，合并滤液；

d、将合并的溶液在55～65℃蒸发至溶液剩余10～20％，冷却至室温；

e、加入95％乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终含醇量为65～85％；

f、将e步骤的溶液于4℃静置12～24小时，过滤，弃去滤液，收集滤渣；

g、滤渣分别用无水乙醇、丙酮和乙醚各洗涤两次，将剩余沉淀在50～60℃真空干燥，得到附子多糖粉末；

其中，b步骤所述的水的加入量与附子的体积重量比为15︰1。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：a步骤所述附子粉碎后过20～50目筛。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：a步骤所述的95％乙醇的加入量与附子体积重量比为：10－25︰1。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：g步骤制备的附子多糖粉末复溶后置于分子截留量为3500～10000的透析袋中，流水透析12～24小时，冻干。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述附子多糖中含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖，各成分含量之比为1:2.96:6.52:157:29.63。

说明书

一种附子多糖的制备方法和新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种附子多糖及其提取纯化方法。

背景技术

[0002] 附子为毛茛科植物乌头(AconitumCarmichaeliDexb)子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳萎、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿等。《汤液本草》中提到：“附子，入手少阳三焦、命门之剂，浮中，无所不至，味辛大热，为阳中之阳”；《本草经读》也提到：“附子，味辛气温，火性迅发，无所不到，故为回阳救逆第一品药”；《本草纲目》记载：“附子性重滞，温脾逐寒”。现代常将附子用于慢性心功能不全、休克、风湿性关节炎、肠炎腹泻等疾病治疗。

[0003] 附子中主要化学成分有生物碱、多糖、苷类等，国内外对附子的研究主要集中在生物碱类成分，对附子中的多糖的研究则较少。多糖是一类天然具有多种生理活性的高分子化合物，中药多糖已成为当今药物研究和保健品开发的重点方向之一。现有研究表明，附子多糖具有较强的生理活性，且无明显毒性，有调节免疫、抗肿瘤、保护心肌细胞、降血脂等作用，其高效低毒的特性已逐渐受到人们关注。在云南楚雄等地区，每年霜降到立春之前吃附子药膳已经成为当地人一种特色美食。当地人认为吃附子药膳可以“可以暖手脚、治疗风湿、驱风寒，强筋健体，一年吃两次，一年之内都不会感冒。”

[0004] 申请号：201610526606.8，发明名称：附子多糖在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，该发明是将附子多糖单体应用在制备治疗动脉粥样硬化药物中，制备得到的药物能够有效降低动脉粥样硬化的发病率。该发明公开了粗多糖的提取方法：取干燥的附子100克粉碎成细小颗粒，用95％的乙醇进行脱脂处理，然后用1升90～100℃的双蒸馏水提取2小时并过滤。残渣继续用750ml水提取1小时。合并水提取液用旋转式蒸发器减压(50℃)浓缩并过滤。在4℃的条件下将滤液与4倍体积的95％乙醇混合，离心5000转20分钟。把沉淀物再溶于300ml水中，用60ml体积比为5:1的三氯甲烷和正丁醇的混合液进行脱蛋白处理三次。将脱蛋白后的提取物置于双蒸馏水中透析三天，再加入3倍体积95％乙醇进行醇析。用无水乙醇洗涤沉淀，然后再40℃进行真空干燥，得到粗多糖备用。申请号：201410566573.0，发明名称：一种熟附子多糖的提取方法及其新用途，该发明公开了一种熟附子多糖的提取方法，包括以下步骤：(1)预处理，得到滤液与滤渣；(2)滤渣加入超纯水继续煎煮小时后，与步骤(1)中收集的滤液合并；(3)将合并后溶液于蒸发至溶液剩余10％～20％，转移至烧杯，冷却至室温；(4)加入95％的乙醇，边加边搅拌；(5)将步骤(4)的溶液静置沉淀，抽滤，弃去滤液，收集滤渣。滤渣再分别用乙醇和丙酮各洗涤一次，将剩余滤渣在烘干，得到熟附子多糖粉末。该专利采用熟附子加水煎煮提取，有效成分和其它物质提取较多。

[0005] 目前，附子温中补阳的物质基础目前还有待研究，还未有将附子多糖与附子补火助阳功效相关联的研究。

发明内容

[0006] 本发明的技术方案是提供了一种附子多糖。本发明的另一方案是提供了该该附子多糖的制备方法和用途。

[0007] 本发明提供了一种附子多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：

[0008] a、附子生品或炮制品粉碎，过筛，将粉碎后的粉末加入95％乙醇进行温浸3～6小时，过滤，得到滤渣；

[0009] b、滤渣加纯化水在80～100℃提取1～3小时，过滤，收集滤液；

[0010] c、重复b步骤1～2次，合并滤液；

[0011] d、将合并的溶液在55～65℃蒸发至溶液剩余10～20％，冷却至室温；

[0012] e、加入95％乙醇，边加边搅拌，直至溶液中最终含醇量为65～85％；

[0013] f、将e步骤的溶液于4℃静置12～24小时，过滤，弃去滤液，收集滤渣；

[0014] g、滤渣分别用无水乙醇、丙酮和乙醚各洗涤两次，将剩余沉淀在50～60℃真空干燥，得到附子多糖粉末。

[0015] 其中，a步骤所述的95％乙醇的加入量与附子重量体积比为：10－25︰1。

[0016] 其中，b步骤所述的水的加入量与附子的重量体积比为：10－25︰1。进一步优选地，b步骤所述的水的加入量与附子的重量体积比为：15︰1。

[0017] 其中，g步骤制备的附子多糖粉末复溶后置于分子截留量为3500～10000的透析袋中，流水透析12～24小时，冻干。

[0018] 本发明还提供了上述提取纯化方法制备得到的附子多糖。

[0019] 其中，多糖中含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖几种单糖组成，各成分含量之比为1:2.96:6.52:157:29.63。

[0020] 本发明还提供了所述的附子多糖在制备调节免疫作用的药物中的用途。

[0021] 本发明还提供了所述的附子多糖在制备治疗脾阳虚泄泻的药物中的用途。

[0022] 本发明附子多糖提取工艺中原料可为附子生品，也可以为炮制品，制备工艺中采用温浸提取，减少其他物质的浸出；提取纯化方法简便、提取率高、成本低廉；药效学实验，证明本发明附子多糖提取物具有抗脾虚腹泻和增强免疫的作用。

[0023] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0024] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0025] 图1 7种单糖HPLC分离图(其中，1～8.PMP、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖)

[0026] 图2附子多糖水解样品衍生物的HPLC分离图

[0027] 图3血清IFN-γ

[0028] 图4血清VIP

具体实施方式

[0029] 实施例1本发明附子多糖的提取纯化方法

[0030] (1)去脂将中药附子生附片分选除杂，用机械粉碎机粉碎过20目筛，取100g，加入1000ml95％乙醇，温度条件为80℃，提取3h，过滤，得滤渣自然挥干乙醇。

[0031] (2)提取将去脂后的滤渣加入纯化水1500ml，温度条件为90℃，提取2次，每次2小时(固料比1:15)，用四层纱布过滤，合并2次滤液。

[0032] (3)浓缩、醇沉滤液减压浓缩至剩余溶液10％，转移至烧杯，冷却至室温，加入95％乙醇，使乙醇最终浓度达到65％，于4℃冰箱静置20小时，使多糖沉淀完全，过滤，得附子粗多糖。

[0033] (5)精制将得到的附子多糖沉淀先后用无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤各两次，采用分子截留量为5000的透析袋透析24小时。

[0034] (6)干燥将精制的多糖移至于50℃真空干燥箱。

[0035] (7)将干燥后的附子多糖粉碎，得白色粉末状附子多糖5.86g，装入密闭容器防潮保存，备用。

[0036] 实施例2本发明附子多糖的提取纯化方法

[0037] (2)去脂将中药附子黑顺片分选除杂，用机械粉碎机粉碎过20目筛，取100g，加入1500ml95％乙醇，温度条件为80℃，提取3h，过滤，得滤渣自然挥干乙醇。

[0038] (2)提取将去脂后的滤渣加入纯化水1500ml，温度条件为90℃，提取2次，每次1小时(固料比1:15)，用四层纱布过滤，合并2次滤液。

[0039] (3)浓缩、醇沉滤液减压浓缩至剩余溶液10％，转移至烧杯，冷却至室温，加入95％乙醇，使乙醇最终浓度达到75％，于4℃冰箱静置20小时，使多糖沉淀完全，过滤，得附子粗多糖。

[0040] (5)精制将得到的附子多糖沉淀先后用无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤各两次，采用分子截留量为5000的透析袋透析12小时。

[0041] (6)干燥将精制的多糖移至于50℃真空干燥箱。

[0042] (7)将干燥后的附子多糖粉碎，得白色粉末状附子多糖6.94g，装入密闭容器防潮保存，备用。

[0043] 实施例3本发明附子多糖的提取纯化方法

[0044] (1)去脂将中药附子白附片分选除杂，用机械粉碎机粉碎过30目筛，取100g，加入1800ml95％乙醇，温度条件为80℃，提取5小时，过滤，得滤渣自然挥干乙醇。

[0045] (2)提取将去脂后的滤渣加入纯化水2500ml，温度条件为90℃，提取2次，每次2小时(固料比1:25)，用四层纱布过滤，合并2次滤液。

[0046] (3)浓缩、醇沉滤液减压浓缩至剩余溶液15％，转移至烧杯，冷却至室温，加入95％乙醇，使乙醇最终浓度达到80％，于4℃冰箱静置22小时，使多糖沉淀完全，过滤，得附子粗多糖。

[0047] (5)精制将得到的附子多糖沉淀先后用无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤各两次，，采用分子截留量为3500的透析袋透析24小时。

[0048] (6)干燥将精制的多糖移至于55℃真空干燥箱。

[0049] (7)将干燥后的附子多糖粉碎，得白色粉末状附子多糖8.55g，装入密闭容器防潮保存，备用。

[0050] 实施例4本发明附子多糖的提取纯化方法

[0051] (1)去脂将中药附子淡附片分选除杂，用机械粉碎机粉碎过50目筛，取100g，加入2000ml95％乙醇，温度条件为80℃，提取6小时，过滤，得滤渣自然挥干乙醇。

[0052] (2)提取将去脂后的滤渣加入纯化水1000ml，温度条件为90℃，提取3次，每次2小时(固料比1:10)，用四层纱布过滤，合并3次滤液。

[0053] (3)浓缩、醇沉滤液减压浓缩至剩余溶液20％，转移至烧杯，冷却至室温，加入95％乙醇，使乙醇最终浓度达到85％，于4℃冰箱静置24小时，使多糖沉淀完全，过滤，得附子粗多糖沉淀。

[0054] (4)精制将得到的附子多糖沉淀先后用无水乙醇、丙酮、乙醚充分洗涤各两次，采用分子截留量为3500的透析袋透析48小时。

[0055] (5)干燥将精制的多糖移至于60℃真空干燥箱。

[0056] (6)将干燥后的附子多糖粉碎，得白色粉末状附子多糖7.26g，装入密闭容器防潮保存，备用。

[0057] 实施例5本发明附子多糖的含量测定

[0058] 多糖检测方法：首先进行硫酸蒽酮溶液的制备，精密称取蒽酮0.1g，加80％硫酸溶液100ml使溶解，摇匀(棕色瓶保存)。然后进行标准品溶液的制备，精密称取无水葡萄糖10mg加蒸馏水定容至100ml，摇匀，得0.1mg/ml葡萄糖标准品溶液。分别精密称取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2于10ml容量瓶中，得到2、4、6、8、10、12mg/L的系列标准品溶液。进行含量测定，分别取系列标准品溶液、空白溶液(以蒸馏水作为空白溶液)2ml，于具塞试管中，加入4ml硫酸蒽酮溶液，摇匀，沸水浴15分钟，取出后迅速冷却。在505nm波长下进行测定。以葡萄糖浓度为横坐标(x//mg/ml)、吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，吸光度A对浓度C回归方程得：Y＝5.75x-0.0486，R2＝0.992。

[0059] 精密称取附子多糖10mg，用蒸馏水定容至50ml，超声溶解。进行样品含量测定，取2ml于具塞试管中，加入4ml硫酸蒽酮溶液，摇匀，沸水浴15分钟，取出后迅速冷却，根据上述回归方程计算多糖浓度。

[0060] 提取方法：称取附子炮制品50g设定9个实验组进行提取，提取1、2、3次。提取时间分别为1、2、3h，料液比分别为1：10、1：15、1：25。

[0061] 表1采用不同提取条件所得多糖提取率结果比较

[0062]

[0063] 实验结果：根据正交实验结果分析可知，附子多糖的最佳提取工艺为：提取次数3次、提取时间2h、料液比为1:15；采用其他提取条件均不能得到满意的提取率。

[0064] 实施例6柱前衍生化高效液相色谱法测定本发明附子多糖单糖组成和含量[0065] 1.标准单糖曲线的衍生化及标准曲线的绘制

[0066] 分别配制浓度均为4mmol/L的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖标准溶液，配制成不同浓度的单糖混合标准品。分别取50μl的单糖标准液及不同浓度梯度的混合标准溶液，各加50μl0.6mol/L的NaOH溶液，置于5ml的具塞试管中，旋涡混匀；再加100μl0.5mol/L的PMP(0.4355g/5ml)甲醇溶液，旋涡混匀，在70℃的烘箱中避光反应100min，取出避光放置10min冷却至室温，加100μl 0.3mol/L的HCl溶液中和，加水至2ml，再加等体积氯仿，旋涡混匀，静置，弃去氯仿相，萃取3次。将水相用0.22μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析。

[0067] 2.样品水解及衍生化

[0068] 吸取100μl质量分数为5mg/ml的附子多糖样品溶液于5ml安瓿瓶中，加入100ul浓度为4mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液，充N2封管，在110℃的烘箱中水解4h；冷却后将水解液转移至5ml的离心管中，并用100μl甲醇冲洗转移残余水解液，加200μl甲醇后用N2吹干3次，去除TFA；加入50μl超纯水溶解残渣，得水解样品。按上述方法衍生、中和、萃取，0.22μm微孔滤膜过滤后，超声脱气，供HPLC分析。

[0069] 3.HPLC分析条件

[0070] Agilent HC-C18色谱柱(250mmx4.6mm,5μl)；流动相：A液：0.1mol/L的pH6.7磷酸钾盐缓冲液，B液：乙腈，梯度洗脱0-25min，A-B体积比83.2:16.8，25-36min，A-B体积比80：20；柱温：30℃；检测波长：250nm；流速：1ml/min；进样体积：10μl。

[0071] 4.附子多糖单糖组成的HPLC分析结果

[0072] 附子多糖中主要含甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖几种单糖组成，各成分含量之比为1:2.96:6.52:157:29.63。(见图1、图2)

[0073] 以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。

[0074] 试验例1本发明附子多糖对脾阳虚大鼠的药理作用

[0075] 为了研究本发明附子多糖调节免疫作用，将附子多糖(由实施例1制备)按100、200mg/kg剂量给药。

[0076] 阳性对照药物为思密达。选择40只雄鼠，利用1g/ml大黄水煎液灌胃造大鼠脾阳虚模型，连续造模30天后，连续给药附子多糖高、低剂量3周，股动脉取血，测定其血清IFN-γ、血清VIP指标。结果见图3、4：

[0077] 血清IFN-γ是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。血清VIP是由含170个氨基酸的前血管活性肠肽原经酶解而成的二十八肽的一种神经递质，是ENS中的一种主要的抑制性神经递质。VIP在神经元和免疫细胞损伤后或炎症后，发挥强大的体内免疫调节行为。血清IFN-γ和血清VIP可以作为附子多糖对脾阳虚作用的检测指标。

[0078] 由图3、4可知附子多糖高、低剂量组与模型组具有显著性差异；相比模型组降低血清IFN-γ、血清VIP水平，说明附子多糖具有调节免疫的作用。